專利名稱：：通過工程化生物合成制備的大環(huán)內(nèi)酰胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗腫瘤性質(zhì)的大環(huán)內(nèi)酰胺和它們的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明在美國政府支持下進行，資助號為5R44CA096262-03,由國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)給予。美國政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。格爾德霉素(geldanamycin)屬于安沙霉素(ansamycin)天然產(chǎn)物家族，其成員的特征在于大環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)跨越了在苯醌、苯酚或氬醌母核上互為間位的兩個位置。除了格爾德霉素，安沙霉素還包括麥克霉素(macbecin)、除莠霉素(herbimycin)、TAN-420s和reblastatin。o《0=<0《格爾德霉素NH7麥克霉素INH2麥克霉素IINH,8<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>在安沙霉素中，格爾德霉素及其衍生物受到最廣泛的研究。盡管格爾德霉素最初是作為抗生素活性篩選的結(jié)果而被鑒定的，但目前對它的興趣源自其作為抗癌藥物的潛能。它是熱休克蛋白-90("Hsp90")(參與多種"客戶蛋白(clientprotein)"(包括參與信號轉(zhuǎn)導、細胞周期控制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白)折疊和活化的伴侶蛋白)的抑制劑。抑制劑與Hsp90的結(jié)合中斷了其與客戶蛋白的相互作用，阻止了后者被正確折疊，并隨之喪失了功能或具有了對蛋白酶體所介導破壞的敏感性。在Hsp90客戶蛋白中有參與癌癥的多種突變蛋白或過表達蛋白，例如突變體p53、Bcr-Abl激酶、Raf-1激酶、Akt激酶、Npm-Alk激酶、Cdk4、Cdk6、Weel、HER2/Neu(ErbB2)和HIF國la。多種致癌客戶蛋白可被同時靶向的可能性已經(jīng)在Hsp90抑制劑作為抗癌藥物的開發(fā)中引起了相當大的興趣。參見例如Xiao等人,Mini-ReviewsMed.Chem.2006,6(10),1137-1143。人們考慮對格爾德霉素進行開發(fā)以將其作為抗癌藥物，但其肝臟毒性和差的生物利用度導致其不能作為臨床候選藥物。然而，人們?nèi)匀粚﹂_發(fā)具有Hsp90抑制活性并具有改進藥物性質(zhì)語的格爾德霉素衍生物持有興趣。從化學角度來講，格爾德霉素的C17已經(jīng)是用于合成格爾德霉素衍生物的興趣焦點，這是因為該位置的曱氧基可容易地被親核試劑所取代，由此提供了得到n-取代的-i7-去曱氧基-格爾德霉素的便利合成途徑。構(gòu)效關(guān)系("SAR，，)研究已經(jīng)顯示可引入化學不同和立體不同的l7-取代基而不破壞抗肺瘤活性。參見例如Sasaki等人，US4,261，989(1981)(以下稱作"Sasaki，，)、Schnur等人，US5,932,566(1999)、Schnur等人，J,Med.Chem.1995,38(19),3806-3812、Schnur等人，J.Med.Chem.1995,38(19),3813-3820和Santi等人，US6，872，715B2(2005),將這些文獻披露的內(nèi)容并入本申請作為參考。SAR推理通過Hsp90和格爾德霉素衍生物所形成絡(luò)合物的X射線晶體共結(jié)構(gòu)(X-mycrystalco-structure)得以支持，所述X射線晶體共結(jié)構(gòu)顯示17-取代基從結(jié)合口袋(bindingpocket)中支出并突出到溶劑中(Jez等人，Chemistry&Biology2003,10,361-368)。最為已知的17-取代的格爾德霉素衍生物為17-烯丙基氨基-17-去曱氧基格爾德霉素(也稱作17-AAG或坦螺旋霉素(tanespimycin),如上所述的Sasaki)和17-(2-二曱基氨基乙基)氨基-17-去曱氧基格爾德霉素(也稱作17-DMAG或阿螺旋霉素(alvespimycin)，Snader等人，US6,890,917B2(2005))，這兩種化合物目前都在進行臨床試驗。期望開發(fā)基于格爾德霉素中除17-曱氧基取代之外的結(jié)構(gòu)基元(motif)并且具有得到更引人注意性質(zhì)譜的潛能的其它安沙霉素治療劑。一個可能的基元通過具有非苯醌芳族母核的安沙霉素所代表。如上所述，一些這樣的安沙霉素是天然存在的麥克霉素II、除莠霉素、TAN420B、TAN420D和reblastatin。也已經(jīng)才艮道了一些具有該基元的半合成化合物Rinehart,Jr.等人，US3,987,035(1976)、Muroi等人，US4,421,688(1983)、Schnur,US5,387,584(1995)、Cullen等人，WO93/14215Al(1993)、Sasaki等人，JP57-163369A(1982)和Yamaguchi等人，WO2007/001049A1(20Q7),將這些文獻公開的內(nèi)容并入本申請作為參考。然而，由于各種原因，已經(jīng)將非苯醌安沙霉素發(fā)展成藥物候選物，其中一個可能的例外如下所討論。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，申請人披露了能用作Hsp90抑制劑的大環(huán)內(nèi)酰胺。這些大環(huán)內(nèi)酰胺在結(jié)構(gòu)上與天然存在的安沙霉素相關(guān)，并如下以生物合成的方式得到對產(chǎn)生格爾德霉素的生物體(geldanamycin-producingorganism)即吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602(Streptomyceshygroscopicusvar.geldanusNRRL3602)(在文獻中也經(jīng)常簡單地稱作吸水鏈霉菌NRRL3602)的突變抹(mutantstrain)進行培養(yǎng)。所述突變林不能制造3-氨基-5-羥基苯曱酸("AHBA，，)(在得到格爾德霉素的生物合成途徑中的第一底物(或起子單元(starterunit))),但含有完整的格爾德霉素生物合成基因簇(genecluster)。當供給有非天然的替換起子單元(replacementstarterunit)(即除AHBA之外的芳族氨基酸)時，所述突變抹將它們引入到新穎的大環(huán)內(nèi)酰胺中。具體地，申請人已經(jīng)構(gòu)建了在本申請中稱作菌抹K554-161的突變抹，其中已經(jīng)將負責AHBA生物合成的aMa-6基因簇刪除(delete)，但沒有破壞用于格爾德霉素生物合成的基因簇。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供具有式I所示結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酰胺:3-氨基-5-羥基-苯曱酸。=<其中X為H、Cl、F或OMe(曱氧基)；R1、112和113獨立地為H或OH;以及!^和RS各自為H,或尺4和115組合形成鍵；條件是(i)R'、R"和R"中的至少一個為H,和(ii)如下部分:在另一個優(yōu)選的實施方案中，W和RS各自為H，對應(yīng)于具有式I-a所示結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酰胺(I畫a)在另一個優(yōu)選的實施方案中，R"和RS組合形成鍵，對應(yīng)于具有式I-b所示結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酰胺OMe'(I-b)在一個實施方案中，X在式I、I-a或I-b中為C1或F。在另一個實施方案中，X在式I、I-a或I-b中為H。在另一個實施方案中，X在式I、I-a或I-b中為OMe。另一個實施方案提供了制備具有式I-c所示結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酰胺的方法120=<所述方法包括如下步驟(a)向不能產(chǎn)生3-氨基-5-羥基苯曱酸但含有用于合成格爾德霉素的完整基因簇的吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602菌抹(所述菌林優(yōu)選為菌林K554-161)的培養(yǎng)物中加入(作為替換起子單元)具有式II或II-a所示結(jié)構(gòu)的化合物ci(Il-a)和(b)在產(chǎn)生具有式I-c所示結(jié)構(gòu)的化合物的條件下發(fā)酵所述培養(yǎng)物，其中X為H、Cl、F或OMe;R6、R和RS獨立地為H或OH;以及R9和R^各自為H,或W和R"組合形成鍵；條件是R6、W和RS中的至少一個為H。在前述方法的優(yōu)選實施方案中，在步驟(a)中加入的化合物具有式II的結(jié)構(gòu)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所加入的化合物具有式II-a的結(jié)構(gòu)。在一個優(yōu)選的實施方案中，X在式I、Ia、Ib、Ic或II中為Cl或F。在另一個優(yōu)選的實施方案中，X在式I、Ia、Ib、Ic或II中為H。另一個實施方案提供了在患有高增殖性疾病(hyperproliferativedisease)的患者中治療所述疾病的方法，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酰胺。優(yōu)選地，如此治療的高增殖性疾病為乳腺癌、卵巢癌、白血病、結(jié)腸癌或月市癌。另一個實施方案提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺13和可藥用賦型劑。另一個實施方案提供了抑制靶標細胞增殖的方法，所述方法包括使所述耙標細胞與有效量的本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酰胺接觸。優(yōu)選地，如此抑制的靶標細胞為乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、白血病細胞、結(jié)腸癌細胞或肺癌細月包。一般而言，所述有效量可對應(yīng)于濃度為約40至約10,000nM更優(yōu)選約40至約900nM的所述大環(huán)內(nèi)酰胺。圖1概念性地說明了通過刪除吸水鏈霉菌NRRL3602的aMa-6基因簇來產(chǎn)生菌林K554-161。圖2是從沒有加入任何AHBA的菌抹K554-161發(fā)酵物中分離的產(chǎn)物的LC-MS跡線圖。圖3a是當同樣的菌抹在lmMAHBA的存在下發(fā)酵時分離的產(chǎn)物的LC-MS跡線圖。圖3b是在圖3aLC-MS跡線圖的9.96分鐘時洗脫的物質(zhì)的質(zhì)譜。圖4a和4b分別是從產(chǎn)生格爾德霉素的菌抹即吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602的發(fā)酵物中分離的產(chǎn)物的比較性LC-MS跡線圖和比較性質(zhì)譜。圖5顯示了暴露于本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺對Hsp90客戶蛋白的濃度的影響以及當抑制Hsp90時對所i秀導蛋白的濃度的影響。具體實施例方式格爾德霉素和其它安沙霉素是天然產(chǎn)物聚酮化合物(polyketide)超家族的成員。聚酮化合物在很大程度上不是通過它們的結(jié)構(gòu)而相關(guān)(它們的結(jié)構(gòu)酮化合物合成酶(polyketidesynthase,"PKS，，)的酶來介導)。格爾德霉素PKS是I型PKS(或模塊(modular)PKS)，其特征在于被分成活性模塊的大的多功肯fe酶(largemultifunctionalenzymedividedintomodulesofactivity)以裝酉己纟戔(assembly-line)的方式排列(arrange)。每個模塊具有負載、活化和縮合二碳(乙酰(ketide))單元以使聚酮化合物鏈增長的多種酶活性("結(jié)構(gòu)域(domain)")，并可具有使剛加入的乙酰單元發(fā)生化學改變(還原、脫水等)的額外修飾結(jié)構(gòu)域(modifyingdomain)。模塊的數(shù)目和順序以及包含在每個模塊中的修飾結(jié)構(gòu)域(如果有)的類型決定了所得聚酮化合物的基本結(jié)構(gòu)。有關(guān)PKS的一般綜述請參見Staunton等人，Nat.Prod.Rep.2001,18，380-416。聚酮化合物合成的引發(fā)發(fā)生于負載模塊(包含酰基轉(zhuǎn)移酶("AT")和?；d體蛋白("ACP，，)結(jié)構(gòu)域)，其中通過高能硫酯4建(high-energythioesterlinkage)來將聚酮化合物的第一單元(或起子單元)負載到PKS上。包含酮合成酶(ketoysnthase，"KS")結(jié)構(gòu)域、AT結(jié)構(gòu)域和ACP結(jié)構(gòu)域的隨后模塊("延長模塊(extendermodule)，，)(總稱為最小PKS模塊)同樣通過硫酯鏈來負載基于丙二酸(malonate)的二碳延長單元(extenderunit)。(術(shù)語"二碳"指的是聚酮化合物主鏈，而延長單元也可具有指定于側(cè)鏈的碳原子，如在曱基丙二酰基延長單元的情況下)。所負載的延長單元與增長中的聚酮化合物鏈縮合，所述增長中的聚酮化合物鏈與負載模塊或在先緊鄰的延長模塊相連，在通過二碳來延長聚酮化合物鏈的克萊森反應(yīng)(Claisenreaction)中的情況可以如此。然后，修飾結(jié)構(gòu)域(如果存在)例如酮還原酶(ketodreductase)("KR，，)結(jié)構(gòu)域、脫水酶(dehydratase)("DH")結(jié)構(gòu)域、烯酰還原酶(enoylreductase)("ER")結(jié)構(gòu)域和/或曱基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域在剛加入的二碳單元上進行加工，并通過還原、脫水等來對其進行修飾。在最后的延長模塊發(fā)揮作用后，釋放結(jié)構(gòu)域一典型地為硫酯酶結(jié)構(gòu)域或酰胺酶結(jié)構(gòu)域一從PKS中釋放聚酮化合物，這通常在通過使末端?；c上游羥基或氨基發(fā)生環(huán)化的過程中形成內(nèi)酯或內(nèi)酰胺。其它酶(稱作"剪裁酶(tailoringenzyme)，，或"修飾酶")可進一步修飾所述聚酮化合物，這稱作PKS后修飾(post-PKSmodification),剪裁酶可以是例如加氧酶、糖基和曱基轉(zhuǎn)移酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、卣化酶(halogenase)、環(huán)化酶、氨基轉(zhuǎn)移酶和羥化酶。Hutchinson等人，US2004/0077058Al(2004)(將其公開的內(nèi)容并入本申請作為參考)描述了格爾德霉素PKS基因簇和其來自吸水鏈霉菌NRRL3602的克隆。格爾德霉素PKS包含接受AHBA作為起子單元的負載結(jié)構(gòu)域和各自加入延長單元(丙二酰基、2-曱氧基丙二?；?-曱基丙二?；@取決于模塊)的七個模塊。格爾德霉素PKS的初始產(chǎn)物是原格爾德霉素(progeldanamycin)，通過如下幾個剪裁酶所介導的步驟來將所述原格爾德霉素轉(zhuǎn)化成格爾德霉素C7羥基的氨曱酰基化；C17的羥基化和如此引入的羥基的O-曱基化；C21的羥基化和氧化；以及C4-C5的脫氫15i^-*vOHC7氨甲?；疌17羥基化C170-曱基化C21氧化C4-C5氧化原格爾德霉素已經(jīng)對格爾德霉素生物合成途徑進行生物工程化以產(chǎn)生新的格爾德霉素類似物。使用已知為"AT-swap，，的技術(shù)(其中天然的AT結(jié)構(gòu)域被來自不同PKS的AT結(jié)構(gòu)域替換，參見Tian等人，US2005/0026894Al(2005)(下文稱作"Tian")和Patel等人，Chemistry&Biology2004,11，1625-1633(下文稱作"Patel")來制備以如下為特征的格爾德霉素類似物，所述特征尤其為不存在2-甲基和抑制芳族環(huán)氧化成醌氧化態(tài)格爾德霉素類似物。Rascher等人,AppliedEnvironmentalMicrobiology2005,71(8),4862-4871(下文稱作"Rascher")披露了對加氧酶基因gdmM的破壞導致了格爾德霉素類似物(KOS-1806)的產(chǎn)生，其中對芳族環(huán)的羥基化和氧化及對C4-C5的氧化都得以抑制。。=<Rascher也報道了在用于形成AHBA的基因簇(fl/^a-Z))被刪除的另一種突變林(K3卯-76-l)中，格爾德霉素的產(chǎn)生也受到抑制，但可通過進料AHBA來恢復。在本申請所要求的優(yōu)先權(quán)日期后，Kim等人，ChemBioChem2007，8,1491-1494披露了吸水鏈霉菌二重霉素亞種JCM4427(Streptomyceshygroscopicussubsp.duamyceticusJCM4427)(其也是格爾德霉素的生產(chǎn)者)中AHBA合成酶基因的失活。使所得菌林在各種氨基苯甲酸或羥基笨曱酸的存在下生長。通過LC-MS來對因引入這些苯曱酸而得到的多種代謝物進行表征。同樣在本申請所要求的優(yōu)先權(quán)日期后，Martin等人，WO2007/122829A2(2007)披露了通過向產(chǎn)生麥克霉素的生物體中進料非天然的起子單元來制備18,21-二去氧麥克霉素類似物。所披露的非天然起子單元包括3-氨基苯曱酸、5-氨基-2-氟苯甲酸、5-氨基-3-氟-苯曱酸、5-氨基-2，3-二氟苯曱酸和5-氨基-2,3，6-三氟苯曱酸。申請人已經(jīng)創(chuàng)造了吸水鏈霉菌NRRL3602的新突變株，申請人將其命名為菌林K554-161。其中已經(jīng)將a/z6a-6基因簇刪除，但當進料某些芳族氨基酸作為替換起子單元時，所述菌林K554-161接受這些替換起子單元并產(chǎn)生新穎的大環(huán)內(nèi)酰胺。(當進料AHBA時，菌抹K554-161產(chǎn)生格爾德霉素，這證實其格爾德霉素PKS是完整的。)可進料給菌抹K554-161以制備大環(huán)內(nèi)酰胺的優(yōu)選式II或II-a替換起子單元中有<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>2-氯_5-氨基苯曱酸不是特別期望的底物，它的進料導致芳族環(huán)的脫氯。3-氨基-2-羥基苯曱酸也不是特別期望的底物，其似乎不容易被生產(chǎn)生物體(producingorganism)所接受以嚴生聚酮化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些替換起子單元作為氨基酸可以按相應(yīng)的共軛酸鹽的形式來使用、處理(handle)或加到發(fā)酵混合物中，所述共輒酸鹽為例如鹽酸鹽、三氟乙酸鹽等?；蛘?它們可以按其羧酸鹽的形式來使用、處理或加入，所述羧酸鹽為例如鈉鹽或鉀鹽。當然，兩性離子形式也可以如此來使用、處理或加入。通過本發(fā)明的方法制備的式I-a大環(huán)內(nèi)酰胺包括如下那些化合物，其中式I-a中的如下部分:、o、/o人,、/、和它們分別對應(yīng)于如下化合物，這些化合物完整畫出的結(jié)構(gòu)為III-a至III-q:18(ni-a)、(ni誦b)、(ni-c)(m-d)、(ni-e)、(in-f)(m-g)、(ni陽h)、(ni-o(m-m)、(III-n)、(III-o)(in-p)和(ni-q)。在上述化合物中，優(yōu)選的是化合物m-a和m-d。通過菌株K554-161產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酰胺傾向于沒有在格爾德霉素中發(fā)現(xiàn)的C4-C5雙鍵，如化合物III-a至III-o所示例的那樣。由于將AHBA進料給菌抹K554-161導致格爾德霉素的產(chǎn)生，所以申請人推測C4-C5剪裁酶是有活性的，但通過PKS使用替換起子單元而初始產(chǎn)生的化合物對于C4-C5剪裁酶來說是劣等底物(inferiorsubstrate)。另外，替換起子單元的芳族母核20MeO'MeOMeO沒有被氧化成醌氧化態(tài)，盡管在一些情況下發(fā)生部分氧化(表現(xiàn)為C17和/或C21的羥基化)。作為表明C4-C5剪裁酶是完整的另一個證據(jù)，申請人已經(jīng)觀察到在小量分離出來的數(shù)個產(chǎn)物中C4-C5被氧化。實例包括通過分別進料3-氨基苯曱酸、3-氨基-5-氯苯曱酸、3-氨基-5-氟苯曱酸和3-氨基-4-羥基苯曱酸而得到的式IV-a、IV-b、IV-c和IV-d化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(IV畫a)(IV-b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(IV-c)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(IV-d)各項研究已經(jīng)得出以下結(jié)論格爾德霉素衍生物17-AAG和17-DMAG中的醌基團經(jīng)酶NAD(P)H:醌氣化還原酶l(也稱作NQOl或DT心肌黃酶(diaphorase))還原成相應(yīng)的氫醌形式(分別是17-AAGH2和17-DMAGH。對于它們作為Hsp90抑制劑的活性來說是重要的。參見Kelland等人,J.Nat，lCancerInst.1999,91(22)，1940-1949、Guo等人，CancerRes.2005，65(21)，10006-10015、Guo等人，Mol.Pharmacol.2006，70(4),1194-1203、Maroney等人，Biochemistry2006，45,5678-5685和Gooljarsingh等人，Proc.Nat，lAcad.Sci.(USA),2006,103(20),7625-7630。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>這些研究表明，還原形式的17-AAGH2和17-DMAGH2是比母體醌更強效的Hsp90抑制劑。在一項研究中，使兩種乳腺癌細胞系(同基因的(isogenic),不同的是一種被轉(zhuǎn)染成表達高水平的NQOl)暴露于17-AAG。17-AAG對抗NQOl表達細月包系的效力比對抗非NQOl表達細胞系的效力強約12倍。在另一項研究中，發(fā)現(xiàn)所述氫醌形式比相應(yīng)的醌結(jié)合得更緊密(約40倍)，并具有較慢的解離速率。計算機建模計算也預(yù)測了氫醌形式的結(jié)合是能量上較有利的。然而，格爾德霉素化合物的氫醌形式是不穩(wěn)定的，在溶液中容易被氧化回到醌，特別是在金屬離子的存在下。需要特別的防范措施以阻止氧化，例如在金屬螯合劑存在下的貯存溶液(storingsolution)、低pH緩沖液和/或抗氧化劑。參見例如Adams等人,US7,282,493B2(2007)和Ross等人，US2006/0205705Al(2006)。因此，使用氫醌作為治療劑面臨相當大的制劑挑戰(zhàn)。然而，17-AAGH2的鹽形式正在進行臨床試驗。與17-AAG和17-DMAG不同的是，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺不依賴于通過NQOl進行還原來提高它們的Hsp90抑制活性。因為沒有氫醌基團，它們不需要特別的處理和貯存防范措施來防止氧化成醌形式。但不限于高增殖性疾病，包括頭部和頸部癌癥，包括頭部腫瘤、頸部腫瘤、鼻腔腫瘤、鼻旁竇腫瘤、鼻咽腫瘤、口腔腫瘤、口咽腫瘤、喉部腫瘤、下咽部腫瘤、唾液腺腫瘤和副神經(jīng)節(jié)腫瘤；肝臟和膽道系統(tǒng)(biliarytree)癌癥，特別是肝細胞癌；腸癌(intestinalcancer),特別是結(jié)腸直腸癌；卵巢癌；小細胞肺癌和非小細胞肺癌；乳腺癌；肉瘤，例如纖維肉瘤(fibrosarcoma)、惡性纖維組織細胞瘤(malignantfibroushistiocytoma)、胚胎性才黃紋肌肉瘤(embryonalrhabdomysocarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomysosarcoma)、神經(jīng)纖維肉瘤(neurofibrosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcomatousma)、滑膜肉瘤(synovialsarcoma)、月旨肉瘤(liposarcoma)和軟組織&泉泡狀肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma);中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，特別是腦癌(braincancer);淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，slymphoma)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(lymphoplasmacytoidlymphoma)、濾泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)、粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤(mucosa-associatedlymphoidtissuelymphoma)、夕卜套細月包'淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、Bi普系大細胞淋巴瘤(B-lineagelargecelllymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，slymphoma)和T細胞間變性大細月包'淋巴瘤(T-cellanaplasticlargecelllymphoma),更具體地，可治療的靶標癌癥包括乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)、黑素瘤、結(jié)腸癌、肺癌(特別是非小細胞肺癌(NSCLC))、前列腺癌(prostatecancer)、曱狀腺癌(thyroidcancer)、卵巢癌、淋巴瘤、胰腺癌(pancreaticcancer)和白血病(特別是慢性髓細胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)和慢性淋巴細胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,CLL))。當本發(fā)明的化合物用于抑制靶標細胞的增殖時，如此抑制的靶標細胞優(yōu)選為乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、白血病細胞、結(jié)腸癌細胞或肺癌細胞。一^:而言，有效抑制量可對應(yīng)于濃度為約40至約10，000nM更優(yōu)選約40至約900nM的所述大環(huán)內(nèi)酰胺。以細胞高增殖為特征的非癌癥疾病也可用本發(fā)明化合物進行制備。這些疾病的示例性實例包括但不限于萎縮性胃炎(atrophicgastritis)、炎癥性溶血性貧血(inflammatoryhemolyticanemia)、移才直物才非斥反應(yīng)(graftrejection),炎癥性中性粒細胞減少(inflammatoryneutropenia)、大皰性類天皰瘠(bullouspemphigoid),腹部疾病(coeliacdisease)、脫骨逸鞘性神經(jīng)病(demyelinatingneuropathy)、皮肌炎(dermatomyositis)、炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease)(潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)和克羅恩病(Crohn，sdisease))、多發(fā)性石更化(multiplesclerosis)、心肌炎(myocarditis)、月幾炎(myositis)、鼻息肉(nasalpolyps)、慢性鼻竇炎(chronicsinusitis)、尋常性天皰掩(pemphigusvulgaris)、原發(fā)性腎小球腎炎(primaryglomerulonephritis)、牛皮癬(psoriasis)、外科手術(shù)性粘連(surgicaladhesion)、狹窄(stenosis)或再狹窄(restenosis),鞏膜炎(scleritis)、石更皮病(scleroderma)、濕滲(eczema)(包4舌特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)、刺;敫'I"生皮炎(irritantdermatitis)、過壽文'l"生皮炎(allergicdermatitis))、23牙周疾病(periodontaldisease)(即牙周炎(periodontitis))、多嚢性腎病(polycystickidneydisease)和I型糖尿病。其它實例包括血管炎(vasculitis)(例如巨細胞動月永炎(Giantcellarteritis)(顳動務(wù)K炎(temporalarteritis)、高安動樂K炎(Takayasu，sarteritis))、結(jié)節(jié)性多關(guān)節(jié)炎(polyarteritisnodosa)、變應(yīng)性脈管炎(allergicangiitis)和肉芽月中病(gmnulomatosis)(丘-施二氏病(Churg-Straussdisease))、多脈管炎重疊綜合征(polyangitisoverlapsyndrome)、超敏性脈管炎(hypersensitivityvasculitis)(亨-舍二氏紫瘋(Henoch-Schonleinpurpura))、血清病(serumsickness)、藥物誘導的脈管炎(drug-inducedvasculitis)、感染性脈管炎(infectiousvasculitis),腫瘤性脈管炎(neoplasticvasculitis)、與結(jié)締組織卩章石尋有關(guān)的月永管炎(vasculitisassociatedwithconnectivetissuedisorder)、與^卜體系統(tǒng)先天4生缺陷有關(guān)的#"管炎(vasculitisassociatedwithcongenitaldeficienciesofthecomplementsystem)、韋格納肉芽月中病(Wegener'sgranulomatosis)、川崎病(Kawasaki'sdisease)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脈管炎(vasculitisofthecentralnervoussystem)、伯格病(Buerger，sdisease)和全身性硬化癥(systemicsclerosis));胃腸道疾病(例如胰腺炎(pancreatitis)、克羅恩病(Crohn'sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)、潰瘍性直腸炎(ulcerativeproctitis)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primarysclerosingcholangitis)、任何原因(包括意念性(ideopathic))的良性狹窄(benignstricture)(例如膽管狹窄、食道狹窄、十二指腸狹窄、小腸狹窄或結(jié)腸狹窄)；呼吸道疾病(例如哮喘(asthma)、超牽文'l"生月申炎(hypersensitivitypneumonitis)、石才帛月申(asbestosis)、砂肺(silicosis)和其它形式的塵月市(pneumoconiosis)、'I"曼'I"生支氣管炎(chronicbronchitis)和'l"曼'f生阻塞'l"生氣道疾病(chronicobstructiveairwaydisease));鼻淚管疾病(nasolacrimalductdisease)(例如各種原因(包括意念性)的狹窄(stricture));和咽骨管疾病(eustacheantubedisease)(例如各種原因(包括意念性)的狹窄)。本發(fā)明化合物可與另一種活性藥物成分(API)聯(lián)合給藥，所述另一種活性藥物成分為例如其它抗癌藥或細胞毒劑，包括烷化劑、血管生成抑制劑、抗代謝劑、DNA裂解劑(DNAcleaver)、DNA交聯(lián)劑(DNAcrosslinker)、DNA嵌入劑(DNAintercalator)、DNA小溝結(jié)合劑(DNAminorgroovebinder)、烯二炔(enediyne)、熱休克蛋白90抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor)、樣l管牙急定齊'j(microtubulestabilizer)、核香(nucleoside)(噪呤或嘧啶)類似物、核輸出抑制劑(nuclearexportinhibitor)、蛋白酶體抑制劑(proteasomeinhibitor)、拓樸異構(gòu)酶(topoisomerase)(I或H)抑制劑或酪氨酸、激酶抑制劑。具體的抗癌藥或細胞毒劑包括(3-拉帕醌(P-Iapachone)、安絲菌素P3(ansamitocinP3)、auristatin、比卡魯胺(bicalutamide)、博來霉素(bleomycin)、石朋替佐米(bortezomib)、白消安(busulfan)、callistatinA、喜才對石咸(camptothecin)、卡培他濱(capecitabine)、CC-1065、順鉑(cisplatin)、cryptophycin、柔紅霉素(daunorubicin)、disorazole、多西他塞(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、duocarmycin、達內(nèi)霉素A(dynemycinA)、epothilone、依才乇泊苦(etoposide)、氟脲嘧啶脫氧核苦(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟脲嘧啶(fluoruracil)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、^尹馬替尼(imatinib)、干4無素(interferon)、白介素(interleukin)、伊立替康(irinotecan)、美登素(maytansine)、曱氨蝶呤(methotrexate)、絲裂霉素C(mitomycinC)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、辛二酰苯胺異輕肝酸(suberoylanilidehydroxamicacid，SAHA)、塞替派(thiotepa)、托泊替康(topotecan)、曲古抑菌素A(trichostatinA)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)和長春地辛(vindesine)。優(yōu)選的組合物是與以下藥物的組合吉非替尼(Iressa⑧)、硼替佐米(Velcade⑧)、紫杉醇(Taxo1⑧)、多西他塞、沙利度胺(thalidomide)(Thalomid⑧))、來那度胺(lenalidomide)(Revlimid⑧)和Herceptin。在與另一種API—起進行的聯(lián)合治療中，另一種API可按其自身制劑的形式來分開給藥，或當經(jīng)得起檢驗(amenable)時，可按加到本發(fā)明化合物制劑中的額外組分的形式來給藥。本發(fā)明化合物的制劑可含有賦型劑，例如載體、表面活性劑、增稠劑或乳化劑、固體粘合劑(solidbinder)、分散助劑或懸浮助劑、增溶劑、著色劑、調(diào)味劑、包衣劑(coatings)、冷凍保護劑(cryoprotectant)、凍干保護劑(lyoprotectant)、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、防腐劑、等滲劑(isotonicagent)和它們的纟且合。在Gennaro,ed.，Remington:TheScienceandPracticeof的選擇和使用，將此文獻公開的內(nèi)容并入本發(fā)明作為參考。^'本發(fā)明化合物的受試者典型地為人，盡管本發(fā)明可為獸醫(yī)目的而實施，其中就所涉及的具體哺乳動物(包括貓、牛、狗、馬等)而言，對單位劑量進行合適的調(diào)整。本發(fā)明化合物的治療有效量為所述化合物的如下量，所述量在細胞培25人員、獸醫(yī)、臨床醫(yī)生或內(nèi)科醫(yī)生所正在尋求的生物應(yīng)答或醫(yī)學應(yīng)答，這些應(yīng)答包括改善所治療的疾病、病癥或障礙的癥狀。劑量范圍可以是約4mg/n^至約4000mg/m2，這取決于給藥頻率。為使用安沙霉素而開發(fā)的可用于本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酰胺的制劑技術(shù)包括基于各種鏈長度的甘油三酯的制劑(Ulm等人，US2006/0014730Al(2006)、Ulm等人，US2006/0148776Al(2006)和Isaacs等人，WO2006/094029A2(2006));DMSO/卵磷脂組合(Tabibi等人，US6,682,758Bl(2004));聚乙氧基化蓖麻油(Zhong等人，US2005/0256097Al(2005));各種增溶劑或分散劑(Mansfield等人，US2006/0067953Al(2006));二曱基脫水山梨糖醇(dimethylsorbide)(Desai等人，WO2006/034147A2(2006));和納米顆粒懸浮液(Tao等人，Am.Assoc.CancerRes.，96thAnnualMeeting(Apr.16-20,2005)，abstractno.1435和Licari等人，US2007/0203110Al(2007));將這些文獻公開的內(nèi)容并入本發(fā)明作為參考。通過參考下述實施例可進一步理解本發(fā)明的實施，這些實施例以示例性方式而非限制性方式來提供。一些替換起子單元是商購的，因此沒有提供它們的合成方法。對于其它替換起子單元，提供了合成方法。實施例1:菌株K554-161的制備一般方法.吸水鏈霉菌NRRL3602的aM)a-6基因簇與格爾德霉素(gc/w)PKS基因相隔多于30kb,并含有六個對用于合成AHBA的酶進行編碼的ORF(可讀框)(Rascher,如上所述)。對在所述簇邊緣的兩個約lkb的DNA片段進行PCR擴增，并用作同源臂(homologyarm)以處于衍生自pFDneoS的卡那霉素抗性盒(kanamycinresistancecassette)的側(cè)翼。將所述構(gòu)建體插入到接合質(zhì)粒pKC1139中，所述接合質(zhì)粒pKC1139含有安普霉素抗性才示i己(apramycinresistancemarker)和熱敏性復制子(thermosensitivereplicon)。通過在限制性溫度孵育培養(yǎng)物來對其中斷裂盒(disruptioncassett)被插入到染色體中的突變體克隆進行選擇。接下來，除了雙交換(doublecrossover)之夕卜，還就卡那霉素抗性/安普霉素敏感性表型而對200個菌落進行了篩選。通過PCR對所選擇菌落進行的遺傳分析用于鑒定克隆(菌林K554-161),其中所述a/26a-6基因簇的六個ORF已經(jīng)被所述卡那霉素抗性盒替代。26已經(jīng)4要照布達佩斯條約的條款在2006年11月15日將菌林K554-161的樣品保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)(RO.Box1549,Manassas,Virginia20108,USA),其中保藏號為PTA-謂2。菌抹、培養(yǎng)基和生長條件.吸水鏈霉菌去勢變種NKRL3602得自桿菌XLl-藍(EscherichiacoliXLl-blue)(Strategene)用于DNA操作。大腸桿菌ET12657/pUZ8002(Kieser等人，PracticalStreptomycesGenetics(TheJohnInnesFoundation,Norwich,U.K.,2000))(下文中稱作"Kieser，，)在大腸桿菌-吸水鏈霉菌接合(conjugation)中用作供體。為了繁殖和孢子形成，使吸水鏈霉菌在番茄醬瓊脂上在28。C生長14天(Patel，如上所述)。使大腸桿菌菌抹在LB培養(yǎng)基上生長。將吸水鏈霉菌菌林以孢子在20%甘油中的懸浮液的形式保持在-80。C。引物和PCR條件.引物Olil和01i2(表l)用于對含有基因的片段的右同源臂進行PCR擴增。引物01i3和01i4用于對含有基因aMa-76的片段的左同源臂進行擴增(參見圖1)。使用作為模板的吸水鏈霉菌基因組DNA(如在Kieser(如上所述)中所描述的那樣來制備)和PCR故障保險試劑盒(fail-safekit)(Epicentre)(按照制造商的指示)來進行PCR擴增，表1-用于制備菌林K554-161的寡核苷酸(工程化用于克隆的限制位點以下劃線標識)引物序列說明OlilAAGGATCCAGACCTCGACCACCGGTG用于同源臂A的擴增01i2AACTCGAGCACGATTTCCAGCGCATG用于同源臂A的擴增OIi3AAACTAGTCTCACCCGCTCGCCTTC用于同源臂B的擴增01i4AAATGCATTGAGCCACCACGGCGTG用于同源臂B的擴增01i5GCAGAAGGAACCGCGCAC用于盒插入分析01i6CGATTGTCTGTTGTGCCCAGTC用于盒插入分析01i7GGCTGACCGCTTCCTCGTG用于盒插入分析01i8CGCACCCTGGAGTCGGAC用于盒插入分析斷裂盒裝配.通過制備如下DNA片段的四段連接體(fourpieceligation)來將斷裂盒一步裝配到pKC1139接合質(zhì)粒中(Bierman等人，Gene1992，116(1):用BamHI-XhoI消化的上游臂PCR產(chǎn)物、用Xhol-Nsil消化的來自pFDneoS(Denis等人，Gene1992，111(1)，115-8)的卡那霉素抗性盒、用Nsil-Spel消化的下游臂PCR產(chǎn)物和用BamHI-Spel消化的pKC1139載體。將所得到的質(zhì)粒命名為pKOS554-106，并且其結(jié)構(gòu)通過測序得以確認。如圖l所示，質(zhì)粒pKOS554-106含有處于卡那霉素抗性盒(Km"側(cè)翼的基因a/z^-3的片段和基因aMa-/的片段、安普霉素抗性標記(ApraR)和復制子的psG5熱敏性起點(ori)。大腸桿菌-吸水鏈霉菌接合.如在Kieser(如上所述)中所描述的那樣，使用大腸桿菌ET12657/pUZ8002作為供體通過接合將質(zhì)粒pKOS554-106引入到吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602中。使初級接合后體(exconjugant)在5mL含有卡那霉素(50mg/L)的R5液體培養(yǎng)基(Kieser,如上所述)中在30。C生長2天。為了選擇突變體，將0.2mL所述細胞用于接種5mL具有卡那霉素的R5，并在37。C生長2天。將該步驟重復一次，然后稀釋細胞，并鋪在番茄瓊脂板上，以及在28。C孵育14天。具有雙交換的各個菌落如下鑒定復制鋪板在補充有安普霉素(100mg/L)的R5板上，由此確定是否沒有安普霉素抗性。通過遺傳分析來確認插入性斷裂.使菌落(卡那霉素抗性和安普霉素敏感性)在液體R5上生長，并如在Kieser中所描述的那樣得到基因組DNA。使用PCR故障安全試劑盒來進行使用引物對01i5/01i6和01i7/01i8的PCR分析(表1和圖1),從而確認插入性斷裂(insertionaldisruption),菌抹K554-161和格爾德霉素產(chǎn)生.圖2顯示了從只有菌株K554-161(沒有加入任何AHBA)的發(fā)酵物中分離的產(chǎn)物的LC-MS跡線圖。如果產(chǎn)生了格爾德霉素，其應(yīng)當在所使用的HPLC條件下在剛好小于10分鐘的時間內(nèi)洗脫。如圖所示，沒有產(chǎn)生任何格爾德霉素。圖3a顯示了當在lmMAHBA的存在下對菌林K554-161進行發(fā)酵時分離的產(chǎn)物的LC-MS跡線圖。在9.96分鐘有大的洗脫峰，在此處認為格爾德霉素洗脫出來。圖3b是所述9.96分鐘物質(zhì)的質(zhì)譜，鑒定其為格爾德霉素(格爾德霉素的m/z計算值為559.3[M-H]-)。圖4a和4b分別為從對照實驗(其中對天然格爾德霉素生產(chǎn)生物體(naturalgeldanamycin-producingorganism)即吸水鏈霉菌NRRL3602進行發(fā)酵)中分離的產(chǎn)物的LC-MS跡線圖和質(zhì)語(針對在9.97分鐘洗脫的物質(zhì))。圖4a和4b清楚地表明了格爾德霉素的產(chǎn)生。實施例2:3-氨基-5-氯苯曱酸如下所示制備替換起子單元3-氨基-5-氯苯曱酸的鹽酸鹽283-氯-5-硝基苯曱腈.將濃H2SO4(440mL)緩慢加到碎水(1200g)中，并將2-氨基-3-氯-5-硝基苯曱腈(43.8g)懸浮在所得H2S04溶液中。加入丙-2-醇(1600mL)后，在劇烈攪拌下將混合物加熱到內(nèi)部溫度為40°C。滴加NaNO2(66.0g)于水(100mL)中的溶液。加入完成后，將混合物在40。C再保持3小時，然后冷卻至環(huán)境溫度，并用CH2Cl2萃取。有機萃取物先后用水、O.lNNaOH、水和鹽水洗滌，然后用MgS04干燥，過濾通過硅膠墊，然后蒸發(fā)，得到粗制產(chǎn)物，其為黃色固體。進行硅膠色譜(20。/。EtOAc(乙酸乙酯)/己烷)，然后/人丙-2-醇中結(jié)晶，得到產(chǎn)物，其為黃色晶體。'H-NMR(CDCb):58.47(1H，t,JN2.0Hz)，8.43(1H，dd，J=l,4,2.0Hz)，7.98(1H,dd，J=1.4，2.0Hz)。I3C-NMR(CDC13):5148.8，137.4，137.0,128.1,125.3,115.4，115.3。3-氯-5-硝基苯曱酸.將3-氯-5-硝基苯曱腈(30.0g)溶解在水(85mL)和H2SO4(250mL)的混合物中，并在N2氣氛下在150。C加熱2小時。將混合物冷卻至環(huán)境溫度，并倒在水(1L)上。真空過濾收集所得固體，并且濾液用乙酸乙酯萃取。合并萃取物和固體，用水和鹽水洗滌，然后用MgS04干燥，過濾并蒸發(fā)。在加熱下將殘余物溶解在l:l水/MeOH(200mL)中，用脫色炭處理并過濾。加入水(100mL),然后使混合物冷卻并結(jié)晶。得到產(chǎn)物，其為淺黃色晶體。'H-麗R(d6畫固SO):51楊(1H,brs)，8.51(2H,m),8.29(1H，m)。13C-NMR(d6-DMSO):5164.9,149.2，135,2，135.0，134.5，127.7，122.9。3-氨基-5-氯苯曱酸鹽酸鹽.將3-氯-5-硝基苯曱酸(10.0g)和10。/。Pd/C(0.3g)于MeOH(100mL)和6NHCl(30mL)中的混合物在帕爾裝置(Parrappamtus)中在30psiH2下振搖30分鐘，然后過濾通過硅藻土并蒸發(fā)。殘余物從6NHC1中結(jié)晶，得到產(chǎn)物。通過從水中再次結(jié)晶而得到更高度純化的物質(zhì)。'H-NMR(d4-CD30D):57,24(1H，dd，J=1.4，2.0Hz),7.20(1H，dd，J=1.6,2.0Hz),6.87(1H,t,J=2.0Hz)。13C-NMR(d4-CD3OD):5167.6，149.5，134.329132.7,117,8,117.4，113.9。實施例3:3-氨基-S-氟苯甲酸如下制備替換起子單元3-氨基-5-氟苯甲酸的鹽酸鹽:H2,Pd/C1"1020^^^02HaH02C將3-氟-5畫硝基苯曱酸(5.0g)和10。/oPd/C(0.3g)于MeOH(100mL)和6NHCl(20mL)中的混合物在30psiH2下振搖30分鐘。過濾除去催化劑，然后將溶液蒸發(fā)至干。殘余物從6NHC1中結(jié)晶，得到產(chǎn)物。13C-NMR(D20):S167.6，162.5(d,JCF=246Hz)，133.8(d，JCF=8Hz)，132.6(d,JCF=10Hz),119.7(d，JCF=3Hz),116.7(d，Jc產(chǎn)23Hz)，115.2(d,JCF=24Hz)。實施例4:3-氨基-6-氟苯甲酸如下制備替換起子單元3-氨基-6-氟苯曱酸的鹽酸鹽H2,Pd/CH02C^^^^N02HaH02C將2-氟-5-硝基苯曱酸(5.0g)于MeOH(100mL)和6NHCl(15mL)中的溶液與0.15g10%Pd/C—起在30psiH2下振搖30分鐘。過濾除去催化劑，然后蒸發(fā)濾液。殘余物從6NHC1中結(jié)晶，得到產(chǎn)物。'H-NMR(D20):57.82(1H,dd，J=2.8,6.0Hz),7'55(1H,ddd，J=2.8,4.0，8,9Hz),7.27(1H,dd,J=8.9，14.0Hz)。13C-NMR(D20):5166.5(d,Jc產(chǎn)2Hz)，16L3(d，Jc產(chǎn)260Hz)，129.7(d，JCF=10Hz),126.6，126.0(d,Jc產(chǎn)3Hz),120.0(d，JCF=llHz),118.9(d,JCF=25Hz)。實施例5:3-氨基-4-氟苯甲酸如下制備替換起子單元3-氨基-4-氟苯曱酸的鹽酸鹽H2,Pd/CH02CTv、No2HC'H02C將4-氟-5-硝基苯曱酸(5.0g)于MeOH(100mL)和6NHCl(15mL)中的溶液與0.15g10%Pd/C—起在30psiH2下振搖30分鐘。過濾除去催化劑，然后蒸發(fā)濾液。殘余物從6NHC1中結(jié)晶，得到產(chǎn)物。'H-NMR(D20):57.89(2H,m),7.25(1H,t,J=10Hz)。30實施例6:3-氨基-2-氟苯甲酸如下制備替換起子單元3-氨基-2-氟苯曱酸的三氟乙酸鹽2-氟間苯二曱酸.1,3-二曱基-2_氟苯(4g)于水(75mL)中的混合物用KMnO4(11.0g)處理，并將深紫色混合物》爰'l"曼加熱至回流?；亓?2小時后，將混合物冷卻并真空過濾通過硅藻土墊。將無色濾液酸化至pH為1,此時產(chǎn)物結(jié)晶。真空過濾，得到產(chǎn)物。'H-NMR(CD3OD/CDCl3):S8.10(2H,dd，J=6.4,7.6Hz),7.31(1H，t，J=7.6Hz)。13C-NMR(CD3OD/CDCl3):5165.5,161.1(d:Jc產(chǎn)271Hz),136.1,123.4(d,JCF=5Hz)，120.6(d,JCT=llHz)。2-氟間笨二曱酸單曱酯.將2-氟間苯二曱酸溶解在MeOH(100mL)中，冷卻至-10。C，并用SOCl2(5mL)逐滴處理。加入完成后，將混合物溫熱至環(huán)境溫度并攪拌過夜，然后蒸干。將殘余物溶解在EtOAc中，用飽和NaHC03水溶液洗滌，用MgS04干燥，過濾并蒸發(fā)，得到二曱酯。將二曱酯溶解在MeOH(曱醇)(50mL)中并用l.O摩爾當量的5NNaOH在環(huán)境溫度處理過夜。濃縮混合物，并將殘余物在水和CH2Cl2之間分配。水相用6NHC1酸化，然后過濾收集所得沉淀物并風干，得到產(chǎn)物。'H-NMR(CD3OD):58.10(2H,m),7.34(1H,t,J=8.0Hz),3.93(3H，s)。3-(叔丁氧基羰基氨基V2-氟苯曱酸曱酯.2-氟間苯二曱酸單甲酯(0.4g)于叔丁醇(10mL)中的溶液用Et3N(三乙胺)(0.56mL)和二苯基膦酰疊氮(diphenylphosphorylazide)(0.75mL)處理。1小時后，將混合物在回流溫度加熱24小時，然后冷卻并濃縮。殘余物用EtOAc稀釋，用飽和NaHC03水溶液洗滌，用MgS04干燥，過濾并蒸發(fā)。進行硅膠色譜(丙酮/己烷梯度)，得到產(chǎn)物。'H-NMR(CDCl3):58.31(1H，brt，J=7.2Hz)，7.55(1H，ddd，J=1.6，6.8，318.0Hz)，7.16(1H,ddd,J=1.2,8.0,8.0Hz)，6.80(1H,brs),3.93(3H,s)，1.54(9H，s)。3-氨基-2-氟苯甲酸三氟乙酸鹽.將3-(叔丁氧基羰基氨基)-2-氟苯曱酸曱酯于1NNaOH中的混合物在環(huán)境溫度攪拌2小時，然后酸化并用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgS04干燥，過濾并蒸發(fā)。將殘余物溶解在5mL三氟乙酸中，保持10分鐘，然后蒸干，得到產(chǎn)物。'H-NMR(D2O):57.80(lH,ddd，J=1.6,8.0,8.0Hz),7,54(1H,ddd,J=1.2，4,0,4.0Hz)，7.28(1H,t，J=8.0Hz)。13C-NMR(D20):5167.2,154.1(d,JCF=257Hz)，130.2,127.9，124.9,122.5,120.1。實施例7:3-氨基-5-甲氧基苯曱酸如下制備替換起子單元3-氨基-5-曱氧基苯曱酸的鹽酸鹽3-曱氧基-5-硝基苯曱酸.將3,5-二硝基苯曱酸(866mg)溶解在濃度為1M的LiOMe(曱醇鋰)于MeOH(1.3mL)中的溶液中，然后蒸干。將所得固體溶解在30mL六曱基膦酰胺(hexamethylphosphoramide)中并在80。C加熱16小時。然后將混合物冷卻，并倒在碎冰(250g)和6NH2SO4(42mL)的混合物上?；旌衔镉靡颐演腿?，并且萃取物用水和鹽水洗滌，然后用MgS04干燥，過濾并蒸發(fā)，得到橙色固體。過濾通過硅膠(使用9:1CH2Cl2/MeOH)，然后蒸發(fā)，得到624mg產(chǎn)物。!H-NMR(d6醫(yī)丙酮)58.36(lH,dd，J-1.6，2.0Hz),7.97(1H,t,J=2.0Hz),7.91(1H,dd，J-1.6,2.0Hz)，4.03(3H,s)。3-氨基-5-曱氧基苯曱酸鹽酸鹽.將上述操作的產(chǎn)物溶解在MeOH(20mL)中，并在H2氣氛下用6NHCl(2mL)和10。/oPd/C(50mg)處理30分鐘。過濾除去催化劑，并將混合物蒸干。從6NHC1中結(jié)晶，由此得到產(chǎn)物。'H-麗R(D20):57.43(1H,dd，J=1.3,2.5Hz)，7.40(1H,dd,J=1.3,2.0Hz),7.02(1H，t，J=2.2Hz),3.72(3H,s)。13C-NMR(D20):5168.6,160.1，133.0,131.6,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>116.0,115.1，113.6，55.8。實施例8:3-氨基-5-氯-4-羥基苯甲酸如下制備替換起子單元3-氨基-5-氯-4-羥基苯曱酸的鹽酸鹽:將3-氯-4-羥基苯曱酸(5.0g)分小份加到攪拌的在冰上冷卻的發(fā)煙HNO3(90%,15mL)中。加入完成后，將橙色混合物溫熱至20°C,并繼續(xù)攪拌2小時。加入冰水(50mL)，然后真空過濾收集所沉淀的產(chǎn)物，得到5.4g3-氯_4-羥基-5-硝基苯曱酸，其為亮黃色固體。使用帕爾振搖器，將3-氯-4-羥基-5-硝基苯甲酸(5g)和10。/。釔/炭(0.1g)于曱醇(100mL)和6NHCl(20mL)中的混合物在30psi氫氣下振搖30分鐘。過濾除去催化劑，并將溶液蒸發(fā)至干。產(chǎn)物從6NHC1中結(jié)晶。^-NMR(400MHz,D20):S7.78(1H,d,J=3Hz)，7.71(1H,d,J=3Hz)。13C-NMR(100MHz,D20):5167.7，150.6，131.4,123.8，122.4,121.5,120.3。實施例9:制備用于產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酰胺的接種物(inocuhim)如下制備種子培養(yǎng)物(seedculture):將菌抹K554-161的lmL孢子懸浮液(108個孢子)接種到50mLYPD肉湯(broth)(Sigma)中，并在250mL錐形瓶(Erlenmeyerflask)中在攪動下在28匸孵育24小時。將5mL該培養(yǎng)物用于在250mL帶有擋板的錐形瓶中接種40mL改性DeBoer甜菜糖蜜培養(yǎng)基(ModifiedDeBoerBeetMolassesMedium)(葡萄糖(Sigma)，36.4g/L;小麥蛋白胨(wheatpeptone)El(Organotechnie),5g/L;SL型大豆蛋白胨(Marcor),5g/L;細菌培養(yǎng)用酵母提取物(bactoyeastextract)(BD)，2.5g/L;燕麥(oatmeal)(Gerber)，5g/L;甜菜糖蜜(beetmolasses)(Minn-Dak)，10g/L(用NaOH平衡至pH為7))。加入溶解在DMSO中的替換起子單元(lOOmM)，得到ImM濃度。在攪動下將培養(yǎng)物在28t:孵育，直到安沙霉素的產(chǎn)生達到穩(wěn)定(levd)。制備了補充有AHBA的培養(yǎng)物、沒有補充任何前體的培養(yǎng)物和野生型菌抹的培養(yǎng)物作為所有實驗的對照。在250mL帶有擋板的錐形瓶中將菌抹K554-161于20。/。(v/v)甘油中的1毫升冷凍的孢子接種到50mL過濾器除菌的YSD培養(yǎng)基(由10g/L細菌培養(yǎng)用酵母提取物(BD)、20g/LSL型大豆蛋白胨(Marcor)和20g/L葡萄糖構(gòu)成)中。在沖程(stroke)為2英寸的旋轉(zhuǎn)振蕩器上將細胞在28。C以190rpm孵育22-24小時。將22.5mL初級種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2.8L帶有擋板的含有450mLYSD培養(yǎng)基的馮巴赫瓶(Fembachflask)中，由此得到次級種子培養(yǎng)物。使這些培養(yǎng)物在28。C以190rpm生長16-18小時。實施例10:在不使用XAD-16HP樹脂的情況下對大環(huán)內(nèi)酰胺進行制備和分離如下是使用3-氨基-5-氯苯曱酸或3-氨基-5-氟苯曱酸作為替換起子單元的代表性方法。用其它替換起子單元進行的制備可類似地進行。本申請稍后將描述可選擇的在樹脂(例如XAD-16HP)的存在下進行的制備。發(fā)酵.將含有4.5L改性DeBoer甜菜糖蜜培養(yǎng)基的五升生物反應(yīng)器(B.Braun)在121。C加壓處理60分鐘。然后它們用225mL次級種子培養(yǎng)物接種。在28。C進行發(fā)酵，其中通氣速率(aerationrate)為0.4v/v/m，以及初始攪動速率為400rpm。通過400-1000rpm的攪動級聯(lián)(agitationcascade)將溶解的氧氣控制在空氣飽和度(airsaturation)的30%。通過自動加入2.5N石克酸或2.5N氫氧化鈉，將培養(yǎng)物的pH保持在7.0。通過自動加入100%UCONLB-625來控制發(fā)泡。將替換起子單元制備成濃度為1M的在DMS0中的濃縮溶液。接種后1天，將它們加到生產(chǎn)培養(yǎng)物(productionculture)中至最終濃度為0.5mM?！独舭l(fā)酵物生長4天?；衔颕II-a的分離.使用3-氨基-5-氯苯曱酸作為替換起子單元的十升發(fā)酵物肉湯用等體積的曱醇提取2小時，然后過濾。濾液在1.2LHP-20SS吸附劑(Supelco)上用不連續(xù)梯度(2.5倍柱體積(CV)的40:60(v/v)曱醇:水、2.5倍CV的50:50(v/v)曱醇:7JC、2.5倍CV的60:40(v/v)曱醇:水和2.5倍CV的100%曱醇)進行色譜分離。將含有目標化合物的餾分(通過LC-MS(m/z-551[M-H]-)來確定)合并，然后在1.0LC18吸附劑(Bakerbond,40nm)上用不連續(xù)梯度(4倍CV的50:50(v/v)曱醇:水、4倍CV的55:45(v/v)曱醇:水、4倍CV的60:40(v/v)曱醇:水和4倍CV的65:35(v/v)曱醇:水)進行色語分離。將含有目標化合物in-a的餾分(通過LC-MS來確定)合并，然后34通過(318色譜以30:70(v/v)乙腈:水在相同的dg處理柱上進一步純化。通過制備性HPLC(Inertsil0DS-3，8pm,250mmx300mm)以30:70(v/v)乙腈:水對富集產(chǎn)物池中殘留的少量雜質(zhì)進行分離。分離出總共52mg化合物III-a，其為淺黃色固體?；衔颕II-d的分離.通過離心對使用3-氨基-5-氟苯甲酸作為替換起子單元的九升發(fā)酵物肉湯進行沉降。上清液在1.0LHP-20SS吸附劑上用不連續(xù)梯度(3倍CV的卯乂0(v/v)曱醇:水、3倍CV的50:50(v/v)曱醇:水、3倍CV的60:40(v/v)曱醇:水、3倍CV的70:30(v/v)甲醇:水和3倍CV的80:20(v/v)曱醇:水)進行色譜分離。將含有目標化合物的餾分(通過LC-MS(m/z二535[M-HT)來確定)合并，然后在l.OLC,s吸附劑上以50:50(v/v)曱醇:水進一步純化。將含有目標化合物m-d的餾分(通過LC-MS來確定)合并，然后通過制備性HPLC以30:70(v/v)乙腈:水對富集產(chǎn)物池中的少量雜質(zhì)進行分離。分離出總共241mg化合物III-d,其為淺黃色固體?；衔颕V-c的分離.從上述產(chǎn)生III-d(即在不存在XAD-16HP的情況下)的發(fā)酵物中分離化合物IV-c。對來自在純化化合物III-d中的C18色譜和制備性HPLC步驟的含有目標化合物IV-c的餾分(通過LC-MS(m/z-533[M-H]-)來確定)進行合并。通過制備性HPLC以27:73(v/v)乙腈:水對產(chǎn)物池進行純化，得到1.8mg化合物IV-c，其為黃色固體。實施例11:在使用XAD-16HP樹脂的情況下制備大環(huán)內(nèi)酰胺申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中加入吸附樹脂(adsorbentresin)提高了所述大環(huán)內(nèi)酰胺的收率。在不受理論束綽的情況下，認為所述樹脂吸附了所述大環(huán)內(nèi)酰胺，并保護它們使之不會分解或不會降解。所述吸附樹脂優(yōu)選包含非離子性(非官能化的)疏水性聚合物，例如聚苯乙烯或苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。這樣的樹脂是高度多孔的，并能可逆性地從含水培養(yǎng)基中吸附有機分子。示例性的合適樹脂包括AmberliteXAD樹月旨(特別是XAD16級、XAD-16HP級、XAD7級、XAD8級、XAD1180級和XAD5級)、AmberchromTM樹脂(特別是CG161級)、DIAIONtm樹脂(特別是HP20級)和SEPABEADSTM樹脂。AmberliteTM和AmberchromTM樹脂可從Rohm&Haas得到，而DIAIONtm和SEPABEADStm樹脂可從MitsubishiChemical得到。所述樹脂優(yōu)選為XAD-16HP。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，通過經(jīng)驗來確定所期望的樹脂類型和樹脂量可能是需要的。發(fā)酵.使用一長段'/2，，有機硅管(siliconetubing)(在滅菌前夾住)將含有90gXAD-16HP(Rohm&Haas)和200rnL去離子水的1L燒并瓦與每個5L生物反應(yīng)器相連。生物反應(yīng)器含有4.5L改性DeBoer甜菜糖蜜培養(yǎng)基，并在121°C加壓處理60分鐘。滅菌后，松開有機硅管，并將樹脂加到生產(chǎn)培養(yǎng)基中。然后生物反應(yīng)器用225mL次級種子培養(yǎng)物接種。這些發(fā)酵在與就不使用吸附樹脂的發(fā)酵所描述相同的條件下進行?；衔颕II-a的分離.通過離心對使用3-氨基-5-氯苯曱酸作為替換起子單元的三十八升發(fā)酵物肉湯進行沉降。潷出上清液，然后XAD-16HP樹脂和細胞沉淀(cellpellet)用10L100。/。曱醇提取。過濾提取混合物，然后濾液在1.75LHP-20SS吸附劑上以不連續(xù)梯度(3倍CV的40:60(v/v)曱醇:水、3倍CV的50:50(v/v)曱醇:水、3倍CV的60:40(v/v)曱醇:水、3倍CV的70:30(v/v)曱醇:水和3倍CV的80:20(v/v)曱醇:水)進行色譜分離。將含有化合物III-a的餾分合并，并在l.OLds吸附劑上以45:55(v/v)曱醇:水進行色譜分離。富集的餾分在400mLC,8吸附劑上以30:70(v/v)乙腈:水進一步純化，得到357mg化合物in-a，其為黃色固體?；衔颕II-d的分離.通過離心對使用3-氨基-5-氟苯曱酸作為替換起子單元的九升發(fā)酵物肉湯進行沉降。潷出上清液并靜置。XAD-16HP樹脂和細胞沉淀用9L曱醇提取，然后過濾。然后合并濾液和上清液，并在1.5LHP-20SS吸附劑上以不連續(xù)梯度(3倍CV的40:60(v/v)曱醇:水、3倍CV的50:50(v/v)曱醇:水、3倍CV的60:40(v/v)曱醇:水和3倍CV的70:30(v/v)曱醇:水)進行色譜分離。將含有化合物III-d的餾分合并，并在1.0Lds吸附劑上以50:50(v/v)曱醇:水進行色語分離。富集的餾分在400mlCw吸附劑上以27:73(v/v)乙腈:水進一步純化，得到1.3g化合物III-d，其為黃色固體。化合物IV-b的分離.從在XAD-16HP的存在下產(chǎn)生化合物III-a的發(fā)酵物(如上所述)中分離化合物IV-b。對來自在純化化合物III-a中的第一個C18色譜步驟的含有目標化合物IV-b的餾分(通過LC-MS(m/z-565[M-H]-)來確定)進行合并。在400mLC,8吸附劑上以42:58(v/v)曱醇:水對產(chǎn)物池進行色譜分離。富集的餾分通過制備性HPLC以27:73(v/v)乙腈:水進一步純化，得到23mg化合物IV-b,其為黃色固體。實施例12:對大環(huán)內(nèi)酰胺的表征大多數(shù)時候，向菌林K554-161中進料替換起子單元導致大環(huán)內(nèi)酰胺混36合物的產(chǎn)生，如表2所總結(jié)的那樣。(如表2所注明的那樣，在一些情況下，替換起子單元是商購物質(zhì))表2-通過進料替換起子單元而產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酰胺替換起子單元所產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酰胺3-氨基-5-氯笨甲酸m-a(主要產(chǎn)物)，III-b，m-c，IV-b3-氨基-5-氟苯曱酸m-d(主要產(chǎn)物)，III-e,III-f,IV-c3-氨基-5-甲氧基苯曱酸in-g3-氨基苯曱酸(a)m-h,m-i,iv-a3-氨基-2-氯笨甲酸(a)m-j3-氨基-2-氟苯甲酸ni-k3-氨基-4-氟苯甲酸III-l，III-m3-氨基-6-氟苯甲酸III-n,iii-o3-氨基-4-羥基苯甲酸(a)iii-p,iv-d3-氨基-5-氯-4-羥基苯曱酸III-q(a)商購化合物所產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酰胺的分析特征如下給出化合物III-a.NMR(400MHz，THF-d8,320K》8.44(1H，s)，7.68(非常寬的單峰)，7.42(1H，brs)，6.76(1H,d,J=2.5Hz)，5.87(1H,t,J=6.5Hz),5.75(2H,brs),5.31(1H，d,J=10.0Hz),5.06(1H，d，J=6.0Hz)，3.52(1H,dd，J=7.0,4.0)，3.35(3H，s),3.32(3H,s)，3.31(1H,m),3.13(1H，dt,J=8.0,4.0Hz)，2.80(1H,dd，J=14.0,5.5Hz),2.48(1H,dqd，J-IO.O，7.0,6.5Hz),2.44(1H,dd，J=14.0,5.5Hz)，2.31(1H，m)，2.15(1H,m),1.96(1H,m),1.80(3H,s)，1.68(1H，m),L50(3H,s),L40(2H，m),L21(1H，m)，0.99(3H,d,J=6.5Hz)，0.88(3H,d，J=7.0Hz)。13CNMR(100MHz，THF-d8，320K》170.7,157.3，148.6,134,7，133.5,133.4,132.7，131.5,130.2,125.5,120.8,120.4,82.6,81.4，80,9，75.1,58.7,57.0,37.1,35.3,34.6,32.4,30.9,25.2，19.8,17.0,13.4,12.9。HR-ESI-MSm/z575.2479[M+Na]+;C28H410735ClN2Na的計算值為575.2495?；衔颕II-b.ESI-MSm/z567.3;028^14035(:1>^08|>1-11]-的計算值為567.3?；衔颕II-c.ESI-MSm/z551.3;(:28^0350;1]^207[]^-^-的計算值為551.3?；衔颕H-d.NMR(400顧z,THF-d8，330K)58'39(1H，s)，7'96(1H，d，J=1.0Hz),7.25(1H,d,3JH.F=11.5Hz),6.63(1H,s)，5.92(1H，brt,J=7.0Hz),5.70(2H,brs)，5.35(1H,d,J=10.0Hz),5'08(1H，d，J=5.5Hz)，3.51(1H,dt,J=7.0，4.0Hz)3.35(3H,s),3.32(3H,s)，3.32(1H,m)，3.17(1H,d,J=4.0Hz,可交換)，3.15(1H,dt，J=8.0，4.0Hz)，2.75(1H,dd，J=14.0，6.0Hz),2.50(1H，dqd,J=10.0，377.0,6,5Hz),2,44(1H，dd，J=14.0，6.0)，2.32(1H,m)，2.17(1H，m)，L92(1H，dqtd，J=7.5,7.0，6.0,5.5Hz)，L79(3H,d,J=1.0Hz),L66(1H,ddd,J=14.0,8.0,5.5Hz)，L53(3H,d,J=1.5Hz),L47(2H,m)，1.29(1H,ddd，J=14.0,7.5，4.0Hz),0.99(3H，d,J=6.5Hz),0.89(3H,d,J=7.0Hz)。'3C畫R(100MHz,THF-d8，335K》170.5,157.3,152.2(d，Jc_F=235Hz),140.5(d，J。產(chǎn)15Hz)，134.5,133.9(br),132.9，132.4(Jc_F=llHz)，120.9(br)，131.6，131.0,107.2(Jc.F=23Hz)，82.9，81.6，80.9,75.4,58.6,57.1,36.4，35.2，35.1,32.7，30.9,25.3,20.2,16.7，13.3,12.9。HR-ESI-MSm/z559.2806[M+Na]+;C28H4107FN2Na的計算值為559.2790。化合物III-e.ESI-MSm/z551.3;C28H4。FN208[M-H]-的計算值為551.3?；衔颕II-f.ESI-MSm/z535.3;C28H4。FN207[M-H]-的計算值為535.3。ESI-MSm/z531.3;(2291^3]^207[]^-司-的計算值為531.3。HR-ESI-MSm/z525.2950;C2sH42N206Na[M+Na]+的計算化合物化合物III-h值為525.2935?；衔颕ll-i.值為541.2884?；衔?51.3?；衔颕H-k.化合物III-l.化合物III-m.化合物III-n.化合物III-o.化合物III-p.化合物567.3。HR-ESI-MSm/z541.2880;C28H42N207Na[M+Na]+的計算ESI-MSm/z551.3;(:28114035(:^207[]\4-司-的計算值為ESI-MSm/z535.3;C28H4oFN207[M-H]-的計算值為535.3。ESI-MSm/z519.3;C28H4。FN206[M-H]-的計算值為519.3。ESI-MSm/z535.3;C28H4oFN207[M-H]-的計算值為535.3。ESI-MSm/z535.3;<:2811^>1207[1^-司-的計算值為535.3。ESI-MSm/z519.3;C28H4oFN206[M-H]-的計算值為519.3。ESI-MSm/z517.3;C2sH42N207[M-H]-的計算值為517.3。ESI-MSm/z567.3;C28H4iClN208[M-Hr的計算值為化合物IV-a.HR-ESI-MSm/z539.2749;C2sH4oN207Na[M+Na]+的計算值為539.2728?；衔颕V-b.HR-ESI-MSm/z589.2299;C28H3935ClN208Na[M+Na]、々計算值為589.2287。'HNMR(400MHz,THF-d8，335K)S8.37(1H,s),7.98(1H，brs),7.72(1H,brs),6.97(1H，brd,J=11.5Hz),6.46(1H,td，J=11.5，1.5Hz)，5.8-5.2(4H,m),5.00(1H,d，J=1.5Hz)，4.34(1H,d,J=9.5Hz),3.35(1H,m),3.33(3H,s),3.15(3H，s)，2.85(1H,dd,J=13.5,9.0),2.77(1H，m),2.64(1H，dd，J=13.5,3.0Hz),1.88(3H，d,<1.0Hz)，L88(1H,重疊)，1.73(3H，s),0.98(3H,d，J=6.5Hz)，0.93(3H,d,J=7.0Hz)。13C雨R(100MHz,THF-d8,335K)S168.5，157.3,147.8,145.8，137.2，134.9，134.6,133.3，127.3,125.8,122.7,118.2,117,8111.6,82.4，82.1，81.9，75.4,57.0,56.5,36.3，34.1,33.7,30.3，23.2，13.1,12.8，12.7?；衔颕V-c.ESI-MSm/z533.3;(:281"13^&07[1^-11]-的計算值為533.3?；衔颕V-d.ESI-MSm/z515.3;(:28114()>1207[]^-司-的計算值為515.3。實施例13:對癌細胞生長的抑制使用Patel(如上所述)的方法來評價本發(fā)明大環(huán)內(nèi)酰胺抑制癌細胞生長的能力。結(jié)果呈現(xiàn)在表3中。MCF-7、、SKBr3、MX-1、BT-474和NCI/ADR是人乳腺癌細胞系，其中后者對多種藥物是具有抗性的。SKOV3是人卵巢癌細胞系。K-562是人白血病細胞系(慢性髓細胞性白血病或CML)。RPMI-8226是另一種人白血病細胞系(骨髓瘤)。MV-4-11是另一種人白血病細胞系(急性髓細胞樣白血病(acutemyeloidleukemia)或AML)。HCT-116、HT-29和COLO205是人結(jié)腸癌細胞系。為了進行比較，現(xiàn)有技術(shù)化合物17-AAG和17-DMAG的數(shù)據(jù)也包括在本申請中。當測定進行多次時，給出測量值的范圍。表3(A部分)-對癌細胞的抑制活性癌細胞系大環(huán)內(nèi)酰胺(ICso,nM)BT-47421175780HCT-11699-29047120280-290K-5622304074290MX-158594266RPlVn隱822663564266SKBr321-15160-7736-14534-80SKOV3121-332跳190102-170230-237MCF-731-10041-9153-6073-160MV-4-1112-137-8一31-32HT-293117—110COLO205134一38NCI-ADR1,600-3,6001,100-1,600640-1,4003,200-5,000表3(B部分)-對癌細胞的抑制活性癌細胞系大環(huán)內(nèi)酰胺(ICso,nM)III-hm-iIV-arv-bBT-474_一一140HCT-116240-2421,100177840K-562一一_1,40039<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明化合物為對抗癌細胞的生物活性化合物，特別是化合物III-a、III-d和IV-b就對抗所測試的癌細胞系而言如17-AAG和17-DMAG那樣大體上是強效的。實施例14:效力和NOOl活性如上所述，呈醌氧化態(tài)的格爾德霉素衍生物依賴于酶NQOl來將它們還原成它們的氫醌衍生物，從而提高作為Hsp90抑制劑的活性。然而，一些癌細胞在NQOl活性方面是有缺陷的，因此不能實現(xiàn)從醌到氫醌的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺不是NQOl依賴性的，因此仍然可有效地對抗這樣的癌細胞。這種例外通過表4所顯示的結(jié)果而得以確認，其中使用與前述實施例相同的操作，對大環(huán)內(nèi)酰胺m-a、III-d、IV-b、17-AAG和17-DMAG在對抗NQOl缺陷性乳腺癌(MDA-468)細胞和NQ01缺陷性肺癌(NCI-H596)細胞中的抑制效力進行了比較。如數(shù)據(jù)所示，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺是基本上更強效的。表4-對抗NQOl缺陷性癌細胞的活性化合物抑制濃度(ICso，nM)MDA-468NCI-H596I7-AAG1,6001,60017-DMAG1,600700III-a卯190III-d100310IV-b450815不同的實驗得到相同的結(jié)論。在加入或不加入雙香豆素(dicoumarol)(—種已知的NQOl抑制劑)的情況下，就對抗SKBr3和MCF7癌細胞(參見如上所述的實施例12)(這兩種癌細胞都表達NQ01)而言測試了17-AAG、17-DMAG、化合物III-a和化合物III-d。在雙香豆素的存在下，17-AAG和17-DMAG的Hsp90抑制活性降低約一個數(shù)量級，而化合物III-a和III-d的Hsp90抑制活性基本上不變。結(jié)果顯示在表5中。_表5-雙香豆素對抑制活性的影響化合物細胞類型和抑制活性(IC5。，nM:>沒有加入任何雙香豆素加入雙香豆素(50nM)SKBr3MCF7SKBr3MCF74017-AAG395441066217-DMAG3640230882m-a39575469III-d4211269161因此，前述結(jié)果顯示本發(fā)明化合物(特別是化合物III-a、III-d和IV-b).適于在治療高增殖性疾病例如癌癥特別是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病(特別是CML、骨髓瘤和AML)和結(jié)腸癌中使用。實施例15:對客戶蛋白的影響如下確認本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺作為Hsp90抑制劑的活性對暴露于本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺對Hsp90客戶蛋白的影響和當抑制Hsp90時對所誘導的蛋白的影響進行監(jiān)測。當將SKBr3乳腺癌細胞連續(xù)暴露于lpM測試化合物時的結(jié)果呈現(xiàn)在圖5中，其中17-AAG作為參考。所使用的操作描述在Munster等人，CancerResearch2002,62，3132-3137中。ErbB2蛋白是Hsp90客戶蛋白，因此當抑制Hsp90時，ErbB2被間接地抑制(Schnur等人，J.Med.Chem.1995,38(19),3813-3820)。圖5上部的凝膠圖顯示，與17-AAG相似，大環(huán)內(nèi)酰胺m-a和III-d抑制了ErbB2。熱休克蛋白-70("Hsp70")(3—種蛋白質(zhì)，其履行蛋白伴侶(chaperone)功能)是當抑制Hsp90時所誘導的蛋白質(zhì)(Brodsky&Chiosis,CumTopicsMed.Chem.2006,6(11),1215-1225)。因此，對Hsp70的誘導可用作對Hsp90抑制的標記。圖5中部的凝膠圖顯示，Hsp70被大環(huán)內(nèi)酰胺III-a和III-d所誘導，正如其被17-AAG所誘導的那樣。因此，本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酰胺明確地具有與已知Hsp90抑制劑即17-AAG相同的作用機理。(第三行顯示了甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)的濃度。GAPDH是參與糖酵解的酶，在所有細胞中被組成性地(constitutively)表達，并且在WesternBlotting實驗中是作為負載對照(loadingcontrol)而選擇的標記)。本發(fā)明的以上詳細描述包括與本發(fā)明的具體部分或方面主要相關(guān)或?qū)Ｓ邢嚓P(guān)的章節(jié)。應(yīng)該理解的是，這是為了清楚和方便，具體的特征與本發(fā)明相關(guān)的程度可能比披露該特征的章節(jié)所描述的更深入，以及本申請所公開的內(nèi)容包括在不同的章節(jié)所披露信息的所有合適組合。相似地，盡管本申請的各項附圖和描述涉及本發(fā)明的具體實施方案，但應(yīng)該理解的是，當在具體附圖或?qū)嵤┓桨傅纳舷挛闹信毒唧w的特征時，所述特征也可在合適的程度上用在另一附圖或?qū)嵤┓桨傅纳舷挛闹?，與另一個特征組合使用，或在總體上用在本發(fā)明中。4權(quán)利要求1.具有式I所示結(jié)構(gòu)的化合物id="icf0001"file="A2008800099360002C1.tif"wi="96"he="50"top="35"left="76"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>其中X為H、Cl、F或甲氧基；R1、R2和R3獨立地為H或OH；以及R4和R5各自為H，或R4和R5組合形成鍵；條件是(i)R1、R2和R3中的至少一個為H，以及(ii)如下部分不是id="icf0003"file="A2008800099360002C3.tif"wi="73"he="23"top="142"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>2.權(quán)利要求l所述的化合物，其具有式I-a所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.權(quán)利要求l的化合物，其具有式I-b所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.權(quán)利要求1所述的化合物，其中X為Cl或F。5.權(quán)利要求2所述的化合物，其中X為Cl或F。6.權(quán)利要求2所述的化合物，其中式I-a中的如下部分:7.權(quán)利要求l所述的化合物，其具有式III-a所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>8.權(quán)利要求l所述的化合物，其具有式III-d所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>9.權(quán)利要求l所述的化合物，其具有式IV-a、IV-b或IV-c所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>10.—種制備具有式I-c所示結(jié)構(gòu)的化合物的方法:所述方法包括如下步驟(a)向不能產(chǎn)生3-氨基-5-羥基苯曱酸但含有用于合成格爾德霉素的完整基因簇的吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602菌抹的培養(yǎng)物中加入具有式II或II-a所示結(jié)構(gòu)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>以及(b)在產(chǎn)生具有式I-c所示結(jié)構(gòu)的化合物的條件下發(fā)酵所述培養(yǎng)物，其中X為H、Cl、F或曱氧基；R6、117和118獨立地為H或OH;以及W和R"各自為H,或W和RW組合形成鍵；條件是R6、W和RS中的至少一個為H。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中具有式II或II-a所示結(jié)構(gòu)的化合物選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>12.權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(a)中的化合物具有式II所示結(jié)構(gòu)，并且是H02CNH2或H02C13.權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(a)中的化合物具有式II所示結(jié)構(gòu)，并且X為F或C1。14.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602菌株為菌才朱K554-161。15.權(quán)利要求10所述的方法，其中發(fā)酵所述培養(yǎng)物是在吸附樹脂的存在下進行的。16.—種在患有高增殖性疾病的患者中治療所述疾病的方法，所述方法包括向所述患者給藥治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述高增殖性疾病的特征為細胞在NAD(P)H:醌氧化還原酶1活性方面是有缺陷的。18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述高增殖性疾病為乳腺癌、卵巢癌、白血病、結(jié)腸癌或肺癌。19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化合物具有式m-a所示結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化合物具有式III-d所示結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>21.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的化合物和可藥用賦型劑。22.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述化合物具有式III-a所示結(jié)構(gòu)23.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中所述化合物具有式III-d所示結(jié)構(gòu)24.—種抑制耙標細胞增殖的方法，所述方法包括使所述靶標細胞與有效量的權(quán)利要求1所述的化合物接觸。25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述靶標細胞在NAD(P)H:醌氧化還原酶1活性方面是有缺陷的。26.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述靶標細胞是乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、白血病細胞、結(jié)腸癌細胞或肺癌細胞。全文摘要如下制備大環(huán)內(nèi)酰胺向產(chǎn)生格爾德霉素的微生物即吸水鏈霉菌去勢變種NRRL3602的突變株中進料芳族氨基酸作為替換起子單元，其中已經(jīng)將對用于生物合成天然起子單元3-氨基-5-羥基苯甲酸的酶進行編碼的基因簇刪除。文檔編號C12P19/00GK101688227SQ200880009936公開日2010年3月31日申請日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日發(fā)明者加里·阿什利,約翰·R·卡尼,賈尼絲·L·威,雨果·G·門澤拉申請人:科森生物科學公司