專利名稱：使用海藻生產生物燃料的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產生物燃料的方法，更確切地說，一種使用海藻生產生物燃料 的方法。相關領域的描述一般將生物燃料定義為通過直接燃燒、乙醇發(fā)酵和甲烷發(fā)酵等從生物質獲得的能 量。生物質，生物燃料的原料，尤其是對于生物醇，可以歸類為糖基(甘蔗、甜菜等)、淀粉基 (玉米、馬鈴薯、紅薯等)和木基(廢木材、稻草、廢紙等)。糖基生物質可以在比較簡單的 預處理過程后容易地并且直接地轉化成生物乙醇。而淀粉_或木-基生物質需要適當的預 處理過程和糖化過程來產生生物乙醇。廢木材，一種城市廢物，或森林周圍分散的森林副產 物，也可以用作木基生物質。此外，因為它們不具有作為食物的可用性，可以穩(wěn)定地保證原 料需求。然而，對于待用作生物燃料的木基生物質，必須進行消除木質素的預處理，這增加 了生產成本，并且由于纖維素的結晶氫鍵鍵合結構，糖化效率變得非常低。對于在運輸上經濟可行的可替換燃料，生物燃料的價格必須與汽油相競爭。通常， 原料與加工的成本比很大程度上取決于所用生物質的種類。例如，在糖基，如甘蔗和甜菜的 情況中，原料與加工的成本比大約為75 25。同時，在淀粉-基，如玉米、馬鈴薯和木薯的 情況中，比例為約50 50，在木基的情況中，比例大約為25 75。迄今為止用于生物乙醇生產的最常用生物質是糖基和淀粉基的。然而，它們還可 以用作食物，因此，如果食物需求快速增長，這些原料需求應當會受到影響，使得生產成本 在經濟上是不可行的。此外，發(fā)現作物如玉米的栽培需要大量農藥和氮肥，導致環(huán)境問題， 如土壤侵蝕和污染。全世界的生物乙醇生產在2006年達到大約51. 3X IO9升。使用糖基的生物 燃料的生產，尤其是生物乙醇，大約是18. 7X IO9升(在2006年)，并且主要的生產國 家是巴西、印度和臺灣，特別是巴西領導著生產(17. 8 X IO9升)(Global Bioenergy Partnership (GBEP)，2006)。巴西使用大量的甘蔗作為原料積極地生產用于運輸的生物乙 醇，并且因此提供了各種類型的稱為酒精-汽油混合燃料的生物乙醇混合汽油。在2003年， 用可變的生物乙醇/汽油比例運行的FFV(靈活燃料型汽車)開始銷售，并且在2005年5 月，FFV銷售占據全部汽車銷售的大約50%。全世界使用玉米的生物乙醇生產大約是19. 8X109升(在2006年)。并且主要的 生產國家是美國、歐洲和中國，并且特別地，美國是領導國家，其生產18.5X109升生物乙醇 (參見表1)。就在石油危機打擊該國家后，美國在1978年頒布了能源稅法，通過將聯邦稅 降低4$/加侖，將這種含有生物乙醇的石油供應增加高達10%。美國通過利用廣闊的耕地 和大量的原料玉米積極地生產生物乙醇，作為有助于脫離對石油依賴的新&可再生發(fā)展的 努力。作為可替換能量的生物乙醇生產的努力已經是美國的主要策略之一，尤其是，玉米基 生物乙醇生產政策的發(fā)展變得越來越強大和越來越廣泛。在使用木基生物質生產生物燃料中不存在可預測的工業(yè)趨勢，因為它離商業(yè)化仍 然很遠。但是，加拿大的Iogen已經在積極地研發(fā)使用木基生物質來生產生物燃料的技術，并且美國政府將從2007年的預算中持續(xù)增加1. 5 X IO9美元的資金，直至2012年，以使用 下一代生物質如農業(yè)廢物和木質纖維原料來促進生物乙醇生產技術的利用，使得能夠用生 物乙醇替代30%的總運輸燃料。[表 1]根據原料的生物乙醇的經濟價值的比較(源自DOE、EPA、Worldwatch Institute)
玉米基乙醇糖基乙醇木質纖維乙醇全世界產量(1)19. 8X 109(20〇6)18. 7 X IO9 (2006)0產量/單位面積(1/ha)2，5005’ 700-7, 6005，500 (柳枝稷)生產成本($/1) (2007)〇.29-0. 33〇.19-0. 23R&D階段零售價格($/1)汽油:〇.80 E85 0.69 E85 0.981}E25 1.30 ElOO 〇.77 ElOO 1. 03R&D階段能量平衡Ξ)1 1. 31 81 2-36(脫離生產 方法)溫室氣體排放(g/1) (汽油2437. 8)1935. 9 (減少 22% )1075. 5 (減少 56% )227. 05 (減少 91% )1)對應于1升汽油的能量的成本2)生物燃料產量與用于生物燃料生產的供應的化石燃料相比同時，海藻分為大藻類和微藻類。大藻類包括紅藻、褐藻和綠藻，而微藻類包括 小球藻和螺旋藻等。全世界每年海藻產量大約為14X IO6噸，并預期在2020年增加超過 22X 106噸。該產量對應于約23%的海洋養(yǎng)殖總產量。特別地，褐藻，如裙帶菜和海帶，以 及紅藻，如紫菜、石花菜和sea string占至少90%的總海藻產量。韓國的海藻產量目前達 到大約500，000噸/年，這在90年代中期略有下降(大約700，000噸)，但是養(yǎng)殖的總面積 在90年代中期從60，OOOha增至70，OOOha0與其他類型的陸地生物質相比，海藻生長非?？?在亞熱帶地區(qū)可以收獲4-6次/ 年)，并且易于使用廣闊的海洋耕地來養(yǎng)殖，而不需要使用高價的材料，如灌溉水、陸地、肥 料等。使用海藻可以采用簡單的生物燃料生產方法，因為其不含有必須要消除的木質素。 此外，海藻每年的CO2吸收能力的量為36. 7噸/ha，這高于木基的5-7倍。因此，如果使用 E20(含有20%生物乙醇的汽油)，每年的溫室其他減少率將大約是27%，如果將其轉化成 貨幣價值，這將減少大約300 X IO9韓元的碳稅(表2)[表 2]陸地植物和海洋植物的特點
5 因為海藻主要用于精細化工和醫(yī)療材料中，如電泳試劑、肥料、乳化劑、抗癌劑等， 或用于健康食品中，作為食品或藥物，但迄今為止還沒有關于研發(fā)海藻作為生物質用于生 物燃料生產的報道或研究。發(fā)明概述 為了克服常規(guī)生物燃料生產方法中的問題，設計并應用本發(fā)明。確切地，本發(fā)明的 目的是提供使用海洋生物質作為新原料來生產生物燃料的方法，以通過使用海藻替代常規(guī) 生物質如糖_、淀粉_或木-基原料來解決原料需求和供應的不穩(wěn)定性/不平衡以及低糖化 效率的問題。優(yōu)詵實施方案的詳述本發(fā)明使用海藻生產生物燃料的方法包括以下步驟使用水解酶和/或水解催化 劑處理海藻或從海藻中提取出來的多糖來產生單糖；使用微生物來發(fā)酵單糖。在本發(fā)明中，生物燃料包括C1-C4醇或C2-C4酮，并且優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或 丙酮，但不限于此。在此的多糖包括瓊脂、淀粉、纖維蛋白、卡拉膠、藻酸等，但不限于此。本發(fā)明生產生物燃料的方法中所用的海藻沒有限制，并且可以使用選自大藻類和 微藻類的任何一種藻。大藻類包括紅藻、褐藻和綠藻，而微藻類包括小球藻和螺旋藻等。 紅藻例舉石花菜(Gelidiumamansii)、紫菜、Cottonii、Grateloupia lanceolata、圓紫菜 (Porphyrasuborbiculata)、_ € ■ (Pterocladia tenuis)、Acanthopeltis japonica、 鹿角海蘿(Gloiopeltis tenax)、真江籬(GraciIaria verrucosa)、角叉菜(Chondrus ocelatus)、厚膜藻(Pachymeniopsis elliptica)、長枝沙菜(Hypnea charoides)、三叉仙 菜(Ceramium kondoi)、波登仙菜(Ceramium boydenii)、線形杉藻(Gigartina tenella)、 鉤凝草(Campylaephora hypnaeoides)、繁枝娛蟲公藻(Grateloupia filicina)等，但不 限于此。在這些中間，優(yōu)選石花菜。在紅藻中，石花菜具有最多的品種并且呈現出高生長 率。其含有大約15-25 %的纖維，一種纖維素成分，和大約50-70 %的瓊脂，其主要由半乳聚糖組成，并另外含有低于15%的蛋白質和低于7%的脂質，基于總的干重。褐藻例舉裙 帶菜(Undaria pinnatifida)、海帶(Laminaria japonica)、Analipusjaponicus、長松藻 (Chordaria flagelliformis)、|失I丁胃(Ishigeokamurai)、Scytosiphon lomentaria、我鳥腸 ^ (Endarachnebinghamiae)、Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Eisenia bicyclis、 Costaria costata、Sargassum fulvellum、f同■ (Sargassum horneri) Λ ^^^ (Sargassum thunbergii)、羊棲菜(Hitzikia fusiformis)等，但不限于此。褐藻是藻類家族中的多 細胞生物體并且得到充分分化。綠藻例舉石莼(ulva lactuca)、水綿屬、滸苔屬、剌松藻 (Codiumfragile)、Codium minus、Caulerpa okamurai、Nostoc commune 等，但不限于此。 綠藻含有葉綠素，使得它們通過光合作用產生淀粉基。對于褐藻和綠藻的成分，褐藻含有大 約30-40%的藻酸和5-6%的纖維蛋白，而綠藻含有大約40-50%的淀粉和低于5%的纖維 蛋白。瓊脂含有半乳聚糖，其由作為主要成分的半乳糖聚合物組成。半乳聚糖通過適當 的解聚作用可以轉化成單糖，如半乳糖和3，6_脫水半乳糖。纖維蛋白由纖維素組成，其占 據大約15-25%的石花菜總成分。使用適當的酶或酸催化劑，通過糖化，纖維素轉化成葡萄 糖(一種單糖)。半乳糖和葡萄糖可以用作生物燃料的底物，其通過發(fā)酵可以轉化成生物燃 料。通常將淀粉稱為糊精，其是通過光合作用在植物的葉綠體中合成并存儲在其中的 碳水化合物。淀粉是由葡萄糖組成的多糖，使用適當的酶或酸催化劑，通過糖化，其可以轉 化成葡萄糖(一種單糖)。從海藻提取多糖如瓊脂、纖維蛋白、淀粉、卡拉膠、藻酸等的方法不受限制，并且 可以接受本領域技術人員已知的任何一種方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將海藻在 堿水溶液中浸泡一會兒，用水清洗，然后浸泡在含有酸試劑的提取緩沖液中，接著從其提 取瓊脂、卡拉膠和藻酸。然后，收集剩余的纖維蛋白和淀粉。提取溫度不受限制，但優(yōu)選 80-150°C。在此所用的酸試劑選自 H2S04、HCl、HBr、HN03、CH3C00H、HC00H、HC104(高氯酸)、 H3PO4(磷酸)、PTSA(對-甲苯磺酸)和常用的固體酸，但不限于此。堿水溶液選自氫氧化 鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣和氨水溶液，但不限于此。通過用適當的水解酶和/或水解催化劑處理這些多糖，通過多糖如瓊脂、淀粉、纖 維蛋白、卡拉膠和藻酸的糖化可以獲得單糖。在此的單糖是半乳糖、3，6_脫水半乳糖、葡萄 糖、巖藻糖、鼠李糖、木糖和甘露糖等，但不限于此。在此的糖化過程可以是直接糖化或間接糖化。在下文中，將詳細描述這兩種糖化 方法和使用由此獲得的水解產物發(fā)酵生產生物燃料的方法。首先是間接糖化的實例，其使用瓊脂作為起始原料。瓊脂含有半乳聚糖(半乳糖 聚合物)作為主要成分。半乳聚糖轉化成單糖，如半乳糖和3，6_脫水半乳糖，其可以通過 適當的發(fā)酵過程來發(fā)酵。同時，用于糖化的方法是酸水解或酶水解。酸水解是使用酸水解 催化劑將半乳聚糖轉化成低分子的方法。在此的催化劑選自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3C00H、 HC00H、HC104、H3P04、PTSA和常用的固體酸?？梢哉{節(jié)所用酸的濃度以及溫度和反應時間來 最大化半乳糖的生產效率，并且同時優(yōu)選沒有過度水解新產生的半乳糖。使用酶糖化瓊脂 的方法沒有和酸水解一樣有效，但是一旦選擇了最佳的半乳糖苷酶組，可以提高轉化產量。 能夠水解半乳聚糖的酶是β-瓊脂水解酶或β-半乳糖苷酶，但不限于此。β-瓊脂水解酶可以獲自大西洋假單胞菌(Pseudomonas atlantica)或大腸桿菌，而β _半乳糖苷酶可以 獲自米曲霉(Aspergillus oryzae)或牛的睪丸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，對于瓊脂， 使用 0. 05-30%濃度的水解催化劑，如 H2S04、HCl、HBr、HN03、CH3C00H、HC00H、HC104、H3PO4 或 PTSA，通過在60-200°C進行水解0-6小時，從瓊脂獲得單糖。在此是使用纖維蛋白作為起始原料的另一種間接糖化。纖維由纖維素組成，其可 以通過使用水解酶和/或酸水解催化劑的水解轉化成葡萄糖。已知大約有52種不同的商 業(yè)酶用于水解纖維素，并且在這些中，優(yōu)選商業(yè)的半乳糖苷酶(生長株海棲熱袍菌 (Thermotogamaritima)和內 _1，4_β -葡聚糖酶(生產株黑曲霉(Aspergillus niger)、 長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)、里 氏木霉(Trichoderma reesei)和綠色木霉(Trichoderma viride)，但不限于此。在此的催 化劑可以選自 H2S04、HCl、HBr、HN03、CH3C00H、HC00H、HC104、H3P04、PTSA 和常用的固體酸?？?以調節(jié)所用酸的濃度以及溫度和反應時間來最大化葡萄糖的生產效率，并且同時優(yōu)選沒有 過度水解新產生的葡萄糖。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，對于纖維，使用0. 05-50%濃度的水 解催化劑，如 H2S04、HCl、HBr, HNO3> CH3COOH, HC00H、HClO4, H3PO4 或 PTSA，通過在 80_300°C 進行水解0-6小時，從纖維獲得單糖。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，通過水解酶介導 的反應0-144小時從纖維蛋白獲得單糖。間接糖化的另一個實例是使用淀粉作為起始原料。淀粉由葡萄糖組成，因此可 以使用水解酶和/或酸水解催化劑通過水解容易地轉化成葡萄糖。水解淀粉的商業(yè)酶例 舉淀粉酶，但不限于此。淀粉酶是水解多糖的酶，其主要作用于由α-連接的葡萄糖組成 的多糖，如糊精(淀粉酶和支鏈淀粉)或糖原。根據工作原理，將酶分成三類，如α-淀 粉酶、β-淀粉酶和葡糖淀粉酶?？梢援a生淀粉酶的微生物例舉米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉、米根霉(Rhizopus oryzae)、釀酒酵母(Saccharomyce s cerevisiae)、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、灰色鏈霉菌 (Streptomycesgriseus)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，但不限于此。能夠水解淀 粉的催化劑選自 H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HC00H、HClO4、H3PO4^PTSA 和常用固體酸。可 以調節(jié)所用酸的濃度以及溫度和反應時間來最大化葡萄糖的生產效率，并且同時優(yōu)選沒有 過度水解新產生的葡萄糖。同時，直接糖化包括水解直接來自作為起始原料的含有纖維蛋白和/或瓊脂和卡 拉膠的海藻或含有淀粉和/或藻酸和纖維的海藻的程序。當時，可以使用酶水解或酸水解。 對于酶水解，重要的是選擇合適的酶用于有效的水解，因為海藻的主要底物是半乳聚糖和 纖維蛋白；或卡拉膠和纖維蛋白；或藻酸和纖維；或淀粉和纖維蛋白，并且將該成分轉化成 葡萄糖的酶機理可能不同于將原料轉化成半乳糖和3，6_脫水半乳糖的酶機理。可以同時 使用兩種或多種酶。例如，綠藻含有兩種不同的多糖，如淀粉和纖維蛋白，使得優(yōu)選使用含 有能夠水解淀粉的一種酶和能夠水解纖維的另一種酶的酶組。對于酸水解，酸水解催化劑 不受限制并且可以使用如上所述的間接糖化中所用的任何水解催化劑?？梢哉{節(jié)所用酸的 濃度以及溫度和反應時間來最大化葡萄糖和半乳糖的生產效率，并且同時重要的是沒有 過度水解新產生的單糖。對于使用原始海藻作為起始原料的糖化，優(yōu)選將海藻清洗以除去 雜質，然后通過熱空氣或天然空氣干燥來徹底干燥。通過使用生料磨將干燥的海藻粉碎，以 獲得細粉。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，對于海藻，使用0.05-50%濃度的水解催化劑，如
8H2SO4,HCl,HBr,HNO3>CH3COOH,HC00H,HClO4,H3PO4 或 PTSA，通過在 60_300°C進行水解 0-6 小 時，從原始海藻獲得單糖。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，通過多步糖化從原始海藻中 獲得單糖，其中對于海藻，使用0. 05-50%濃度的選自H2S04、HCl、HBr、HN03、CH3C00H、HC00H、 HClO4, H3PO4, PTSA和常用固體酸的水解催化劑在60-300°C進行0_6小時的第一次水解，然 后在如上的相同條件下用剩余的纖維或淀粉進行第二次和第三次糖化。可以使用用于生物燃料發(fā)酵的微生物如酵母將含有所產生的半乳糖、3，6_脫水 半乳糖、葡萄糖或其糖混合物的水解產物轉化成生物-乙醇?？梢杂糜诒景l(fā)明中的用于 發(fā)酵的酵母是丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、金黃丁 酸梭菌(Clostriduim aurantibutylicum)和假破傷風梭菌 (Clostridium tetanomorphum)等，但不限于此，并且它們優(yōu)選用于丁醇或丙酮發(fā)酵。還可 以使用酵母，如酉良酒酵母(saccharomycesserevisiae)、胃八疊菌(Sarcina ventriculi)、 脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis) 、 Zygomomonas mobilis、馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus) IMB3和卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)等，并且 這些酵母特別優(yōu)選用于乙醇發(fā)酵。在許多生物燃料中，生物丁醇具有與汽油相似的特征，其滿足能量密度、揮發(fā)性、 高辛烷值和低雜質率等。含有約10%生物丁醇的混合燃料證明了與汽油相似的能力。并 且，生物丁醇的能量密度非常接近無鉛汽油的。與生物-乙醇不同，生物-丁醇甚至在水存 在下也沒有相分離，并且具有低氧含量，提供了高濃度的生物-丁醇混合物，這有助于高濃 度的生物-丁醇與汽油的結合。附圖簡述

圖1是水解裝置的示意圖。(a)間歇反應器，(b)取樣氣門，(C)壓力計，(d)氮氣 調節(jié)器，(e)氮氣彈，(f)控制箱，(g)氮儲氣瓶。圖2是顯示瓊脂糖結合結構的化學式。圖3是顯示使用瓊脂作為底物時反應溫度對半乳糖產量影響的圖。實驗條件底 物 IOg, 1% H2SO4 400ml 30 分鐘。圖4是顯示使用瓊脂作為底物時取樣溫度對半乳糖產量影響的圖。實驗條件底 物10g，在達到相應溫度點時H2SO4 400ml。圖5是顯示使用纖維素作為底物時吐504濃度對葡萄糖產量影響的圖。實驗條件 底物 20g，200°C。圖6是顯示使用石花菜作為底物時反應溫度和反應時間對單糖產量影響的圖。 (A)葡萄糖產量，(B)半乳糖產量，(C)葡萄糖+半乳糖產量。實驗條件底物22g,l% H2SO4 400ml ο圖7是顯示使用石花菜作為底物時反應溫度和反應時間對單糖產量影響的圖。 (A)葡萄糖產量，(B)半乳糖產量，(C)葡萄糖+半乳糖產量。實驗條件底物40g，H2SO4 400ml ο圖8是顯示使用石花菜作為底物時反應溫度和反應時間對單糖產量影響的圖。 (A)葡萄糖產量，(B)半乳糖產量，(C)葡萄糖+半乳糖產量。實驗條件底物60g，H2SO4 400ml ο圖9是使用石花菜作為底物時S/L比例對半乳糖產量影響的圖。實驗條件H2SO4 400ml，120 °C，4h。圖10時顯示使用石花菜作為底物時H2SO4濃度對單糖產量影響的圖。(A)葡萄糖 產量，(B)半乳糖產量，(C)葡萄糖+半乳糖產量。實驗條件底物60g，150°C，4h。圖11是顯示使用石花菜作為底物時酸類型對單糖產量影響的圖。(A)葡萄糖產 量，(B)半乳糖產量，(C)葡萄糖+半乳糖產量。實驗條件底物7. 5g，l% H2SO4, 200ml， 121°C，15 分鐘。圖12是顯示使用石花菜作為底物時水解數目對單糖產量影響的圖。實驗條件 1% H2SO4,121°C, 15 分鐘。圖13是顯示在各種葡萄糖濃度下釀酒酵母生長曲線的圖。(A)1.0%，(B)2.0%， (C) 5. 0%。圖14是顯示在各種半乳糖濃度下釀酒酵母生長曲線的圖。(A)1.0%，(B)2.0%， (C) 5. 0%。圖15是顯示在各種葡萄糖濃度下卡斯酒香酵母生長曲線的圖。(A)1.0%， (B) 2. 0%, (C)5. 0%。圖16是顯示在各種半乳糖濃度下卡斯酒香酵母生長曲線的圖。(A)1.0%， (B) 2. 0%, (C)5. 0%。圖17是顯示使用混合糖通過釀酒酵母的乙醇生產的圖。圖18是顯示使用混合糖通過卡斯酒香酵母的乙醇生產的圖。圖19是顯示使用水解產物通過釀酒酵母的乙醇生產的圖。圖20是顯示使用水解產物通過卡斯酒香酵母的乙醇生產的圖。
實施例如以下實施例中所示的，說明了本發(fā)明的實際的和目前優(yōu)選的實施方案。然而，應當知道鑒于該公開內容，本領域技術人員可以在本發(fā)明的精神和范圍內 進行改變和改進。在本發(fā)明中，使用如下的糖化裝置、材料和分析方法來進行實驗。1.糖化裝置圖1中描述了用于糖化實驗的裝備有反應器和控制箱的糖化系統(tǒng)。反應器設計為 具有500ml體積的圓柱形反應器(有效體積400ml)，并具有12. 5cm的內部高度和7cm的 內部直徑。溫度夾套與其連接，以將反應溫度調節(jié)至指定的溫度。將熱電偶裝備在其上，以 測量反應器的內部溫度。為了防止過熱，設計冷卻水來反應器外部循環(huán)。為了在反應過程中 易于取樣，從反應器外部注入高壓N2氣體，為此，將N2氣體罐和取樣氣門裝備在其上。同 時，將控制箱裝備上RPM計、數字溫度調節(jié)器和壓力計。2.材料2. 1.底物在實施例中，將來自摩洛哥的石花菜，來自濟洲島的石花菜，marine string和 Cottonii用作紅藻，而將刺松藻用作綠藻。此外，將海帶用作褐藻。在實施例中，通過兩種不同的方法來進行實驗；一種是使用石花菜作為原料的直 接糖化，而另一種是使用從石花菜分離/提取的纖維和瓊脂作為原料的間接糖化。對于直接糖化，用蒸餾水洗滌石花菜，在40°C干燥，接著粉碎，并用106或300目篩網過濾。對于 間接糖化，從石花菜中提取出瓊脂，將石花菜浸泡在KOH水溶液中一會，并用蒸餾水洗滌， 接著使用蒸餾水或乙醇或甲醇提取出瓊脂，在40°C干燥并粉碎。提取瓊脂后，用O3將剩余 的纖維漂白兩次(1小時/升次漂白)，然后用CIO2在60°C再漂白兩次(1. 5小時/升次漂 白)，然后用H2O2在80°C再漂白兩次(1小時/升次漂白)，以獲得分離的纖維。2. 2.菌株和培養(yǎng)基在實施例中，使用釀酒酵母DKIC413和卡斯特酒香酵母H1-39 (韓國微生物培養(yǎng)中 心，KCCM 11490)，并選擇YEPD (酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)作為培養(yǎng) 基。將培養(yǎng)基在高壓滅菌器(Woosung Scientific Co.，韓國)中在121°C下滅菌15分鐘。2. 3.酶實施例中所用的酶是可購得的，并購自Biosys Co.，韓國。通過濃縮里氏木霉培養(yǎng) 液制備的Celluclast是一種將纖維素水解成葡萄糖和纖維二糖的纖維素酶。通過濃縮刺 孢曲霉培養(yǎng)液制備的Viscozyme是含有纖維素酶、β -葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶的 酶復合物。Spirizyme和AMG(Amylo Glucosidase)是產自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶，其是 通過α-淀粉酶和異淀粉酶將轉化自淀粉的麥芽糖寡聚物水解成葡萄糖。通過濃縮脆壁克 魯維酵母培養(yǎng)液制備的Lactozyme是一種將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的乳糖酶。每種酶 的功能和水解條件示于表3中。[表 3]酶特性和水解條件
酶特性水解條件活性目的Celluclast纖維素水解PH4. 5-6. 0,溫度50-60"C700EGU"/g纖維素水解Viscozyme纖維素、木聚糖、半纖維素水解PH3. 3-5. 5，溫度:25-55°CIOOFBG2Vg瓊脂水解Spirizyme淀粉、麥芽糖水解PH4. 2-4. 5,溫度60-63"C40 OAG3Vg瓊脂水解AMG淀粉、麥芽糖水解PH4. 5,溫度60°C300AG/g瓊脂水解Lactozym乳糖水解PH6. 5,溫度37°C3000LAU4)/ml瓊脂水解1) E⑶內-葡聚糖酶單位2) FBG:真菌葡聚糖酶單位3)AG:lymol 麥芽糖 / 分鐘4) LAU Immol 麥芽糖 / 分鐘3.分析方法3. 1.糖分析用裝備檢流器的HPLC(ICS-3000，Dionex Co.，USA)分析水解產物。同時，將 Carbopac PA 1(4250mm,Dionex Co. ，USA)禾口 Carbopac PA 1(450mm, Dionex Co. ，USA)用 作柱子。作為移動相，使用16mM NaOH溶液。流速為Iml/分鐘，并且柱溫為30°C。使用標 準材料的校正曲線來定量葡萄糖和半乳糖的濃度。根據式1來計算葡萄糖和半乳糖的產 量，表示所產生的葡萄糖和半乳糖與原料總干重的比例。[式1]產量(％) = CXV/SX100C =葡萄糖或半乳糖的濃度(g/1)V =用于糖化的溶劑總量(1)
S =用于糖化的底物(蛋白質、纖維、葡聚糖等)總量(g)3.2.蛋白質分析(半-微Kieldahl方法)為了分析蛋白質樣品，將0. 5g蛋白質樣品置于蛋白質分解管中，向其中加入20ml 硫酸和5g蛋白水解促進劑(K2SO4 CuSO4 · 5H20 = 9 1)，接著分解蛋白。完成分解時， 向其中加入70ml蒸餾水。將75ml 32%的NaOH加入蒸餾器中，接著使用蛋白質蒸餾裝置來 蒸餾。用IOOml 3%硼酸收集通過蒸餾產生的氨，并用0. IN HCl滴定。通過式2計算總氮含量。[式2]蛋白質含量(％)=0. 0014X (V1-Vtl) XfXN/S XlOOV0 =空白樣品的0. IN HCl消耗(ml)V1 =樣品的 0. IN HCl 消耗(ml)f = 0. IN HCl 系數N =氮系數s =樣品量(mg)0. 0014 對應于 Iml 0. IN HCl 的氮量(g)3. 3.灰分分析(干灰化方法)將坩鍋在550°C爐子中加熱，直至其達到恒重，接著在干燥器重冷卻并測量。將2g 樣品置于測量的坩鍋中，接著在550°C爐子中灰化，直至其轉變成白色或灰色的灰分。然后 將灰分在200°C的爐子中冷卻，然后轉移至干燥器中，接著在室溫中再次冷卻。通過式3計 算灰分含量(％)。[式3]灰分(％) = (Wo-ff^/SXlOOW1 =坩鍋的恒重(g)W0 =灰化后的坩鍋+灰分的重量(g)S =樣品重量(g)3. 4.細胞濃度的測量使用分光光度計(Genesys10-S，Thermo electron corp.，USA)在 600nm 測量細 胞濃度。隨著時間進行培養(yǎng)液的取樣，接著使用離心機(VS-150FN，Vision Science Co., LTD.，韓國)在3，500rpm離心10分鐘。用蒸餾水洗滌沉淀物，并再次離心。將沉淀物在 50°C干燥24小時，接著測量干燥樣品的重量。通過以下等式計算釀酒酵母的干細胞重干 細胞重=0. 31350D+0. 1811 (校正系數=0. 994)，而通過以下等式計算卡斯酒香酵母的干 細胞重干細胞重=0. 12920D+0. 8554 (校正系數=0. 999)。3.5.乙醇分析通過裝備有RI檢測器的HPLC (Breeze HPLC系統(tǒng)，Waters Co.，USA)測量發(fā)酵培 養(yǎng)液中的乙醇濃度。同時，將Aminex HPX-87H(3007. 8mm，Bio_rad)用作柱子。將5mM硫酸 水溶液用作移動相，并且流速為0. 6ml/分鐘，并將柱子和RI檢測器的溫度設定在50°C。使 用標準材料的校正曲線來定量乙醇含量。實施例1 不同海藻中纖維蛋白和半乳聚糖組成的分析將0. 3g海藻(來自摩洛哥的石花菜，來自濟洲島的石花菜，marinestring,Cottonii，刺松藻，裙帶菜或紫菜)和3ml 72%硫酸溶液加入玻璃管中，接著在30°C反應 2小時(第一次水解)。反應完成時，將反應混合物置于250ml瓶中，向其中加入84ml蒸餾 水，接著在高壓滅菌器(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韓國)中121°C下水解1小 時(第二次水解)。第二次水解完成時，當內部溫度50°C時，取出瓶子，然后冷卻至室溫。 從瓶中取出Iml反應混合物，并用CaCO3中和，接著使用離心機(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韓國)在8，OOOrpm離心10分鐘來除去CaSO40計算纖維和半乳聚糖的組成。如表4中所示，盡管它們是相同的海藻種，但發(fā)現根據生長位置，其組成是不同 的。確切地，石花菜(來自摩洛哥或濟洲島，韓國)中的碳水化合物含量最高，為70-80%，而 群帶菜中最低(40%)。非碳水化合物(蛋白質、脂質等)的含量在裙帶菜中最高(59%)， 而在石花菜(來自摩洛哥或濟洲島，韓國)中最低，為20-28%，這表明石花菜(紅藻中的一 種)具有作為乙醇生產的良好原料的最高潛能。因此，該實驗后，選擇來自摩洛哥的具有相 對高碳水化合物含量的石花菜作為糖化/發(fā)酵的底物。[表4]海藻的化學組成
海藻纖維素 (%)半乳聚糖(％)(碳水化合 物)(％)蛋白質 (%)其他(脂質， 灰分)(％)紅藻石花菜’ 摩洛哥16.855.2 (Gal:28% , AHG:27% )72.021.16.9石" *菜， 濟洲島23.056.479.411.88.8江籬19.754.474.111.014.9Cottonii7.143.450.54.944.6綠藻刺松藻10.947.858.734.76.6褐藻裙帶菜2.438.741.124.234.7海帶6.740.046.712.238.1實施例2 糖化實驗<2~1>通過酸水解的糖化將75g底物和硫酸水溶液加入41錐形燒瓶中，接著在121°C反應15分鐘。然 后，將溫度降至室溫，并用CaCO3中和水解產物。在分開的實驗中，使用離心機(VS-150FN， Vision Science Co.，LTD.，韓國)在8，OOOrpm進行離心10分鐘來除去CaS04。根據S/L 比將底物(5. 5-15. 0% )和硫酸水溶液(0. 5-4.0% )加入高壓反應器中，接著在指定的溫 度(80-200°C )糖化所需的時間(0-4小時)。在每個特定的時間和完成反應時取出樣品用 于分析，將反應器的溫度降至室溫，接著取樣用于分析。用CaCO3中和所有樣品，接種離心 來除去 CaSO4。使用離心機(VS-150FN, Vision Science Co.，LTD.，韓國)在 8，OOOrpm 進 行離心10分鐘。結果如下。
<2-1-1>使用瓊脂(石花菜)的糖化將干燥的瓊脂用作底物，并在反應完成時，將根據不同反應溫度的糖化產量相互 比較。因為底物是瓊脂，可生產的單糖是半乳糖和3，6-脫水半乳糖(3，6-AHG)(圖2)。但 是，只選擇容易發(fā)酵的單糖(其是半乳糖)來計算產量。將IOg底物和400ml硫酸水溶液 加入500ml反應器中，接著在80-120°C反應30分鐘。反應完成時，將溫度降至室溫，并中和 水解產物，用HLPC(ICS-3000，Dionex Co.，USA)分析。圖3說明了在不同反應溫度下從瓊 脂產生的半乳糖產量。隨著反應溫度從80°C升至120°C，半乳糖產量增加。但是，在150°C 時產量下降，這表明即使半乳糖產量隨著反應溫度升高而增加，但一旦溫度超過上限，所產 生的糖隨著時間變成分解的，導致產量下降。因此，在溫度達到150°C之前，需要取出樣品來 檢測反應過程中的產量。并且溫度達到120，140和150°C時，進行取樣。圖4說明了在120，140和150°C的溫度下從瓊脂產生的半乳糖產量。隨著反應 溫度的升高，半乳糖產量增加，并且當溫度達到150°C時，產量最高(37. 1%，基于半乳糖 74. 2% )。反應溫度降至室溫后，產量下降(32. 8% )，表明產生的糖在冷卻過程中分解了。<2-1-2>使用纖維蛋白的糖化在更嚴格的條件下水解纖維蛋白。通常，甚至應當在200-240°C下水解纖維的晶體 結構。在該實施例中，鑒于以上所述的，將反應溫度設定為200°C，并且將0. 5-4. 0%硫酸用 作催化劑來比較隨著催化濃度的糖產量。將20g底物和400ml硫酸水溶液加入反應器中， 接著糖化1小時。圖5是說明了隨著催化劑濃度從纖維產生的葡萄糖產量的圖，在200°C的 反應溫度下測量。如圖5中所示的，產量隨著硫酸濃度的增大而降低。特別地，使用4. 0%時，產量僅 為0. 1%。使用2.0%硫酸的產量為2.6%，使用1.0%硫酸水溶液的產量為12.3%，而發(fā)現 使用0.5%硫酸的產量為15.8%。<2~2>酶促水解將底物(瓊脂1. lg，纖維-.2. 5g)和IOOml蒸餾水在250ml錐形燒瓶中混合。根據 選定的酶來調節(jié)PH。加入Iml每種酶后，在適于選定的每種酶的反應條件下通過在IOOrpm 混合來進行糖化。在反應過程中以規(guī)律的時間間隔取出樣品，并使用離心機(VS-150FN， Vision Science Co.，LTD.，韓國)在3，OOOrpm將樣品離心5分鐘，并分析所獲得的上清液。使用纖維蛋白作為底物進行糖化，使用2. 5%的最初底物濃度，持續(xù)144小時。如 表5中所示的，從糖化得到的葡萄糖濃度為11. 6g/l，表明大約46%的纖維蛋白轉化成葡萄 糖?？焖僬T發(fā)糖化持續(xù)頭3個小時，然后反應變慢，但恒定。鑒于纖維蛋白通過酸水解成葡 萄糖的最大轉化率為15% (圖7)，認為通過纖維素酶的糖化是非常有效的。含有至少瓊脂的溶液非常粘。因此，使用1. 最初底物濃度進行使用瓊脂作 為底物的糖化，持續(xù)144小時。作為水解酶，考慮到經濟效益，使用了淀粉分解酶、麥芽糖酶 和乳糖酶的商業(yè)化混合物。因此，如表6中所示的，發(fā)現包括淀粉酶的淀粉水解酶在瓊脂 水解中是無效的，并且認為在早期反應階段中檢測到的半乳糖是從瓊脂組合物分離過程中 分離出來的游離半乳糖單體。[表5]通過酶糖化來自作為底物的纖維蛋白的葡萄糖濃度
[表 6]通過酶糖化來自作為底物的瓊脂的半乳糖濃度 <2~3>盲接糖化<2-3-1>溫度和時間的影響<2-3-l~l>S/L 比例 5. 5%將22g來自摩洛哥的石花菜(底物)與400ml 1 %硫酸水溶液混合，接著在 120-150°C糖化4小時。使用5. 5%的S/L比例，觀察隨著反應溫度和時間的葡萄糖、半乳糖 和葡萄糖+半乳糖(單糖)產量。結果，如圖6中所示的，葡萄糖和半乳糖在140°C呈現出 最高的產量(葡萄糖4.8%，半乳糖33.7%，單糖38.5% )，并且在120°C下產量隨著反 應時間而增加。在150°C下，反應15分鐘后，半乳糖的產量快速下降。<2-3-l~2>S/L 比例 10. 0%將40g來自摩洛哥的石花菜(底物)與400ml 1 %硫酸水溶液混合，接著在 120-150°C糖化4小時。圖7是說明了在10. 0%的S/L比例下隨著反應時間和溫度的葡萄 糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(單糖)產量的圖。在150°C下，葡萄糖和半乳糖的產量都是 最高的，并且發(fā)現產生最高產量的反應時間為15分鐘(葡萄糖4. 7%，半乳糖29. 8%，單 糖34· 5% )。<2-3-l~3>S/L 比例 15. 0%圖8是說明了使用15.0%的S/L比例(底物60g，l%硫酸水溶液400ml)隨著反 應時間和溫度的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(單糖)產量的圖。在15. 0%的S/L比 例，最高產量的反應溫度和時間是150°C和0-15分鐘(葡萄糖4.0%，半乳糖22.0%，單 糖26. 0% )。在120-140°C 30分鐘后，水解幾乎沒有下降，這S/L比例為10. 0%時的結果
相一致。<2-3~2>S/L 比例的影響圖9說明了在不同的S/L比例下在120°C糖化4小時得到的半乳糖產量。為了最小化S/L比例和反應溫度影響產量的因素，比較了最低反應溫度(120°C )的結果。因為葡 萄糖的產量太低，以致未考慮，圖9中只顯示了半乳糖產量，表明5.5%的S/L比例顯示出最 高的半乳糖產量。那些在10. 0%和15. 0%的S/L比例具有相似的產量(11 13% )。<2~3~3>酸濃度的影響為了比較使用石花菜作為底物時根據催化劑濃度的單糖產量，將60g底物與 400ml 0. 5-1. 25%硫酸溶液混合，接著在150°C糖化4小時。如圖10中所示的，用1. 0%硫 酸溶液進行糖化0-15分鐘時，葡萄糖的產量為4. 0%，而半乳糖的產量為22. 3%，這是最 高的，但15分鐘后，產量下降。用0. 75-1. 25%硫酸溶液進行糖化時，一個小時后產量開始 下降。使用0.5%硫酸溶液時，產量隨著時間沒有太多不同。使用0.75%或1.25%硫酸溶 液時，兩者之間的產量幾乎相同，并且使用0. 5%硫酸溶液時，產量最低。<2~3~4>酸種類的影響為了比較根據酸種類的所產生的單糖產量，將7. 5g來自摩洛哥的石花菜和200ml 的硫酸、鹽酸、硝酸和醋酸水溶液放入250ml錐形燒瓶中，接著在高壓滅菌器中在121°C
下糖化15分鐘。圖11顯示了使用上述催化劑的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(單糖) 的產量。特別地，將醋酸用作催化劑時，沒有誘發(fā)水解，這表明醋酸對于酸水解不是合適的 催化劑。而將硫酸用作催化劑時，半乳糖和葡萄糖的產量都高。<2~4>多步驟糖化在之前的實驗中，證實了發(fā)現用于產生半乳糖和葡萄糖的水解條件是彼此不同 的。特別地，用于水解瓊脂產生半乳糖的條件與用于纖維產生葡萄糖的條件相比要溫和得 多。還證實了使用分離自石花菜的纖維和瓊脂誘發(fā)的糖化時比用石花菜直接誘發(fā)時，所產 生單糖的產量要高得多。因此，如果通過改進方法來最大化糖化效率，將最大化乙醇的產量。在該實施例中，將7. 5g來自摩洛哥的石花菜與200ml 硫酸水溶液在250ml錐 形燒瓶中混合，接著在高壓滅菌器中在121°C下糖化15分鐘，并且逐步進行反應，如第一 次、第二次、第三次和第四次糖化。研究隨著步驟的葡萄糖提取率以及葡萄糖和半乳糖的產 率。因此，如表7和圖21中所示的，第一次糖化后的提取率為78.0% (石花菜中的纖維蛋 白含量17%，鑒于纖維蛋白含量來計算產率，并且呈現為與原料總量的比例)。第二次糖 化后的半乳糖產率為29. 6%，當沒有考慮原料的總量而是只考慮可水解成半乳糖的成分 (28%，表4)時，產率升至105. 7% (為什么產率超過100%的原因一些3，6-AHG轉化成半 乳糖)。幾乎提取了石花菜的所有半乳糖。通過此后重復的糖化沒有提高第一次糖化后的 葡萄糖產率，表明沒有再誘使纖維蛋白的水解。在上述反應條件下直至第二次糖化，繼續(xù)有 效地進行著瓊脂糖化至半乳糖以及從石花菜中分離纖維蛋白的過程。如果通過酸水解或酶 水解可以提高來自分離纖維蛋白的葡萄糖產率，多步驟糖化可以有效地用作能夠最大化單 糖產量的最佳方法。[表 7]使用石花菜作為底物時水解次數對單糖產量的影響(條件l%H2S04，12rC，15分
鐘) 實施例3 乙醇產牛菌株培養(yǎng)物<3~1>菌株的特征<3-1~1> 釀酒酵母為了研究乙醇產生酵母(釀酒酵母)的生長模式和糖吸收，將葡萄糖和半乳糖用 作培養(yǎng)物的碳源。同時，用1 %、2 %和5 %的不同碳源濃度來進行培養(yǎng)。圖13說明了在1 %、 2 %和5 %的不同濃度下使用葡萄糖時，釀酒酵母的生長曲線和糖。圖14說明了在1 %、2 % 和5%的不同濃度下添加半乳糖時，釀酒酵母的生長曲線和糖吸收。隨著碳源濃度的提高， 細胞濃度提高。在最高的碳源濃度(5%)下，酵母的生長率低于所預期的。與碳源濃度無 關，在24小時內消耗了所有葡萄糖，而在48小時內消耗了所有半乳糖。葡萄糖的消耗比 半乳糖的消耗快，但是將半乳糖用作碳源時，酵母的生長使用葡萄糖時的高。<3-1~2>卡斯酒香酵母使用與用于釀酒酵母培養(yǎng)的相同碳源和濃度研究了另一種產乙醇酵母卡斯酒香 酵母的生長模式和糖吸收。結果，如圖15和圖16中所示的，菌株的濃度隨著碳源濃度的升 高而升高，并且將半乳糖用作碳源時，發(fā)現使用5%半乳糖時，酵母的菌絲體濃度最高。該結 果與釀酒酵母的相一致。還一致的是在卡斯酒香酵母的情況中，與碳源濃度無關，葡萄糖消 耗快于半乳糖消耗，確切地，在12小時內消耗了所有葡萄糖，而在18小時內消耗了所有半 乳糖，表明糖吸收速度是釀酒酵母的兩倍。菌株的生長速率也比釀酒酵母的快。<3~2>乙醇發(fā)酵釀酒酵母和卡斯酒香酵母，是保存在固體培養(yǎng)基中的酵母，使用接種環(huán)將其接種 于含有100ml YEPD的250ml錐形瓶中，接著分別在37°C或30°C下在150rpm預培養(yǎng)24小 時。在將25%的預培養(yǎng)物溶液接種于150ml (如果接種于發(fā)酵罐中，體積為2. 51)含有混合 糖或水解產物(1-20% )和蛋白胨15%，酵母提取物15%和硫酸鎂0. 5%的培養(yǎng)基中后，在 37°C或30°C下在初始pH5. 0-5. 5下進行主培養(yǎng)48小時。<3-2-1>使用混合糖的發(fā)酵石花菜在高壓滅菌器中在121°C下第一次糖化15分鐘后，半乳糖濃度為 0. 8-0. 9%，而葡萄糖濃度為0. 03-0. 05%。在該實施例中，使用與水解產物相同的濃度以 及相同的比例(半乳糖/葡萄糖)來制備混合糖。然后，研究了使用混合糖時釀酒酵母和 卡斯酒香酵母的乙醇發(fā)酵模式。圖17和圖18說明了使用釀酒酵母和卡斯酒香酵母作為混 合糖中的發(fā)酵酵母的乙醇發(fā)酵結果。釀酒酵母在發(fā)酵48小時后甚至都沒有消耗所有混合 糖(消耗了所有葡萄糖，但是只消耗了 35%的半乳糖)，并且其首先消耗葡萄糖，在消耗了 所有葡萄糖后再開始消耗半乳糖用于代謝。同時，卡斯酒香酵母同時使用了葡萄糖和半乳 糖用于其代謝，并且在發(fā)酵24小時內消耗了所有的混合糖。該菌株從發(fā)酵開始時就開始產 生乙醇(由葡萄糖引發(fā))并在48小時后，其產生大約4. lg/Ι乙醇(乙醇產量93.8%)。將卡斯酒香酵母用作發(fā)酵酵母時，甚至在發(fā)酵24小時后在消耗了所有碳源后繼續(xù)增加乙 醇水平，表明轉化了細胞內組成。<3-2-2>使用水解產物的發(fā)酵圖19和圖20說明了使用釀酒酵母和卡斯酒香酵母作為發(fā)酵酵母和使用在高壓滅 菌器中水解的水解產物的乙醇發(fā)酵結果。釀酒酵母甚至在發(fā)酵48小時后也沒有產生乙醇， 而卡斯酒香酵母在發(fā)酵12小時后產生了乙醇(4. 6g/l，乙醇產量96. 0% )，但是從那時開 始沒有再增加。與使用混合糖的結果相比較，釀酒酵母和卡斯酒香酵母都證明了較慢的糖 消耗速率和較低的乙醇生產。工業(yè)實用件如之前所解釋的，本發(fā)明使用海藻生產生物燃料的方法通過使用大量的海洋生物 質有助于改善原料供應，通過排除木質素消除過程來降低生產成本，木質素消除過程是根 據常規(guī)方法使用木基原料時必需的，通過將海藻中包含的大部分碳水化合物如半乳糖、3， 6_脫水半乳糖以及葡萄糖轉化成生物燃料來降低生產成本，克服了能源擔憂問題，并且由 于通過海藻極好的CO2吸收來減少溫室氣體。因此，本發(fā)明在經濟和環(huán)境觀點中是有利的， 并且還應對了國際環(huán)境規(guī)則。
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權利要求
生物燃料的生產方法，包括以下步驟通過用水解酶和/或水解催化劑處理海藻或從海藻中提取出來的多糖來產生單糖；和使用微生物發(fā)酵單糖。
2.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中生物燃料選自C1-C4醇和C2-C4酮。
3.根據權利要求2的生物燃料的生產方法，其中生物燃料選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇 和丙酮。
4.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中多糖選自瓊脂、淀粉、卡拉膠、藻酸和 纖維蛋白。
5.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中海藻是大藻類或微藻類。
6.根據權利要求5的生物燃料的生產方法，其中大藻類選自紅藻、褐藻和綠藻。
7.根據權利要求5的生物燃料的生產方法，其中微藻類是小球藻或螺旋藻。
8.根據權利要求6的生物燃料的生產方法，其中紅藻選自石花菜(Gelidium amansii)、紫菜、Cottonii、Grateloupia lanceolata、圓紫菜(Porphyra suborbiculata)、 雞毛藻(Pterocladia tenuis)、Acanthopeltis japonica、鹿角海蘿(Gloiopeltis tenax)、真江籬(Gracilaria verrucosa)、角叉菜(Irish moss)、厚膜藻(Pachymeniopsis elliptica)、長枝沙菜(Hypnea charoides)、三叉仙菜(Ceramium kondoi)、波登仙 菜(Ceramium boydenii)、線形杉藻(Gigartina tenella)、鉤凝草(Campylaephora hypnaeoides)禾口繁枝娛蟲公藻(Grateloupia filicina)。
9.根據權利要求6的生物燃料的生產方法，其中褐藻選自裙帶菜(Undaria pinnatifida) Λ 海 ^ (Laminaria japonica)、Analipusjaponicus、i 公· (Chordaria flagelliformis)、鐵釘菜(Ishigeokamurai)、Scytosiphon lomentaria、鵝腸菜 (Endarachnebinghamiae)、Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Eisenia bicyclis、 Costaria costata、Sargassum fulvellum、f同■ (Sargassum horneri) Λ ^^^ (Sargassum thunbergii)禾口羊棲菜(Hitzikia fusiformis)。
10.根據權利要求6的生物燃料的生產方法，其中綠藻選自石莼(ulvalactuca), 水綿屬、濟苔屬、朿 1J豐公藻(Codium fragile)、Codiumminus、Caulerpa okamurai 禾口 Nostoc commune。
11.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過以下步驟來進行多糖的提取將海藻在堿水溶液中浸泡并用水清洗；將清洗過的海藻浸泡在提取溶劑中預定的時間，并提取一種或多種選自瓊脂、卡拉膠 和藻酸的糖；和分離提取物并收集剩余的淀粉或纖維蛋白。
12.根據權利要求11的生物燃料的生產方法，其中提取溶劑選自H2S04、HCl、HBr、HN03、 CH3COOH, HCOOH、HClO4, H3PO4, PTSA 和常用的固體酸。
13.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中單糖選自半乳糖、半乳糖衍生物、3， 6-脫水半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、木糖和甘露糖。
14.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中水解酶選自瓊脂水解酶、半 乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、內_1，4-β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖 維素酶。
15.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中水解催化劑選自H2S04、HC1、HBr, HNO3> CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 和常用的固體酸。
16.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過將瓊脂與濃度為0.05-30%的選 自 H2S04、HCl.HBr, HNO3> CH3COOH, HC00H、HClO4, H3PO4, PTSA 和常用固體酸的水解催化劑在 60-200°C下反應0-6小時來產生單糖。
17.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過將纖維蛋白與濃度為0.05-50% 的選自 H2S04、HCl.HBr, HNO3> CH3COOH, HC00H、HClO4, H3PO4, PTSA 和常用固體酸的水解催化 劑在80-300°C下反應來產生單糖。
18.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過將纖維蛋白與水解酶反應0-144 小時來產生單糖。
19.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過將海藻與濃度為0.05-50%的選 自 H2S04、HCl.HBr, HNO3> CH3COOH, HC00H、HClO4, H3PO4, PTSA 和常用固體酸的水解催化劑在 60-300°C下反應0-6小時來產生單糖。
20.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中通過多步驟糖化來產生單糖，所述多 步驟糖化包括以下步驟將海藻與濃度為0. 05-50%的選自H2S04、HCl、HBr、HNO3、CH3C00H、 HC00H、HC104、H3P04、PTSA和常用固體酸的水解催化劑在60-300°C下反應0-6小時；和在如 上的相同反應條件下剩余的纖維蛋白或淀粉的第二次或第三次糖化。
21.根據權利要求1的生物燃料的生產方法，其中用于發(fā)酵的微生物選自釀酒酵 母(Saccharomyces serevisiae)、胃八疊菌(Sarcinaventriculi)、脆壁克魯維酵母 (Kluyveromyces fragilis)、Zygomomonasmobilis、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) ΙΜΒ3λ ^ Τ # M # # # (Brettanomyce custersii)、 M M ^ M (Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、金黃丁酸梭菌 (Clostriduim aurantibuty 1 icum)禾口{段破傷風梭菌(Clostridiumtetanomorphum)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產生物燃料的方法，更具體地，包括以下步驟的生產生物燃料的方法通過用水解酶和/或水解催化劑處理海藻或從海藻中提取出來的多糖來生成單糖；和使用微生物發(fā)酵該單糖來生產生物燃料。本發(fā)明的生產生物燃料的方法解決了原料供應的問題，因為其使用海藻作為生物質的原料，并通過排除使用木基原料的常規(guī)方法所需的木質素消除過程降低了生產成本，產生了經濟和環(huán)境優(yōu)勢。
文檔編號C12P7/06GK101932715SQ200880010031
公開日2010年12月29日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權日2007年2月26日
發(fā)明者吳慶根, 柳玹瑨, 辛明教, 金埈奭, 金景洙, 金起協(xié), 金龍鎮(zhèn) 申請人:韓國生產技術研究院