專利名稱：鑒別藍藻的核酸分子探針和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測環(huán)境(水域)微型生物的技術領域，具體地說，是涉及一種用于鑒別藍藻的核苷酸序列以及核酸分子探針和用其鑒別藍藻的方法。
藍藻(Cyanophyta)，又稱藍細菌，是引起全球淡水水體有害有毒水華及海洋有害赤潮的主要類群之一。有毒種類所產(chǎn)生毒素不僅可造成神經(jīng)毒害，而且可誘發(fā)肝癌。藍藻毒素引起的野生動物、家畜中毒甚至死亡的事例世界各地已有許多報導。因此，對這些有毒種類及其分布進行迅速準確的鑒定已成為目前環(huán)境微生物學研究的熱點之一。
屬藍藻的種類繁多，迄今為止，發(fā)現(xiàn)數(shù)十種是引發(fā)淡水水華的常見種類，且產(chǎn)生毒素。有毒藍藻是魚業(yè)進出口的必檢項目。然而，藍藻許多種類，其形態(tài)具有多變性，某些種類還含有只有真核細胞才具有的色素，表現(xiàn)出真核藻的特性。造成了鑒定上的混亂，加上其個體微細，分離培養(yǎng)較為困難，傳統(tǒng)分類鑒別難度較大。
迄今為止，國際上有關藍藻水華控制方法等方面的研究和專利已有不少報導，但是尚未見有關于藍藻基因鑒別的標準和技術的研究報導。近年來，隨著海洋及內(nèi)陸水體富營養(yǎng)化的加劇，藍藻水華分布范圍及出現(xiàn)頻率明顯增加，對藍藻的研究已引起人們的高度重視。鑒于藍藻分類鑒定中存在的問題，采用新方法新技術快速識別藍藻資源具有重要的現(xiàn)實意義。
本發(fā)明的目的是提供藍藻基因鑒別的標準和技術，它可以從遺傳本質(zhì)上客觀準確地鑒別藍藻類群。具體包括1.提供用于藍藻鑒定的基因片段；2.提供來源于上述基因片段的藍藻專一性核酸分子探針；3.提供利用上述核酸分子探針鑒別藍藻的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在對藍藻不同種類的研究中發(fā)現(xiàn)，藍藻的rDNA間隔區(qū)具有與其它生物完全不同的一段20個寡核苷酸長的核苷酸序列，該段核苷酸序列在藍藻中具高度保守性，可作為藍藻的特征性核苷酸序列，用于鑒別藍藻類群。根據(jù)該特征性核苷酸序列，可以制備出藍藻rDNA間隔區(qū)的專一性核酸分子探針，建立快速、準確鑒別藍藻的分子生物學方法。
本發(fā)明提供的用于鑒別藍藻的核苷酸序列來源于銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa，藍藻中的一種，為97年誘發(fā)我國廈門西海域的赤潮藻之一)的rDNA間隔區(qū)(即核糖體rRNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列，該序列的位置及結構特征如

圖1和序列表1所示。
該序列(SEQ ID NO1)可通過如實施例1所述的方法得到；或者按已知的該序列核苷酸組成與排列，在商業(yè)化的DNA自動合成儀上按常規(guī)方法合成而得到。
本發(fā)明的藍藻專一性核酸分子探針是以上述銅綠微囊藻rDNA間隔區(qū)核苷酸序列為基礎，并通過Internet(因特網(wǎng))與國際分子生物學數(shù)據(jù)庫中的其它藍藻種類比較設計出來的。該分子探針為rDNA間隔區(qū)2(tRNA基因與23S rRNA基因之間)中的一段20個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是上述寡核苷酸序列再經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過總核苷酸量的10％的序列。
本發(fā)明的上述藍藻專一性核酸分子探針為序列表2所示的序列(簡稱Cyano 20)或者為該序列的互補序列。
本發(fā)明的上述藍藻專一性核酸分子探針，可按照預先根據(jù)銅綠微囊藻rDNA間隔區(qū)序列設計好的序列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商業(yè)化的DNA自動合成儀進行合成)。該探針可以通過放射性同位素、酶、生物素、熒光劑或化學熒光素結合進行標記。
本發(fā)明上述的藍藻專一性核酸分子探針，具有極高的藍藻專一性，能與藍藻種類專一性反應，但不與其它真核藻或原核細菌的DNA發(fā)生反應。所以，利用該核酸分子探針，通過PCR方法或核酸分子雜交法可以快速、準確地鑒別藍藻(包括誘發(fā)淡水水華或海洋赤潮的種類，或者具有真核藻色素的海洋超微型種類等)。
本發(fā)明所提供的藍藻鑒別方法，可采用核酸分子雜交法或PCR方法，分述如下核酸分子雜交法采用前面所述的本發(fā)明的核酸分子探針，以通用的核酸分子雜交方法(例如Southern雜交或點雜交)對藍藻進行鑒定。具體步驟和過程(包括探針的標記和待測樣品的預處理)，按常規(guī)的分子生物學方法進行。
該方法可以對淡水或海水自然生長的藍藻樣品直接檢測，也可以先將樣品中的藍藻DNA提取擴增，再加以檢驗。
PCR方法以前面所述的本發(fā)明的核酸分子探針為一個PCR引物，與另一個原核生物通用PCR引物(例如16N65’GAAGTCGTAACAAGGTAGCCG3’或23R5’NNGGGTTTCCCCATTCGGAAA3’)或某一藍藻種類的專一性引物配對，進行PCR反應。具體步驟和過程按常規(guī)PCR方法的操作過程進行。
采用該PCR方法可快速、準確地檢測鑒別藍藻，而且樣品用量少。
由于本發(fā)明所提供的藍藻核酸分子探針為藍藻的專一性序列，因此在樣品未知的前提下，可以通過檢測樣品中是否存在該段寡核苷酸序列，快速方便檢測樣品，如可準確快速檢測發(fā)生水華或赤潮時魚、蝦、貝類體內(nèi)是否含有有毒藍藻，并且通過探針的標記，定量檢測藍藻的個體數(shù)，起到預防預報的作用，避免人類中毒事件發(fā)生。
圖1是核糖體rRNA基因結構示意圖，其中ISR2(間隔區(qū)2)為本發(fā)明所涉及的核苷酸序列(包括藍藻專一性探針)存在的區(qū)域。
圖2是銅綠微囊藻rDNA間隔區(qū)多核苷酸序列結構示意圖，其中帶上劃線的黑體部分(306-325bp)為本發(fā)明的藍藻專一性寡核苷酸分子探針Cyano20。
以下通過實施例對本發(fā)明做進一步說明實施例1銅綠微囊藻rDNA間隔區(qū)多核苷酸序列的制備用牙簽或槍尖挑取少量銅綠微囊藻藻體，放入含100微升提取緩沖液(1％SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-Hcl pH7.6)的小指管中，搖勻，65℃保溫0.5-2小時，用DPS純化試劑[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mM Tris-Hcl，40uM EDTA，60％乙醇，80mMKAC)]純化后，涼干，加入50-100微升PCR反應液(100微升PCR反應液成份10X Taq DNA聚合酶緩沖液10微升；2mMdNTP溶液10微升；引物為M165’GGGGATGCCTAAGGCAGGGCT3’0.5微升；引物為M235’CCACGTCCTTCTTCGCCTCTG3’0.5微克；Taq DNA聚合酶2.5單位，加無菌水定容至100微升)，加50微升礦物油，放于PCR儀上，按下列程序進行PCR反應94℃ 5min，94℃、55℃和72℃各1min，30個循環(huán)，然后是72℃ 5min。反應完成后，除去礦物油，用PCR純化試劑盒(QIAGEN，Germany)純化PCR產(chǎn)物，得到所需的核苷酸序列。純化后的PCR產(chǎn)物于商業(yè)化的DNA自動測序儀上測定，得到如序列表1的核苷酸組成與排列。
實施例2 藍藻專一性核酸分子探針的制備在獲得微囊藻rDNA間隔區(qū)核苷酸序列的基礎上，將所得序列與其它藍藻或真核藻及原核細菌同源序列進行排列比較，得出Cyano20(如圖2所示的306-325bp)或其互補序列的核苷酸組成和排列是用于藍藻類群鑒別的良好寡核苷酸片段。根據(jù)Cyano20或其互補序列的核苷酸組成的排列，在商業(yè)化的DNA自動合成儀上進行化學合成，得到如序列表2所示的核苷酸序列或其互補序列。
實施例3藍藻的鑒別(常規(guī)PCR方法)(1)樣品預處理用牙簽或槍尖挑取少量樣品(例如水樣或魚、蝦、貝類消化道內(nèi)的內(nèi)含物)，放入含20微升提取緩沖液中(1％SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-Hcl pH7.6)，搖勻，用DPS純化試劑[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mM Tris-Hcl，40uM EDTA，60％乙醇，80mM Kac)]純化后，涼干、備用。(2)100微升PCR混合液中成份藍藻專一性探針Cyano 20 0.5微克原核生物通用引物16N60.5微克10X Taq DNA聚合酶緩沖液 10微升2mM dNTP溶液10微升Taq DNA聚合酶 2.5單位以上用無菌水定容為100微升(3)PCR操作取2個0.5毫升小指管，分別加入20微升PCR混合液，然后一管加入樣品DNA，另一管僅加PCR混合液(對照)，各管中加50微升礦物油，放于PCR儀上，按下列程序進行PCR反應94℃5分鐘，94℃、55℃和72℃各1分鐘，并且連續(xù)循環(huán)30次，然后72℃5分鐘。反應完成后，每管加入5微升載樣液(30％Fcol，0.25％溴酚蘭)。取4微升點樣于2％的瓊脂糖凝膠中，電泳結果顯示采用引物Cyano 20/通用引物進行PCR檢測，若樣品中含有藍藻為陽性反應(1-多條PCR擴增帶，擴增帶數(shù)目多少取決于樣品中藍藻種類數(shù)量)，不含藍藻則為陰性反應(無PCR擴增帶)，說明了Cyano 20的專一性。
本方法具有如下優(yōu)點(1) 簡便快速。常規(guī)DNA制備需1至數(shù)小時，該方法在樣品預處理時只需求20-30分鐘即可(擴增時間除外)。(2) 樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個操作。(3) 準確、靈敏度高，Cyano 20為藍藻專一性核酸分子針，若為其它藻類，為陰性反應。(4) 不使用有毒試劑。
序列表11.序列特征長度359bp，類型核酸，鏈數(shù)雙鏈，幾何結構線性；2.分子類型核糖體DNA3.來源銅綠微囊藻4.序列描述SEQ ID NO.1AGGGAGACCT AATTCAGGTA GGAGACGAAA AAAAAGTAGT CGCTACCAAG 50AATCAATCCC AAAAGGTCGG AGCGAGGCGA AATTGGCTTT CAAACTAGGT 100TCTGGGCTCA TAAAAGACCT GAATCAGGAA CAAGGGCTAT TAGCTCAGGT 150GGTTAGAGCC GCCACCCCTG ATAAGGGTGA GGTCCCTGGT TCGAGTCCAG 200GATGGCCCAC CTGCACAGGT GGCAAAAACA AAGAAGCGAG GAATCAGCAC 250CTTATCTTAC TGACATAGTA AGAGAGAATG CTGGCTCTGA GTAAAGAGTC 300CAGAGGAACC TTGAAAACTG CATAGAGCTA GGTGAAAAAG CCAAAAAAGA 350AGACCGCAA359序列表21.序列特征長度22bp，類型核酸，鏈數(shù)單鏈，幾何結構線性；2.分子類型DNA3.來源藍藻4.序列描述SEQ ID NO.2GAACCTTGAAAACTGCATAG
權利要求
1.一種用于鑒別藍藻的核苷酸序列，其特征是該序列來源于海洋赤潮銅綠微囊藻rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列，具體序列為AGGGAGACCT AATTCAGGTA GGAGACGAAA AAAAAGTAGT CGCTACCAAGAATCAATCCC AAAAGGTCGG AGCGAGGCGA AATTGGCTTT CAAACTAGGTTCTGGGCTCA TAAAAGACCT GAATCAGGAA CAAGGGCTAT TAGCTCAGGTGGTTAGAGCC GCCACCCCTG ATAAGGGTGA GGTCCCTGGT TCGAGTCCAGGATGGCCCAC CTGCACAGGT GGCAAAAACA AAGAAGCGAG GAATCAGCACCTTATCTTAC TGACATAGTA AGAGAGAATG CTGGCTCTGA GTAAAGAGTCCAGAGGAACC TTGAAAACTG CATAGAGCTA GGTGAAAAAG CCAAAAAAGAAGACCGCAA
2.一種以權利要求1的核苷酸序列為基礎而設計的藍藻專一性核酸分子探針，其特征是該核酸分子探針來源于權利要求1所述核苷酸序列中的一段20個核苷酸的寡核苷酸序列或其互補序列，或者上述序列再經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過10％的序列。
3.按照權利要求2所述的核酸分子探針，其特征是其核苷酸序列為Cyano205’GAACCTTGAAAACTGCATAG 3’或其互補序列5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’。
4.一種藍藻分子生物學鑒別方法，其特征是采用權利要求2或3所述的核酸分子探針，以通用的核酸分子探針雜交方法進行檢驗鑒定，具體步驟和過程按常規(guī)的分子生物學方法進行。
5.一種藍藻的分子生物學鑒別方法，其特征是采用PCR方法，以權利要求2或3所述的核酸分子探針為一個PCR引物，再與另一個原核生物或真核生物通用PCR引物配對，進行PCR反應，其步驟和過程按常規(guī)PCR方法進行。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征是所說的核酸分子探針為權利要求3所述的Cyano20或其互補序列，所說的原核生物或真核生物通用PCR引物為16N65’GAAGTCGTAACAAGGTAGCCG3’或23R5’NNGGGTTTCCCCATTCGGAAA3’。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測環(huán)境微生物的技術領域。本發(fā)明提供了藍藻rDNA間隔區(qū)核苷酸序列及來源于該序列的核酸分子探針,以及利用該探針鑒別藍藻的方法。利用本發(fā)明,可方便、快速、準確地鑒別藍藻(包括淡水水華藍藻、海洋赤潮藍藻等),具有客觀、準確、自動化等特點。
文檔編號C07H21/00GK1275717SQ0011724
公開日2000年12月6日 申請日期2000年7月7日 優(yōu)先權日2000年7月7日
發(fā)明者陳月琴, 周惠, 屈良鵠 申請人:中山大學