環(huán)d-脯氨酸d-苯丙氨酸的一種微生物生產(chǎn)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種環(huán)二肽生產(chǎn)的微生物制藥技術(shù)；次藥物中文名:環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸，產(chǎn)品性狀:油，產(chǎn)品類型:生物堿，
英文名稱:Cyclo (D-Phe-D-Pro) ；Pyrrolo [1, 2-a]pyrazine-l, 4-d1ne, hexahydro-3-(phenylmethyl) -, (3R, 8aR)-
分子式:C14H16N202;分子量:244.289。
【背景技術(shù)】
[0002]目前我國批準(zhǔn)使用于食品中的微生物防腐劑只有乳酸鏈球菌素(Nisin)和納他霉素(Natamycin)，雖效果較好，但應(yīng)用范圍較為有限；因此還遠(yuǎn)不能滿足快速發(fā)展的食品工業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮加工技術(shù)的要求；截至2014年3月7日CAMP網(wǎng)站收錄的抗菌肽已達(dá)5040種，申請(qǐng)專利的達(dá)1716種，僅僅美國應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)及食品衛(wèi)生領(lǐng)域的商品化抗菌肽已達(dá)到十幾種，而我國卻還沒有相應(yīng)的開發(fā)計(jì)劃；此外，還有一些生物來源的次級(jí)代謝產(chǎn)物顯示出良好的抑菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，如生物堿、大環(huán)內(nèi)酯類、異黃酮類、醌類及環(huán)肽等；由于天然防腐劑分子量小，種類多，且抗菌活性高、抗菌譜廣、對(duì)人無毒副作用等特點(diǎn)，同時(shí)具有保健作用等合成防腐劑無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，所以受到人們的廣泛關(guān)注，也成為新型抗生素及防腐劑的重要發(fā)展方向；
我們以西北干旱生境土壤為樣品，成功從一株產(chǎn)堿桿菌(兒)分離到一種高活性廣譜抗菌成分，環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸(Cycl0(D)-Pr0-(D)-Phe)，屬于環(huán)二肽(Cyclic dipeptides)，又稱 2，5_ 二酮呢嘆類化合物(Diketopiperazines, DKPs),基本結(jié)構(gòu)是由2個(gè)氨基酸縮合而成，因其骨架具有穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，且有2個(gè)氫鍵給體和2個(gè)氫鍵受體，使得DKPs在藥物化學(xué)中成為一個(gè)重要的藥效團(tuán)；它普遍存在于動(dòng)植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物中；目前發(fā)現(xiàn)許多環(huán)二肽，不僅具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑藻及抗污、抗氧化、降血糖等生理活性，還可作為植物生長調(diào)節(jié)劑[13]和免疫抑制劑；環(huán)二肽已被證實(shí)的生理功效還包括:抑制毒素的作用，如cycloOlis-Pro) (cHP),cyclo(L-Phe-L-Pro) (cFP) ; cFP可抑制癌細(xì)胞的生長；京都啡呔(一種鴉片類環(huán)二肽)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥中的鎮(zhèn)痛作用；cHP和cFP組合對(duì)抗萬古霉素的糞腸球菌具有較強(qiáng)的抑制作用；環(huán)二肽作為肽類化合物中最具有特點(diǎn)的一類化合物，其生物活性方面具有巨大的發(fā)掘和開發(fā)潛力；因?yàn)樗幸韵聝?yōu)點(diǎn):1)抗菌譜極廣泛，尤其是對(duì)真菌及耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，且MIR很小，抑菌作用顯著；2)分子簡單，易于人工合成或微生物發(fā)酵生產(chǎn)；3)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能耐各種極端條件如高溫、高壓、紫外線，這就為生產(chǎn)保存及加工條件下的不失活提高了極佳保證；4)不產(chǎn)生免疫原性及耐藥性，且種類豐富，有保健作用；所以，環(huán)二肽具備成為新型抗生素，防腐劑的優(yōu)良品質(zhì)，值得深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，其特征是它包括以下步驟: (1)發(fā)酵培養(yǎng):將產(chǎn)堿桿菌iAlcaligenessp.A_2.)無菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩(150轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)5天；發(fā)酵液在4500r/min離心15min后取上清液備用；
(2)環(huán)二肽粗提:將大孔吸附樹脂X-5填裝入層析柱，取上述發(fā)酵上清液均勻滴加在樹脂層上面，待其完全沉入樹脂面后，靜態(tài)吸附lh，用95%乙醇水溶液作為洗脫液，以lmL/min的流速洗滌樹脂柱，可以根據(jù)吸附柱的規(guī)格相應(yīng)擴(kuò)大流速，收集洗脫液；
(3)環(huán)二肽純化:通過HPLC，即高效液相制備色譜分離純化上述洗脫液，流動(dòng)相為20-100%甲醇MeOH，流速lml/min，溫度20-25度，出峰時(shí)間5.477min，在214納米處5.477分鐘時(shí)出現(xiàn)的吸收峰收集該物質(zhì)；
(4)冷凍干燥:將上述環(huán)二肽純品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀38攝氏度濃縮30-60min，用液氮速凍，經(jīng)冷凍干燥機(jī)-40度，3天干燥后即為環(huán)二肽結(jié)晶粉末，純度可達(dá)98%，可常溫保存；
本發(fā)明的有益效果
(1)工藝簡單，成本低廉，適于工業(yè)化推廣；
(2 )通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生環(huán)二肽，可以開發(fā)生物防腐劑、農(nóng)藥等新有機(jī)環(huán)保產(chǎn)品。
【附圖說明】
[0004]圖1:制備程序
【具體實(shí)施方式】
[0005]下面的實(shí)施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明實(shí)施例1
將產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.A_2.)接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37°C搖床振蕩培養(yǎng)(150r/min) 5d ;發(fā)酵液在4500r/min離心15min后，取上清液，備用；樹脂X_5經(jīng)預(yù)處理(Xu，Chen and Sun, 2011)，乙醇浸泡24h —用乙醇洗滌，至流出液與水1:5混合后，不渾濁一再用水洗至無乙醇味一5%HC1通過樹脂柱，浸泡2-4h —水洗至中性一2%Na0H通過樹脂柱，浸泡2-4h—水洗至中性，備用；經(jīng)處理后的樹脂填裝入層析柱(內(nèi)徑26mmX長度30cm)，取發(fā)酵上清液20mL均勻滴加在樹脂層上面，待其完全沉入樹脂面后，靜態(tài)吸附lh，用95%乙醇以lmL/min的流速洗滌樹脂柱，分段收集洗脫液；通過HPLC制備色譜分離純化上述洗脫液的條件為:流動(dòng)相為20-100%甲醇MeOH，流速lml/min，溫度20-25度，出峰時(shí)間5.477min，在214納米處并于5.477后收集該物質(zhì)即為環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸Cycl0(D-Phe-L-Pr0)，冷凍干燥后結(jié)晶；
實(shí)施例2
將產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.A_2.)接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37°C搖床振蕩培養(yǎng)(150r/min) 5d ;發(fā)酵液在4500r/min離心15min后，取上清液，備用；大孔樹脂X_5經(jīng)預(yù)處理(同上)后置于玻璃樹脂柱(適合大規(guī)格工業(yè)生產(chǎn)型號(hào))中，取發(fā)酵上清液20L-1000L均勻流過樹脂層，靜態(tài)吸附lh，用95%乙醇以lL/min的流速洗滌樹脂柱，將收集到的洗脫液通過HPLC制備色譜，流動(dòng)相77%乙醇/水溶液(v/v)，流速lmL/min，溫度20-25度，出峰時(shí)間2.932min，在214納米處并于2.932分鐘的波峰收集該物質(zhì)即為Cyclo (D-Phe-L-Pro)；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基配制ο I Λ (? r\ry tU7\、疒、Χ? r\ry-r πΗτιττ.r\ ? τ.I TTrT L ^ττττ/λ r\ r\ χ r\Zjjτ r\r->K τ i Q/-> ^ t1.A I i Q r\ x κΜΙ I~I 'a=T
【主權(quán)項(xiàng)】
1.環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸的一種微生物生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于步驟如下: 發(fā)酵培養(yǎng):將產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.A_2.)無菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩(150轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)5天；發(fā)酵液在4500r/min離心15min后取上清液備用; 環(huán)二肽粗提:將大孔吸附樹脂X-5填裝入層析柱，取上述發(fā)酵上清液均勻滴加在樹脂層上面，待其完全沉入樹脂面后，靜態(tài)吸附lh，用95%乙醇水溶液作為洗脫液，以lmL/min的流速洗滌樹脂柱，可以根據(jù)吸附柱的規(guī)格相應(yīng)擴(kuò)大流速，收集洗脫液； 環(huán)二肽純化:通過HPLC，即高效液相制備色譜分離純化上述洗脫液，流動(dòng)相為20-100%甲醇MeOH，流速lml/min,溫度20-25度，出峰時(shí)間5.477min，在214納米處5.477分鐘時(shí)出現(xiàn)的吸收峰收集該物質(zhì)； 冷凍干燥:將上述環(huán)二肽純品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀38攝氏度濃縮30-60min，用液氮速凍，經(jīng)冷凍干燥機(jī)-40度，3天干燥后即為環(huán)二肽結(jié)晶粉末，純度可達(dá)98%，可常溫保存。
【專利摘要】本發(fā)明公開了環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸的一種微生物生產(chǎn)技術(shù)，包括發(fā)酵培養(yǎng)、環(huán)二肽粗提、環(huán)二肽純化、冷凍干燥。本發(fā)明旨在通過微生物發(fā)酵技術(shù)高效廉價(jià)發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)二肽：D-脯氨酸D-苯丙氨酸Cyclo(D-Phe-D-Pro)，可用于醫(yī)藥、生物防腐劑等新有機(jī)環(huán)保產(chǎn)品。
【IPC分類】C07D487/04, C12R1/05, C12P17/12
【公開號(hào)】CN105331652
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510858967
【發(fā)明人】艾對(duì)元, 張衛(wèi)兵, 贠建民
【申請(qǐng)人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年12月1日