用于核酸測序分析的標記的寡核苷酸探針的制作方法
【專利說明】用于核酸測序分析的標記的寡核苷酸探針 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及通過使用熒光標記的寡核苷酸用于檢測和分析核酸序列的方法。本發(fā) 明具有用于基因分型、病原體檢測和體外診斷的應用。
[0002] 發(fā)明背景 核酸擴增技術的開發(fā)已改革了遺傳分析和工程科學。例如，聚合酶鏈反應（PCR)通常使 用所選擇的引物核酸用于擴增特異性靶核酸，例如以促進靶核酸的檢測作為診斷、法醫(yī)取 證或其他應用的一部分。引物通常成對發(fā)揮作用，其設計為朝向彼此延伸以覆蓋所選擇的 靶區(qū)域。典型PCR循環(huán)包括在此期間雙鏈核酸的鏈彼此分開的高溫(例如85°C或更高）變 性步驟，在此期間引物與分開的單鏈雜交的低溫(例如45-65°C)退火步驟，和在此期間核酸 聚合酶延伸引物的中間溫度(例如約72°C)延伸步驟。還利用雙溫熱循環(huán)操作。這些一般 包括高溫變性步驟和底物退火-延伸步驟。
[0003] 檢測擴增產(chǎn)物的多種策略已得到開發(fā)，并且最廣泛使用的方法之一是5'核酸酶 或TaqMan?測定。5'核酸酶測定通常利用某些DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性，以在PCR 過程期間切割5'核酸酶寡核苷酸探針。該測定允許擴增靶和釋放檢測標記物兩者，一般無 需求助于擴增產(chǎn)物的多個處理步驟。5'核酸酶探針通常包括標記部分，例如熒光報道染料 和猝滅染料。當探針完整時，報道染料與猝滅染料的接近一般導致報道熒光的抑制。在5' 核酸酶反應期間，探針的切割使報道染料和猝滅染料彼此分開，導致來自報道物的可檢測 的熒光增加。PCR產(chǎn)物或擴增子的累積通常通過實時監(jiān)控這種熒光增加間接地進行檢測。
[0004] TaqMan?技術也可以用于單步測定中的DNA擴增和基因組檢測。在該形式中，使 用兩種寡核苷酸探針，每個等位基因各一種，其設計為與含有等位基因特異性核苷酸的DNA 模板區(qū)域雜交。探針各自用不同的熒光染料進行標記。在PCR擴增步驟期間，與模板完全 匹配的探針被消化，導致來自相應染料的熒光信號增加。然而，具有單個核苷酸錯配的探針 不能對模板DNA穩(wěn)定退火，并且無法通過核酸酶活性降解。來自"錯配"探針的相應報道染 料仍被猝滅劑分子猝滅，并且未顯示出熒光信號。由于更復雜的熒光檢測儀器的可用性，可 以通過采用多重探針在這類測定中執(zhí)行多重基因或一種基因的多重等位基因位置的基因 分型，所述多重探針各自用每種獨特的熒光報道染料進行標記。
[0005] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及用于生成用于PCR反應中以檢測靶核酸的標記的寡核苷酸探針的方法，所 述標記的寡核苷酸探針含有熒光羅丹明衍生的染料。在第一個方面，本發(fā)明涉及制備用作 PCR反應中的雜交探針的標記的寡核苷酸的方法，其包括： 提供羅丹明衍生物熒光染料，其中所述熒光染料附著有雙功能接頭分子；經(jīng)由雙功能 接頭分子使反應基團與熒光染料結合，用于將所述熒光染料摻入寡核苷酸內； 將熒光染料摻入寡核苷酸的兩個內部核苷酸之間，前提是熒光染料不摻入寡核苷酸的 5'末端處。
[0006] 在第二個方面，本發(fā)明涉及用于檢測測試樣品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的 存在或不存在的方法，其包括： 使用與靶核酸雜交的標記的探針寡核苷酸執(zhí)行PCR反應，其中標記的探針寡核苷酸 的特征在于具有：羅丹明衍生物熒光染料，所述羅丹明衍生物附著有雙功能接頭分子；以 及與雙功能接頭分子結合的反應基團，用于將熒光染料摻入寡核苷酸的兩個內部核苷酸之 間，前提是熒光染料不摻入寡核苷酸的5'末端處；檢測來自熒光染料的信號，其中所述信 號的強度代表靶核酸的存在或不存在。
[0007] 附圖簡述 圖1顯示（A)羅丹明染料核心和（B)L-蘇氨醇的化學結構。
[0008] 圖2顯示JA270 (羧酸類似物）的化學結構。
[0009] 圖3顯示5染料參考試劑（5染料混合物，2剛混合物）中的UPLC柱中的寡核苷 酸洗脫模式，所述5染料參考試劑在同一天的上午(頂部）和夜間(頂部）運行。
[0010] 圖4顯示使用熒光檢測的5染料參考試劑的UPLC分析，所述5染料參考試劑含有 內部標記的JA270寡核苷酸。
[0011] 圖5顯不如通過UPLC分析的，"主混合物（mastermix)"溶液中存在的寡核苷酸。
[0012] 圖6顯示如通過UPLC分析的，在4°C下貯存3天后的相同"主混合物"溶液中存在 的寡核苷酸。
[0013] 圖7顯示使用R33探針（圖7a)和R34探針（圖7b)生成的PCR生長曲線，所述 R33探針和R34探針已與陽性對照質粒模板（RR)或陰性對照質粒模板（CC)一起貯存0天、 3周或6周。
[0014] 發(fā)明詳述 定義 除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語均具有由本發(fā)明所屬領域技術 人員通常理解的含義。下述參考文獻為技術人員提供了本發(fā)明中使用的許多術語的一般 定義：Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(第 2 版 1994);TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walker編輯 1988);The GlossaryofGenetics，第 5 版，R.Rieger等人（編輯），SpringerVerlag(1991);和Hale &Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。如本文使用的，除非另 有說明，否則下述術語具有歸于其的含義。
[0015] 術語"核酸"指核苷酸(例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等）的 聚合物，并且包含脫氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)、DNA-RNA雜交體、寡核苷酸、多核 苷酸、適體、肽核酸（PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以線性或分支方式 共價連接在一起的核苷酸。核酸通常是單鏈或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管 在一些情況下，包括可以具有替代主鏈的核酸類似物，包括例如磷酰胺（Beaucage等人 (1993)Tetrahedron49 (10):1925);硫代磷酸醋（Mag等人（1991)NucleicAcidsRes. 19:1437;和美國專利號 5, 644, 048)，二硫代磷酸酯（Briu等人（1989)J.Am.Chem.Soc. 111:2321)，〇-甲基亞磷酰胺鍵（參見Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues:A PracticalApproach，OxfordUniversityPress(1992))，以及肽核酸主鏈和鍵（參見 Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc. 114:1895)。其他類似物核酸包括具有帶正電的主鏈 (Denpcy等人（1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92: 6097);非離子主鏈（美國專利號 5, 386, 023, 5, 637, 684, 5, 602, 240, 5, 216, 141 和 4, 469, 863)和非核糖主鏈的那些，包括在 美國專利號5, 235, 033和5, 034, 506中描述的那些。含有一種或多種碳環(huán)糖的核酸也包括 在核酸的定義內（參見Jenkins等人（1995)Chem.Soc.Rev.第169-176頁)，并且類似物也 在例如Rawls，C&ENewsJun. 2,1997第35頁中描述?？梢酝瓿闪姿岷颂侵麈湹倪@些修 飾，以促進另外部分例如標記物的添加，或改變此類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
[0016] 除通常在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞 嘧啶和尿嘧啶）之外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如Seela等人 (1999)Helv.Chim.Acta82:1640中所述的那些。核苷酸類似物中使用的某些堿基充當解 鏈溫度（Tm)改性劑。例如，這些堿基中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥嘌呤、7-脫 氮腺嘌呤等)、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等等。參見 例如美國專利號5, 990, 303。其他代表性雜環(huán)堿基包括例如次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；2-氨 基嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的8-氮雜衍生物； 腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌 呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6氮雜胞苷；5-氟胞苷；5 -氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷； 5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5