專利名稱：：用于提高表達(dá)的細(xì)菌前導(dǎo)序列的制作方法用于提高表達(dá)的細(xì)菌前導(dǎo)序列發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明在蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域內(nèi)，具體針對靶向多肽用于生產(chǎn)正確加工的異源蛋白質(zhì)的用途。
背景技術(shù)：
：超過150種重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽已經(jīng)獲得美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)作為生物技術(shù)藥物和疫苗使用，且另外的370種處于臨床試驗(yàn)中。不像經(jīng)由化學(xué)合成所生產(chǎn)的小分子治療劑，蛋白質(zhì)和多肽在活細(xì)胞中是最有效生成的。然而，當(dāng)前在細(xì)菌中生產(chǎn)重組蛋白的方法通常生成不正確折疊的、聚集的或沒有活性的蛋白質(zhì)，而且許多類型的蛋白質(zhì)要求使用已知方法低效率實(shí)現(xiàn)的次級修飾。用已知方法的一個主要問題在于由聚集的蛋白質(zhì)構(gòu)成的包含體在細(xì)胞質(zhì)中的形成，這在過量的蛋白質(zhì)積累于細(xì)胞中時發(fā)生。重組蛋白生產(chǎn)中的另一個問題是為所表達(dá)的蛋白質(zhì)建立正確的二級和三級構(gòu)象。一種障礙是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)活躍地抵抗二碌J建形成，二磁ii建形成通常是正確蛋白質(zhì)折疊的基礎(chǔ)(De腿n等(1993)Science262:1744-7)。結(jié)果，許多重組蛋白(特別是那些具有真核起源的)在細(xì)菌中生產(chǎn)時是不正確折疊的，而且是沒有活性的。已經(jīng)開發(fā)了許多嘗試以增加正確折疊的蛋白質(zhì)在重組系統(tǒng)中的生成。例如，研究者變更了發(fā)酵條件(Schein(1989)Bio/Technology，7:1141-1149)，改變了啟動子強(qiáng)度，或者使用了過量表達(dá)的伴侶蛋白(Hockney(1994)TrendsBiotechnol.12:456-463)，其能有助于防止包含體的形成。增加正確折疊的蛋白質(zhì)的收獲的一種替代方法是自胞內(nèi)環(huán)境分泌蛋白質(zhì)。具有信號序列的多肽的最常見分泌形式牽涉Sec系統(tǒng)。Sec系統(tǒng)負(fù)責(zé)具有N端信號多肽的蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞質(zhì)膜的輸出(參見Agarraberes和Dice(2001)BiochimBiophysActa.1513:1-24;Muller等(2001)ProgNucleicAcidResMol.Biol.66:107-157)。已經(jīng)開發(fā)了多種策略來將蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌入上清液中。例如美國專利No.5,348,867;美國專利No.6,329,172;PCT/^開文本號WO96/17943;PCT公開文本號WO02/40696;及美國申請公開文本2003/0013150。用于提高表達(dá)的其它策略涉及將蛋白質(zhì)靶向至周質(zhì)。一些調(diào)查聚焦于非Sec型分泌(參見例如PCT公開文本號WO03/079007;美國公開文本No.2003/0180937;美國公開文本No.2003/0064435;及PCT/^開文本號WO00/59537)。然而，大多數(shù)研究聚焦于用Sec型分泌系統(tǒng)分泌外源蛋白質(zhì)。已經(jīng)記載了許多在表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)中使用的分泌信號。參見例如美國專利No.5,914,254;美國專利No.4,963,495;歐洲專利No.0177343;美國專利No.5,082,783;PCT公開文本號WO89/10971;美國專利No.6，156，552;美國專利No.6,495,357;6,509,181;6,524,827;6,528,298;6,558,939;6，608，018;6,617,143;美國專利No.5,595,898;5,698,435;及6,204,023;美國專利No.6,258,560;PCT公開文本號WO01/21662,WO02/068660和美國申請公開文本2003/0044906;美國專利No.5,641,671;及歐洲專利No.EP0,121，352。依賴于信號序列將蛋白質(zhì)靶向出細(xì)胞質(zhì)的策略通常產(chǎn)生不正確加工的蛋白質(zhì)。這對于氨基端分泌信號(諸如那些導(dǎo)致經(jīng)由Sec系統(tǒng)進(jìn)行的分泌的)是尤其正確的。經(jīng)由這種系統(tǒng)所加工的蛋白質(zhì)通常或是保留分泌信號的一部分(這需要通常不正確地受到切割的連接元件)，或在末端處是截短的。自上文所述技術(shù)顯而易見的是，已經(jīng)開發(fā)了許多策略來將蛋白質(zhì)靶向至宿主細(xì)胞的周質(zhì)。然而，已知的策略尚未導(dǎo)致正確加工的、有活性的重組蛋白(其可進(jìn)行純化以供治療使用)的一致的高產(chǎn)率。先前策略的一個主要限制是具有差的分泌信號序列的蛋白質(zhì)在不適當(dāng)?shù)募?xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)。因此，本領(lǐng)域中仍需要能夠分泌和正確地加工重組多肽的改善的大規(guī)模表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)正確加工形式的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)高水平的正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的改善的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供了自細(xì)菌生物體衍生的分泌信號的新的氨基酸和核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的分泌信號包括具有如下序列的分離的多肽，所述序列是選自下組的熒光假單月包菌(/^eMdomowas1y7womscera,Py/womscera)分泌多肽或與其基本上同源蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(proteindisulfideisomemseC，dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(phosphatebindingprotein,pbp*)、蛋白質(zhì)二石克4建異4勾酶A(proteindisulfideisomeraseA,dsbA)、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(tetratricopeptiderepeatfamilyprotein)(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(toluenetoleranceprotein)(Ttg2C)、和4妾納曱基的趨4t蛋白(methylacceptingchemotaxisprotein)(ORF8124)分泌多肽，以及其有生物學(xué)活性的變體、片段、和衍生物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的分泌信號包括具有如下序列的分離的多肽，所述序列是凝結(jié)芽孢桿菌(Bac/〃wscoagw/flra)Bce分泌信號序列或與其基本上同源。編碼本發(fā)明信號序列的核苷酸序列在載體和表達(dá)系統(tǒng)中是有用的，用于促進(jìn)所表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)或多肽向革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或向胞外環(huán)境中的靶向。包含所述分泌信號序列的DNA構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中是有用的，用于表達(dá)重組蛋白。感興趣蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作連接至本文所述分泌信號。細(xì)胞可在周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)所述蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞還可穿過細(xì)胞外壁向胞外分泌所表達(dá)的重組蛋白。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞等)和原核細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞(諸如熒光假單胞菌、大腸桿菌)等)。可使用本發(fā)明的分泌多肽前導(dǎo)序列來表達(dá)任何感興趣蛋白質(zhì)，包括治療用蛋白質(zhì)、激素、生長因子、胞外受體或配體、蛋白酶、激酶、血液蛋白質(zhì)、趨化因子、細(xì)胞因子、抗體等。附圖簡述圖l描繪了dsbCSS-skp融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建體。圖2顯示了約17kDa的Skp蛋白的表達(dá)(箭頭)。標(biāo)記2和3的條帶與Skp蛋白一致。條帶l表現(xiàn)出具有DNA結(jié)合蛋白(3691)和Skp兩者。圖3是dsbCSS-skp在熒光假單胞菌中表達(dá)后在0和24小時后在標(biāo)記2B-2(圖3A)和2B-4(圖3B)的樣品的可溶性(S)和不溶性(I)級分中的分析。在圖3A中，條帶5、7和9是不溶性級分中的未加工dsbC-skp蛋白。條帶6、8、和10是不溶性級分中的經(jīng)加工dsbC-skp。條帶1和3是可溶性級分中的經(jīng)加工dsbC-skp。條帶2和4是未知蛋白質(zhì)。在圖3B中，條帶15、17、和19是不溶性級分中的未加工dsbC-skp蛋白。條帶16、18、和20是不溶性級分中的經(jīng)加工dsbC-skp。條帶ll和13是可溶性級分中的經(jīng)加工dsbC-skp。條帶12和14是未知蛋白質(zhì)。12圖4顯示了表達(dá)DC694(dsbA-PA83)后蛋白質(zhì)積累的Westem分析。通過Western分析評估0和24小時時可溶性(S)、不溶性(I)、和無細(xì)胞培養(yǎng)基(B)的積累。圖5顯示了表達(dá)EP468-002.2(dsbA)后蛋白質(zhì)積累的Western分析。通過Western分析評估誘導(dǎo)后0和24'J、時時可溶性(S)和不溶性(I)蛋白質(zhì)的積累。圖6展示了與pINS-008-5(野生型pbp)分泌信號相比pINS-008-3(pbp*)突變體的堿性磷酸酶活性。將細(xì)胞培養(yǎng)物調(diào)至l個OD6oo單位，然后通過添加4-曱基傘形酮(MUP)并在10分鐘時測量熒光產(chǎn)物形成來測量PhoA活性。陰性對照含有MUP，但沒有細(xì)胞。圖7顯示了表達(dá)pINS-008-3(pbp"和pINS0008-5(野生型pbp)后蛋白質(zhì)積累的Westem分析。通過Western分析評估胰島素原-phoA在可溶性(Sol)、不溶性(Insol)、和胞外級分(Bro)中在IO、116、和I40小時時的積累。將培養(yǎng)物的等分試樣調(diào)至20個OD60()單位，通過SDS-PAGE分開，轉(zhuǎn)移至濾紙，并用針對胰島素的抗體(雞多克隆，Abcam產(chǎn)品目錄編號abl4042)顯現(xiàn)。圖8顯示了EP484-003和EP484-004級分的SDS-PAGE分析。顯示了SDS-PAGE分析的代表性結(jié)果。在中央處顯示了分子量標(biāo)志物(L)。標(biāo)示了BSA標(biāo)準(zhǔn)品(BSAStds.)。箭頭指示了所誘導(dǎo)的條帶。每道下方的是級分類型可溶性(Sol)、不溶性(Ins)、或無細(xì)胞培養(yǎng)基(CFB)。每道上方的是誘導(dǎo)時(IO)或誘導(dǎo)后24小時時(I24)的樣品時間。在樣品的每個分組下方顯示了菌林號。EP484-004的I24可溶性級分中大的蛋白質(zhì)條帶對應(yīng)于由Bce前導(dǎo)序列促進(jìn)的增強(qiáng)的基因表達(dá)。圖9展示了Gal2scFv表達(dá)的SDS-PAGE和Western分析。分析可溶性(S)和不溶性(I)級分。在每對泳道上方標(biāo)示與Gal2融合的分泌前導(dǎo)。在每個SDS-PAGE凝膠(頂部)或Western印跡(底部)的左側(cè)描繪分子量標(biāo)志物。箭頭標(biāo)示Gal2的遷移。圖10表示硫氧還蛋白(TrxA)表達(dá)的SDS-PAGE分析。分析可溶性級分。在每對泳道上方標(biāo)示與TrxA融合的分泌前導(dǎo)。在SDS-PAGE凝膠的左側(cè)描繪分子量標(biāo)志物。箭頭標(biāo)示未加工的(上方的箭頭)和經(jīng)加工的(下方的箭頭)TrxA的遷移。發(fā)明詳述I.綜述提供了用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)高水平的正確加工的多肽的組合物和方法。具體地，提供了新的分泌信號，其促進(jìn)可操作連接的感興趣多肽向革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或向胞外環(huán)境中的靶向。出于本發(fā)明的目的，"分泌信號"、"分泌信號多肽"、"信號肽"或"前導(dǎo)序列"意指對于將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的肽序列(或編碼所述肽序列的多核苷酸)。本發(fā)明的分泌信號序列包括選自下組的分泌多肽pbp*、dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、和ORF8124分泌信號，及其片段和變體。在SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、和24中列出分泌信號的氨基酸序列。在SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、和23中分別提供了相應(yīng)的核苷酉踏列。本發(fā)明包含這些序列以及其片段和變體。本發(fā)明的方法提供了在通常生成不正確折疊的、聚集的或沒有活性的蛋白質(zhì)的細(xì)菌中生產(chǎn)重組蛋白的當(dāng)前方法的改良。另外，許多類型的蛋白質(zhì)要求次級修飾，其使用已知方法僅低效率地實(shí)現(xiàn)。本文中的方法通過自胞內(nèi)環(huán)境分泌蛋白質(zhì)來增加正確折疊的蛋白質(zhì)的收獲。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，自細(xì)胞質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)可終止于周質(zhì)間隙中，附著至外膜，或者在胞外培養(yǎng)基中。該方法還避免由聚集的蛋白質(zhì)構(gòu)成的包含體。向周質(zhì)間隙中的分泌還具有公知的效果，即促進(jìn)正確的二硫鍵形成(Bardwell等(1994)PhosphateMicroorg.270-5;Manoil(2000)MethodsinEnzymol.326:35-47)。重組蛋白分泌的其它益處包括更有效的蛋白質(zhì)分離；轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的正確折疊和二硫鍵形成，導(dǎo)致處于活性形式的蛋白質(zhì)的百分比增加；包含體的形成減少和對宿主細(xì)胞的毒性降低；和處于可溶形式的重組蛋白的百分比增加。將感興趣蛋白質(zhì)分泌入培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的潛力還可潛在地促進(jìn)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)而非分批培養(yǎng)。革蘭氏陰性細(xì)菌已經(jīng)發(fā)展出用于蛋白質(zhì)穿過其雙膜的主動輸出的許多系統(tǒng)。這些分泌路徑包括例如ABC(I型)途徑、Path/Fla(III型)途徑、和Path/Vir(IV型)途徑，用于穿過質(zhì)膜和外膜兩者的l步轉(zhuǎn)位；Sec(II型)、Tat、MscL和Holins途徑，用于穿過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)位；和Sec-加上-菌毛引座孔蛋白(fimbrialusherporin,FUP)、Sec國力口上匿自運(yùn)豐命4勿(autotransporter,AT)、Sec-力口上畫只又配偶分泌(twopartnersecretion,TPS)、Sec畫加上-主端分才支(mainterminalbranch,MTB)、和Tat-力。上-MTB途徑，用于穿過質(zhì)膜和外膜的2步轉(zhuǎn)位。不是所有細(xì)菌都具有所有這些分泌途徑。三種蛋白質(zhì)系統(tǒng)(類型I、III和IV)在單一能量偶聯(lián)步驟中分泌蛋白質(zhì)穿過兩膜。四種系統(tǒng)(Sec、Tat、MscL和Holins)僅分泌穿過內(nèi)膜，而其它四種系統(tǒng)(MTB、FUP、AT和TPS)僅分泌穿過外膜。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的信號序列利用Sec分泌系統(tǒng)。Sec系統(tǒng)負(fù)責(zé)具有N端信號多肽的蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞質(zhì)膜的輸出(參見Agarraberes和Dice(2001)BiochimBiophysActa.1513:1-24;Muller等(2001)ProgNucleicAcidResMol.Biol.66:107-157)。在原核生物和真核生物中普遍地找到Sec家族的蛋白質(zhì)復(fù)合物。細(xì)菌Sec系統(tǒng)由運(yùn)輸?shù)鞍?、伴侶蛋白(SecB)或信號識別顆粒(SRP)和信號肽酶(SP酶I和SP酶II)組成。大腸桿菌中的Sec運(yùn)輸復(fù)合物由三種整合內(nèi)膜蛋白(SecY、SecE和SecG)和細(xì)胞質(zhì)ATP酶SecA組成。SecA募集SecY/E/G復(fù)合物以形成有活性的轉(zhuǎn)位通道。伴侶蛋白SecB結(jié)合初生的多肽鏈以阻止其折疊，并將其耙向至SecA。隨后線性多肽鏈被運(yùn)輸穿過SecYEG通道，并且在切割信號多肽后，該蛋白質(zhì)在周質(zhì)中折疊。三種輔助蛋白(SecD、SecF和YajC)形成一種復(fù)合物，其對于分泌不是必需的，但是在許多條件(特別在低溫時)下刺激分泌，高至10倍。運(yùn)輸入周質(zhì)中(即經(jīng)由II型分泌系統(tǒng))的蛋白質(zhì)還可在進(jìn)一步的步驟中輸出入胞外培養(yǎng)基中。其機(jī)制一般是經(jīng)由自運(yùn)輸物、雙配偶分泌系統(tǒng)、主端分枝系統(tǒng)或菌毛引座孔蛋白。革蘭氏陰性細(xì)菌中的12種已知分泌系統(tǒng)中，已知8種利用作為所表達(dá)的蛋白質(zhì)的一部分找到的靶向信號多肽。這些信號多肽與分泌系統(tǒng)的蛋白質(zhì)相互作用，使得細(xì)胞正確地將蛋白質(zhì)送往其合適的目的地。這8種基于信號多肽的分泌系統(tǒng)中的5種是那些牽涉Sec系統(tǒng)的。這5種被說成是牽涉Sec依賴性細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，并且它們在那里起作用的信號多肽可稱為Sec依賴性分泌信號。開發(fā)合適的分泌信號中的難題之一是確保信號得到合適的表達(dá)，并自所表達(dá)的蛋白質(zhì)切除。用于sec途徑的信號多肽一般由下列三種域組成(i)帶正電荷的n區(qū)，(ii)疏水性的h區(qū)，和(iii)不帶電荷的但極性的c區(qū)。信號肽酶的切割位點(diǎn)位于c區(qū)中。然而，信號序列的程度保守和長度以及切割位點(diǎn)位置在不同蛋白質(zhì)間可有所不同。(signature)是在所輸出的蛋白質(zhì)中存在短的(約30個氨基酸)、主要疏水的氨基端信號序列。信號序列有助于蛋白質(zhì)輸出，并在所輸出的蛋白質(zhì)到達(dá)周質(zhì)時被周質(zhì)信號肽酶切去。典型的N端Sec信號多肽含有具有至少一個精氨酸或賴氨酸殘基的N域，接著是含有一段疏水殘基的域，和含有信號肽酶的切割位點(diǎn)的C域。已經(jīng)開發(fā)了細(xì)菌蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，其中轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)構(gòu)建體被改造為含有感興趣蛋白質(zhì)和分泌信號兩者的融合蛋白，試圖將蛋白質(zhì)靶向出細(xì)胞質(zhì)。熒光假單胞菌已經(jīng)證明是用于生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)的改良平臺，并且已經(jīng)自此生物體鑒定出數(shù)種有效的分泌信號(參見美國申請公開文本號20060008877，通過提及而完整收入本文)。熒光假單胞菌以比通常在其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中所看到的水平要高的水平生成正確加工形式的外源蛋白質(zhì)，并以較高的水平將這些蛋白質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞周質(zhì)，導(dǎo)致完全加工的重組蛋白的回收增加。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過表達(dá)與分泌信號連接的靶蛋白來在熒光假單胞菌細(xì)胞中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的分泌信號序列在假單胞菌中是有用的。與其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比，假單胞菌系統(tǒng)為多肽和酶的商業(yè)表達(dá)提供優(yōu)勢。具體地，熒光假單胞菌已經(jīng)鑒定為有利的表達(dá)系統(tǒng)。熒光假單胞菌涵蓋一組常見的、非病原性腐生生物，其拓殖土壤、水和植物表面環(huán)境。自熒光假單胞菌衍生的商品化酶已經(jīng)用于降低環(huán)境污染，用作去污添加劑，及用于立體選擇性水解。熒光假單胞菌還在農(nóng)業(yè)上用于控制病原體。美國專利號4,695,462記載了重組細(xì)菌蛋白在熒光^f艮單胞菌中的表達(dá)。在1985年和2004年之間，許多公司利用熒光假單胞菌的農(nóng)業(yè)用途來生產(chǎn)殺蟲的(pesticidal)、殺昆蟲的(insecticidal)、和殺線蟲的毒素，以及利用特定毒性序列和遺傳操作來增強(qiáng)這些的表達(dá)。參見例如PCT公開文本號WO03/068926和WO03/068948;PCT公開文本號WO03/089455;PCT申請?zhí)朩O04/005221;及美國專利7^開文本號20060008877。II.組合物A.分離的多肽在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了分離的多肽，其中所述分離的多肽是對將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的新的分泌信號。在一個實(shí)施方案中，所述多肽具有16如下氨基酸序列，其是pbp氣dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、或ORF8124分泌信號、或其片段或變體，或與其基本上同源。在另一個實(shí)施方案中，此分離的多肽是分泌信號和感興趣蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白。在另一個實(shí)施方案中，多肽序列是SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24中所列的分泌信號多肽、或者由SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或23中所列的多核香S臾序列所編碼的分泌信號多肽，或與其基本上同源。在另一個實(shí)施方案中，所述多肽序列包含SEQIDNO:2的至少第2位畫第24位氨基酸、SEQIDNO:4的至少第2位-第22位氨基酸、SEQIDNO:6的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:8的至少第2位腸第33位氨基酸、SEQIDNO:10的至少第2位-第25位氨基酸、SEQIDNO:12的至少第2位-第24位氨基酸、SEQIDNO:14的至少第2位-第23位氨基酸、SEQIDNO:16的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:18的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:20的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:22的至少第2位-第33位氨基酸、或SEQIDNO:24的至少第2位-第39位氨基酸。在又一個實(shí)施方案中，所述多肽序列包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的片段，其自氨基端截短l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個氨基酸，但保留生物學(xué)活性，即分泌信號活性。在一個實(shí)施方案中，同源多肽的氨基酸序列是給定最初多肽的變體，其中變體序列可通過用其它氨基酸殘基替換最初多肽的高至或約30%的氨基酸殘基來獲得，包括高至約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26°/。、27%、28°/。、29°/。、或30%,前提是變體保留最初多肽的想要的功能?；旧贤吹淖凅w氨基酸會是與給定多肽至少約70%、至少約75%、至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或至少約99%同源的。變體氨基酸可以以多種方式獲得，包括SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的一個或多個氨基酸的氨基酸替代、刪除、截短和插入，包括多至約l處、約2處、約3處、約4處、約5處、約6處、約7處、約8處、約9處、約10處、約15處、約20處、約25處、或更多處氨基酸替代、刪除或插入。通過"基本上同源的"或"基本上類似的"意指使用本文中所描述的比17對程序之一^^用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參照序列相比具有至少約60%或65%序列同一性、約70°/?；?5%序列同一性、約80%或85°/。序列同一性、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更大序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等，可適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些數(shù)值以確定由兩種核苦酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。例如，優(yōu)選的是，可在一個或多個預(yù)測的、優(yōu)選非必需的氨基酸殘基處進(jìn)行保守的氨基酸替代。"非必需的，，氨基酸殘基是可自分泌信號多肽的野生型序列改變而不改變生物學(xué)活性的殘基，而"必需的"氨基酸殘基是生物學(xué)活性所需要的。"保守氨基酸替代"是其中氨基酸殘基用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的。表l中列出了保守和半保守氨基酸殘基的家族。表l:類似氨基酸替代組保守組(8)半保守組(7)Arg,LysArg，Lys,HisAsp,GinAsn，Asp,Gly，GinAsn,Glulie,Leu,Vallie,Leu,Val,Met,PheAla,GlyAla，Gly，Pro,Ser，ThrSer，ThrSer，Thr,TyrPhe,TyrPhe，Trp，TyrCys(非半胱氨酸)，SerCys(非半胱氨酸)，Ser,Thr本發(fā)明所涵蓋的變異型蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)擁有天然蛋白質(zhì)的想要的生物學(xué)活性，即保留分泌信號活性。通過"保留活性"意指變體會具有天然蛋白質(zhì)的至少約30%、至少約50°/。、至少約70%、至少約80%、約90%、約95%、約100%、約110%、約125%、約150%、至少約200%或更大分泌信號活性。B.分離的多核苷酸本發(fā)明還包括具有如下序列的分離的核酸，所述序列編碼對于將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的新的分泌信號。在一個實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸編碼與pbp*、dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、或ORF8124分泌信號多肽基本上同源的多肽序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下核酸，其編碼與SEQIDNO:2的至少第2位-第24位氨基酸、SEQIDNO:4的至少第2位-第22位氨基酸、SEQIDNO:6的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:8的至少第2位-第33位氨基酸、SEQIDNO:10的至少第2位-第25位氨基酸、SEQIDNO:12的至少第2位-第24位氨基酸、SEQIDNO:14的至少第2位-第23位氨基酸、SEQIDNO:16的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:18的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:20的至少第2位-第21位氨基酸、SEQIDNO:22的至少第2位-第33位氨基酸、或SEQIDNO:24的至少第2位-第39位氨基酸基本上同源的多肽序列，或者提供了與SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、21、或23基本上同源的核酸，包括其生物學(xué)活性變體和片段。在另一個實(shí)施方案中，所述核酸序列與SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、21、或23的序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、約75%、約80%、約85°/。、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或至少約99°/。相同。在另一個實(shí)施方案中，所述核酸編碼如下多肽，其與SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97°/。、約98%、或至少約99°/。相同。本發(fā)明優(yōu)選的分泌信號多肽由與SEQIDNO:l或3的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列編碼。使用諸如PCR、雜交等方法，可鑒定相應(yīng)的分泌信號多肽序列，此類序列與本發(fā)明的序列基本上相同。參見例如SambrookJ.和Russell，D.W.(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)及Innis等(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。變異型核苷酸序列還包括合成方式衍生的核苷酸序列，其已經(jīng)例如通過使用定點(diǎn)誘變生成，但其仍編碼本發(fā)明中所公開的分泌信號多肽，如下文所討論的。本發(fā)明所涵蓋的變異型分泌信號多肽是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)擁有天然蛋白質(zhì)的想要的生物學(xué)活性，即保留分泌信號活性。通過"保留活性"意指變體會具有至少約30%、至少約50%、至少70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、約96%、約97°/。、約98%、至少約99%或更大的天然分泌信號多肽活性。用于測量分泌信號多肽活性的方法在本文中的別處有所討-淪。熟練技術(shù)人員會進(jìn)一步理解的是，變化可通過突變而導(dǎo)入本發(fā)明的核苷酸序列中，由此導(dǎo)致所編碼分泌信號多肽的氨基酸序列的變化，而不改變分泌信號多肽的生物學(xué)活性。如此，可如下創(chuàng)建變異型分離的核酸分子，即將一處或多處核苷酸替代、添加、或刪除導(dǎo)入本文中所公開的相應(yīng)核苷酸序列中，使得將一處或多處氨基酸替代、添加或刪除導(dǎo)入所編碼的蛋白質(zhì)中。可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變)來導(dǎo)入突變。本發(fā)明也涵蓋此類變異型核苷酸序列。c.核酸和氨基酸同源性依照本領(lǐng)域中公知的多種方法之任一種來測定核酸和氨基酸序列同源可使用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)程序MegaBLAST(目前可在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/獲得的)來實(shí)施類似序列的比對和搜索。以百分比同一性選項(xiàng)設(shè)置在例如氨基酸序列的70%或設(shè)置在例如核苦酸序列的90%使用此程序會鑒定出那些與查詢序列具有70%或90°/。或更大序列同一性的序列。本領(lǐng)域中已知的其它軟件也可用于比對和/或搜索類似的序列，例如與含有依照本發(fā)明的分泌信號序列的信息串至少70°/。或90%相同的序列。例如，用于比較以鑒定與查詢序列至少70%或90%相同的序列的序列比對可如下進(jìn)行，即使用例如可在GCG序列分析軟件包(可獲自GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,1710UniversityAvenue,Madison,Wis.53705)中獲得的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA程序，其中缺省參數(shù)如在那里所指定的，加上設(shè)置在想要的百分比的序列同一性程度的參數(shù)。還有，例如可使用CLUSTAL程序(可在來自Intelligenetics，MountainView,Cal.的PC/Gene軟件包中獲得的)。這些和其它序列比對方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可通過手動比對、通過目禍>險查、或通過序列比對算法(諸如由上文所述程序所體現(xiàn)的那些中的任一種)的手動或自動應(yīng)用來進(jìn)行。多種有用的算法包括例如W.R.Pearson和D.J.Lipman,Pro"Natl.Acad.Sci.USA85:2444-48(1988年4月)中所記載的相似性搜索方法；T.F.Smith和M.S.Waterman,于Adv.Appl.Math.2:482-89(1981)和于J.Molec.Biol.147:195-97(1981)中所記載的局部同源性方法；S.B.Needleman和C.D.Wunsch,J.Molec.Biol.48(3):443-53(1970年3月)中所記載的同源性比對方法；和例如由W.R.Pearson,于Genomics20R,Pearson,于MethodsMolec.Biol.24:307-31和25:365-89(1994);及由D.G.Higgins和P.M.Sharp,于Comp.Appl，nsinBiosci.5:151-53(1989)和于Gene73(1):237扁44(1988年12月15日)所記載的多種方法。除非另有說明，會使用GAP第10版(其使用Needleman和Wunsch(1970)見上文的算法)來測定序列同一性或相似性，其使用如下參數(shù)進(jìn)行核芬酸序列的％同一性和°/。相似性使用GAP權(quán)重(Weight)50和長度權(quán)重(LengthWeight)3,及nwsgapdna,cmp得分矩陣；氨基酸序列的％同一性或％相似性使用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2，及BLOSUM62得分程序。也可使用等同的程序。通過"等同的程序"意指與由GAP第10版所產(chǎn)生的相應(yīng)比對相比時，對任何兩種所討論的序列產(chǎn)生具有相同核苷酸殘基匹配和相同百分比序列同一性的比對的任何序列比較程序。在多個實(shí)施方案中，序列比較貫穿整個查詢序列或目標(biāo)序列或兩者進(jìn)行。D.雜交條件在本發(fā)明的另一方面，提供了與具有如下序列的分離的核酸雜交的核酸，所述序列編碼具有與pbp氣dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、MkA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、或ORF8124分泌信號多肽基本上類似的序列的多肽。在某些實(shí)施方案中，雜交的核酸會在高嚴(yán)格條件下結(jié)合。在多個實(shí)施方案中，雜交貫穿編碼分泌信號多肽的核苷酸序列的基本上全長發(fā)生，例如，貫穿SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或23中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的基本上全長發(fā)生。若核酸分子在SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、或23中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的全長的至少80%、全長的至少85%、至少90%、或至少95%里雜交，則該核酸分子與本文中所7>開的編碼分泌信號的核苷酸序列的"基本上全長"雜交。除非另有說明，"基本上全長"指編碼分泌信號的核苷酸序列的全長的至少80%,其中長度以連續(xù)的核普酸測量(例如雜交至SEQIDNO:3的至少53個連續(xù)的核苷酸、SEQIDNO:5的至少51個連續(xù)的核苷酸、SEQIDNO:7的至少80個連續(xù)的核苷酸等)。在一種雜交方法中，可使用整個或部分的編碼分泌信號多肽的核苷酸序列來篩選cDNA或基因組文庫。用于構(gòu)建此類cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域中普遍知道的，并披露于Sambrook和Russell,2001。所謂雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，而且可以用可檢測的基團(tuán)(諸如"P)、或任何其它可^r測的標(biāo)志物(諸如其它放射性同位素、熒光化合物、酶、或酶輔因子)標(biāo)記?？赏ㄟ^標(biāo)記合成的寡核苦酸來制備供雜交用的探針，所述合成的寡核苷酸基于本文中所公開的已知的編碼分泌信號多肽的核香酸序列。另外還可使用基于核苦酸序列或所編碼的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計的簡并引物。探針通常包含在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的編碼分泌信號多肽的核苷酸序列或其片段或變體的至少約10個、至少約15個、至少約16個、17個、18個、19個、20個、或更多個連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域。用于制備供雜交用的探針的方法是本領(lǐng)域中普通知道的，并披露于Sambrook和Russell，2001,通過提及而收入本文。在雜交技術(shù)中，整個或部分的已知核苷酸序列作為探針使用，所述探針與自選定生物體所克隆的基因組DNA片段或cDNA片段的群體(即基因組或cDNA文庫)中所存在的其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，而且可以用可斗企測的基團(tuán)(諸如"P)、或任何其它可檢測的標(biāo)志物標(biāo)記。如此，例如可通過標(biāo)記合成的寡核苷酸來制備供雜交用的探針，所述合成的寡核苷酸基于本文中編碼分泌信號多肽的核苷酸序列。用于制備供雜交用的探針和用于構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域中普遍知道的，并且披露于Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。例如，本文中所公開的整個編碼分泌信號多肽的核苷酸序列或其一個或多個部分可作為如下探針使用，所述探針能夠與編碼分泌信號多肽的相應(yīng)核芬酸序列和信^f吏RNA特異性雜交。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，此類此類探針可用于通過PCR來自選定生物體擴(kuò)增相應(yīng)的編碼分泌信號多肽的核芬酸序列。此技術(shù)可用于自想要的生物體分離別的編碼序列或用作診斷測定法以測定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包括對鋪板的DNA文庫(或是噬菌斑或菌落)的雜交篩選；參見例如Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。此類序列的雜交可在嚴(yán)格條件下實(shí)施。通過"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件，，意指探針會以比對其它序列大的可檢測程度(例如超過背景的至少2倍)與其把序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，而且在不同情況中會是不同的。通過控制雜交和/或清洗條件的嚴(yán)格性，可鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探查)?；蛘?，可調(diào)整嚴(yán)格條件以容許序列中的一些錯配，使得檢測出較低程度的相似性(異源探查)。一般而言，探針的長度小于約1000個核苦酸，優(yōu)選長度小于500個核苦酸。通常，嚴(yán)格條件會是那些如下的，其中鹽濃度小于約1.5MNa離子，通常約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽類)，于pH7.0至8.3,且溫度是至少約60。C，優(yōu)選約68。C。還可通過添加去穩(wěn)定劑(諸如曱酰胺)來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。例示性的低嚴(yán)格條件包括用30至35%曱酰胺、1MNaCl、1°/。SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液于37。C進(jìn)行的雜交，和在1X至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中于50至55。C進(jìn)行的清洗。例示性的中等嚴(yán)格條件包括在40至45%曱酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中于37。C進(jìn)行的雜交，和在0.5X至1XSSC中于55至60。C進(jìn)行的清洗。例示性的高嚴(yán)格條件包括在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37。C進(jìn)行的雜交，和在0.1XSSC中于60至68。C進(jìn)行的清洗。任選地，清洗緩沖液可包含約0.1%至約1%SDS。雜交的持續(xù)時間一般小于約24小時，通常約4至約12小時。特異性通常是雜交后清洗的函數(shù)，至關(guān)重要的因素是最終清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于DNA-DNA雜合物，Tm可自Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267畫284的方程式估算Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是單價陽離子的摩爾濃度，。/。GC是DNA中鳥。票呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中曱酰胺的百分比，而L是以堿基對計的雜合物長度。Tm是50。/。的互補(bǔ)靶序列雜交至完全匹配的探針的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。每l。/。的錯配使TnTF降約l。C;如此，可調(diào)整Tm、雜交和/或清洗條件以雜交至具有想要的同一性的序列。例如，若尋找具有大于等于90%同一性的序列，則可使Tm下降10。C。一般而言，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)物在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5。C。然而，極嚴(yán)格條件可利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低l、2、3或4。C的雜交和/或清洗；中等嚴(yán)格條件可利用比熱熔點(diǎn)(TJ低6、7、8、9或10。C的雜交和/或清洗；低嚴(yán)格條件可利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低ll、12、13、14、15、或20。C的雜交和/或清洗。使用所述方程式、雜交和清洗組合物、和想要的Tm，普通技術(shù)人員會理解，內(nèi)在描述了雜交和/或清洗溶液的嚴(yán)格性的變化。若想要的錯配程度導(dǎo)致Tm小于45。C(水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)，則優(yōu)選提高SSC濃度以使得可使用更高的溫度。對核酸雜交的廣泛指導(dǎo)記載于Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,部分I，章2(Elsevier,NewYork);及Ausubel等編(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,章2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。參見Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)。E.密碼子選擇可根據(jù)宿主生物體的密碼子選擇來調(diào)整本文中所公開的核酸序列。密碼子選擇或密碼子偏愛在本領(lǐng)域中是公知的。選定的編碼序列可通過改變其遺傳密碼來改良以匹配由細(xì)菌宿主細(xì)胞所采用的，并可增強(qiáng)其密碼子序列來更好地接近宿主所采用的?？梢勒毡绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法之任一種(例如寡核苷酸指導(dǎo)的誘變)來實(shí)施遺傳密碼選擇和密碼子頻率增強(qiáng)。幫助此方法的有用的在線因特網(wǎng)資源包括例如(1)KazusaDNA研究所(2-6-7Kazusa-kamatari,Kisarazu,Chiba292-0818Japan)的密碼子選擇數(shù)據(jù)庫，并可在www.kazusa.or.jp/codon獲得；和(2)可自NCBI分類學(xué)數(shù)據(jù)庫在www.ncbi.nln.nih.gov/-Taxonomy/Utils/wprintgc.cgimode:c獲4尋6勺遺傳密石馬表。例如，假單胞菌物種報告為利用NCBI分類學(xué)位置的遺傳密碼翻譯表ll，而在Kazusa4立置才艮告為展現(xiàn)出www.kazusa.or.ip/codon/cgibin處所顯示表才各的密碼子用法頻率。認(rèn)識到可關(guān)于密碼子選擇來調(diào)整分泌信號多肽、本文中別處所描述的感興趣多肽或兩者的編碼序列。F.表達(dá)載體本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括表達(dá)載體，其包括編碼對于將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的新的分泌多肽的核酸。在一個實(shí)施方案中，載體包含可操作連接至啟動子的，編碼與本文中所公開的分泌信號多肽基本上類似的多肽的多核苷酸序列。可表達(dá)的編碼序列會可操作附著至能夠在選定的宿主細(xì)胞中運(yùn)行的轉(zhuǎn)錄啟動子，以及所有其它所需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件。術(shù)語"可操作連接的"指任何如下的構(gòu)造，其中轉(zhuǎn)錄和任何翻譯調(diào)控元件以相對于編碼序列的這樣一種或多種布置共價附著于編碼序列以使得在宿主細(xì)胞中和通過宿主細(xì)胞的作用，調(diào)控元件可指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。載體通常會包含一種或多種表型選擇標(biāo)志和復(fù)制起點(diǎn)以確保載體的維持，并在想要時提供宿主內(nèi)的擴(kuò)增。依照本公開內(nèi)容的適于轉(zhuǎn)化的宿主包括假單胞菌屬內(nèi)的多種物種，并且特別優(yōu)選的是熒光假單胞菌的宿主細(xì)胞抹。在一個實(shí)施方案中，載體進(jìn)一步包含用于表達(dá)可操作連接至本文中所7>開的分泌信號的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列。可自多核苦酸表達(dá)重組蛋白和多肽，在所述多核苷酸中靶多肽編碼序列可操作連接至前導(dǎo)序列和轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件以形成功能性基因，宿主細(xì)胞可自該功能性基因表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。編碼序列可以是靶多肽的天然編碼序列(若可獲得的話)，但是會更優(yōu)選已經(jīng)為了在選定的表達(dá)宿主細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)行選擇、改善或優(yōu)化的編碼序列例如，通過合成基因以反映宿主物種的密碼子使用偏愛。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，宿主物種是熒光假單胞菌，并在設(shè)計信號序列和/或蛋白質(zhì)或多肽序列兩者時考慮熒光假單胞菌的密碼子偏愛。將一種或多種基因在一種或多種載體內(nèi)構(gòu)建或插入一種或多種載體中，然后可將所述載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主細(xì)胞中。其它調(diào)控元件可包括在載體(也稱為"表達(dá)構(gòu)建體")中。此類元件包括但不限于例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、翻譯增強(qiáng)子序列、其它啟動子、激活子、翻譯起始和終止信號、轉(zhuǎn)錄終止子、順反子調(diào)節(jié)物、多順反子調(diào)節(jié)物、標(biāo)簽序列(諸如核苷酸序列"標(biāo)簽"和"標(biāo)簽，，多肽編碼序列)，其促進(jìn)所表達(dá)的多肽的鑒定、分開、純化和/或分離。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含與分泌信號的編碼序列或與感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列鄰近的標(biāo)簽序列。在一個實(shí)施方案中，此標(biāo)簽序列容許純化蛋白質(zhì)。標(biāo)簽序列可以是親和標(biāo)簽，諸如六組氨酸親和標(biāo)簽。在另一個實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽可以是谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶分子。標(biāo)簽還可以是熒光分子，諸如YFP或GFP，或此類熒光蛋白的類似物。標(biāo)簽還可以是對純化有用的已知結(jié)合配偶體的已知抗原或配體、或抗體分子的一部分。在蛋白質(zhì)編碼序列之外，依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因還可包括與其可操作連接的下列調(diào)控元件啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、轉(zhuǎn)錄終止子、翻譯起始和終止信號。有用的RBS可自在依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中可用作宿主細(xì)胞的任何物種獲得，優(yōu)選自選定的宿主細(xì)胞獲得。許多特有的和多種共有的RBS是已知的，例如那些記載于D.Frishman等，Startsofbacterialgenes:25estimatingthereliabilityofcomputerpredictions,Gene234(2):257-65(1999年7月8日)；及B.E.Suzek等，Aprobabilisticmethodforidentifyingstartcodonsinbacterialgenomes,Bioinformatics17(12):1123-30(2001年12月)的和由它們才是及的。另外，可使用天然的或合成的RBS，例如那些記載于EP0207459(合成的RBS);O.Ikehata等,PrimarystructureofnitrilehydratasededucedfromthenucleotidesequenceofaRhodococcusspeciesanditsexpressioninEscherichiacoli，Eur.J.Biochem.181(3):563-70(1989)的(天然RBS序列AAGGAAG)。本發(fā)明中有用的方法、載體、和翻譯和轉(zhuǎn)錄元件及其它元件的進(jìn)一步的例子記載于例如Gilroy的美國專利No.5，055，294和Gilroy等的美國專利No.5,128,130;Rammler等的美國專利No.5,281,532;Bames等的美國專利No.4，695，455和4,861,595;Gray等的美國專利No.4，755，465;及Wilcox的美國專利No.5,169,760。通過將增強(qiáng)子序列插入載體或質(zhì)粒中來增加編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄。典型的增強(qiáng)子是大小通常約10-300bp的DNA順式作用元件，其作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括多種假單胞菌增強(qiáng)子。一般而言，重組表達(dá)載體會包括復(fù)制起點(diǎn)和容許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志和自高度表達(dá)的基因衍生以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。此類啟動子可以自編碼酶(諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等)的操縱子衍生。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的狀態(tài)與翻譯起始和終止序列和優(yōu)選能夠指導(dǎo)所翻譯的多肽分泌的分泌序列裝配在一起。任選地，異源序列可編碼包含賦予想要的特性(例如所表達(dá)重組產(chǎn)物的穩(wěn)定化或簡化的純化)的N端鑒定多肽的融合多肽。用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的載體在本領(lǐng)域中是已知的，并且可使用這些中的任一種來表達(dá)依照本發(fā)明的基因。此類載體包括例如質(zhì)粒、粘粒、和噬菌體表達(dá)載體。有用的質(zhì)粒載體的例子包括但不限于表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO160(K和RSF1010。此類有用的載體的其它例子包括那些記載于例如N.Hayase，于Appl.Envir.Microbiol.60(9):3336-42(1994年9月);A.A.Lushnikov等,于BasicLifeSci.30:657-62(1985);S.Graupner和W.Wackemagel,于Biomolec.Eng.17(1):11匿16.(2000年10月);H.P.Schweizer，于Curr.Opin.Biotech.12(5):439-45(2001年10月)；M.Bagdasarian和K.N.Timmis，于Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96:47-67(1982);T.Ishii等，于FEMSMicrobiol.Lett.l即):307畫13(1994年3月1曰);I.N.Olekhnovich和Y.K.Fomichev,于Gene140(1):63畫65(1994年3月11日)；M.Tsuda和T.Nakazawa，于Gene136(l-2):257-62(1993年12月22日);C.Nieto等,于Gene87(1):145-49(1990年3月1日);J.D.Jones和N.Gutterson，于Gene61(3):299-306(1987);M.Bagdasarian等,于Gene16(l-3):237-47(1981年12月);H.P.Schweizer等，于Genet.Eng.(NY)23:69-81(2001);P.Mukhopadhyay等，于J.Bact.172(l):477-80(1990年1月);D.O.Wood等,于J.Bact.145(3):1448-51(1981年3月);及R.Holtwick等，于Microbiology147(Pt2):337-44(2001年2月)的?？捎糜谒拗骷?xì)胞的、包含本發(fā)明的分泌信號構(gòu)建體的表達(dá)載體的進(jìn)一步例子包括那些列于表2中的、自指示的復(fù)制子衍生的。表2:有用的表達(dá)載體的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表達(dá)質(zhì)粒RSF1010記載于例如F.Heffron等，于Proc,Nat，lAcad.Sci.USA72(9):3623-27(1975年9月)及K.Nagahari和K.Sakaguchi，于J.Bact.133(3):1527-29(1978年3月)。質(zhì)粒RSF1010及其衍生物是本發(fā)明中特別有用的載體。例示性的、有用的RSF1010衍生物(其在本領(lǐng)域中是已知的)包括例如pKT212、pKT214、pKT231及相關(guān)質(zhì)粒，和pMYC1050及相關(guān)質(zhì)粒(參見例如Thompson等的美國專利No.5,527,883和5,840,554),諸如例如的美國專利No.5,169,760)，其攜帶來自RSF1010質(zhì)粒的可調(diào)型四環(huán)素抗性標(biāo)志及復(fù)制和轉(zhuǎn)移基因座(replicationandmobilizationloci)。其它例示性的有用的載體包括包括那些記載于Puhler等的美國專利No.4，680，264的。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)質(zhì)粒作為表達(dá)載體使用。在另一個實(shí)施方案中，RSF1010或其衍生物作為表達(dá)載體使用。在又一個實(shí)施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC4803或其衍生物作為表達(dá)載體^f吏用?？赏ㄟ^包含于質(zhì)粒中的選擇標(biāo)志基因來將質(zhì)粒維持在宿主細(xì)胞中。這可以是抗生素抗性基因(其中將相應(yīng)的抗生素添加至發(fā)酵培養(yǎng)基)，或本領(lǐng)域中已知的任何其它類型的選擇標(biāo)志基因，例如原養(yǎng)型恢復(fù)基因，其中在相應(yīng)的性狀(例如生物催化性狀，諸如氨基酸生物合成或核苷酸生物合成性狀，或碳源利用性狀)營養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞中使用所述質(zhì)粒?？烧{(diào)型啟動子的常見例子包括那些自lac啟動子(即lacZ啟動子)衍生的家族的，特別是記載于DeBoer的美國專利No.4,551,433的toc和化c啟動子，以及Ptacl6、Ptacl7、PtacII、PlacUV5、和T71ac啟動子。在一個實(shí)施方案中，啟動子不是自宿主細(xì)胞生物體衍生的。在某些實(shí)施方案中，啟動子是自大腸桿菌生物體衍生的。在依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中有用的非lac型啟動子的常見例子包括例如那些列于表3的。表3:非/"c啟動子的例子啟動子誘導(dǎo)物Pr尚溫Pl古，'曰向/孤Pm烴基或卣代苯曱酸鹽Pu烴基或囟代曱苯Psal水楊酸鹽參見例如J.Sanchez-Romero和V.DeLorenzo(1999)GeneticEngineeringofNonpathogenicPseudomonasstrainsasBiocatalystsforIndustrialandEnvironmentalProcesses,于ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology(A.Demain和J.Davies纟扁)頁460-74(ASMPress,Washington,D.C.);H.Schweizer(2001)VectorstoexpressforeigngenesandtechniquestomonitorgeneexpressionforPseudomonads,CurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445;及R.Slater和R.Williams(2000)TheExpressionofForeignDNAinBacteria,于MolecularBiologyandBiotechnology(J.Walker和R.Rapley編)頁125-54(TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)。還可使用具有對于選定的細(xì)菌宿主細(xì)胞而言天然的啟動子的核香酸序列的啟動子來控制編碼靶多肽的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，例如假單胞菌鄰氨基苯曱酸鹽或苯曱酸鹽操縱子啟動子(Pant,Pben)。還可使用串聯(lián)啟動子，其中超過一種啟動子共價附接至另一種，無論序列是相同的還是不同的(例如Pant-Pben串聯(lián)啟動子(啟動子間的雜合物)或P/ac-P/flc串聯(lián)啟動子)，或者無論是自相同的還是不同的生物體書f生的。可調(diào)型啟動子利用啟動子調(diào)控蛋白以控制啟動子是其一部分的基因的轉(zhuǎn)錄。若在本文中使用可調(diào)型啟動子，則相應(yīng)的啟動子調(diào)控蛋白也會是依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的一部分。啟動子調(diào)控蛋白的例子包括激活蛋白，例如大腸桿菌分解代謝物激活蛋白、MalT蛋白；AraC家族轉(zhuǎn)錄激活物；阻抑蛋白，例如大腸桿菌LacI蛋白；和雙功能調(diào)控蛋白，例如大腸桿菌NagC蛋白。許多可調(diào)型啟動子/啟動子調(diào)控蛋白對在本領(lǐng)域中是已知的。啟動子調(diào)控蛋白與效應(yīng)器化合物相互作用，所述效應(yīng)器化合物即如下化合物，其可逆地或不可逆地與調(diào)控蛋白相結(jié)合以使得所述蛋白質(zhì)能夠釋放或結(jié)合啟動子控制下的基因中的至少一個DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，由此容許或阻斷轉(zhuǎn)錄酶在啟動基因轉(zhuǎn)錄中的作用。效應(yīng)器化合物分類為誘導(dǎo)物或協(xié)阻抑物，并且這些化合物包括天然效應(yīng)器化合物和安慰誘導(dǎo)物化合物。許多可調(diào)型啟動子/啟動子調(diào)控蛋白/效應(yīng)器化合物三件一套在本領(lǐng)域中是已知的。雖然效應(yīng)器化合物可貫穿細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵使用，但是在使用可調(diào)型啟動子的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞生物量生長到想要的數(shù)量或密度后，將合適的效應(yīng)器化合物添加至培養(yǎng)物以直接地或間接地導(dǎo)致編碼所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的想要基因的表達(dá)。舉例而言，在利用/ac家族啟動子的情況中，lacl基因也可存在于系統(tǒng)中。lacl基因(其(通常)是組成型表達(dá)的基因)編碼丄ac阻抑蛋白(LacD蛋白)，其結(jié)合這些啟動子的/ac操縱基因。如此，在利用/ac家族啟動子的情況中，lacl基因也可包括在表達(dá)系統(tǒng)中，并在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在/ac啟動子家族成員(例如tac啟動子)的情況中，效應(yīng)器化合物是誘導(dǎo)物，優(yōu)選安慰誘導(dǎo)物，諸如IPTG(異丙基-(3-D-硫代吡喃半乳糖苷，也稱作"異丙基硫代半乳糖苷")。29對于感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)，也可使用任何植物啟動子。啟動子可以是植物RNA聚合酶II啟動子。植物啟動子中包括的元件可以是通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(5，)約25-35個堿基對的TATA框或Goldberg-Hogness框，和位于上游70和100個堿基對之間的CCAAT框。在植物中，CCAAT框可具有不同于哺乳動物啟動子的功能類似序列的共有序列(Messing等(1983)于GeneticEngineeringofPlants,Kosuge等編，頁211-227)。另夕卜，幾乎所有啟動子都包括自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約-100bp至-l，000bp或更多延伸的別的上游激活序列或增強(qiáng)子(Benoist和Chambon(1981)Nature290:304-310;Gruss等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.78:943-947;及Khoury和Gruss(1983)Cell27:313-314)。G.表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明進(jìn)一步提供了對于將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的改良表達(dá)系統(tǒng)。在一個實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括宿主細(xì)胞和上文所述載體，其包含編碼可操作連接至選自下組的分泌信號的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核苦酸序列pbp*、dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、和ORF8124分泌信號序列，或與本文中所^^開的分泌信號序列SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、21、或23基本上同源的序列，或編碼SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，在信號序列和感興趣蛋白質(zhì)或多肽之間沒有進(jìn)行修飾。然而，在某些實(shí)施方案中，摻入別的切割信號以促進(jìn)多肽氨基端的正確加工。分泌系統(tǒng)還可包括發(fā)酵培養(yǎng)基，諸如下文所述的。在一個實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括礦物鹽培養(yǎng)基。在另一個實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括培養(yǎng)基中的化學(xué)誘導(dǎo)物。CHAMPIONpET表達(dá)系統(tǒng)提供了高水平的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。自T71ac強(qiáng)啟動子誘導(dǎo)表達(dá)。此系統(tǒng)利用噬菌體T7RNA聚合酶的高活性和特異性來高水平地轉(zhuǎn)錄感興趣基因。位于啟動子區(qū)中的lac操縱基因提供了比傳統(tǒng)的基于T7的載體更緊密的調(diào)控，這改善了質(zhì)粒穩(wěn)定性和細(xì)胞生存力(Studier和Moffatt(1986)JMolecularBiology189(1):113-30;Rosenberg等(1987)Gene56(1):125-35)。T7表達(dá)系統(tǒng)使用T7啟動子和T7RNA聚合酶(T7RNAP)來高水平地轉(zhuǎn)錄感興趣基因。在T7表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，因?yàn)門7RNAP比天然的大腸桿菌RNAP更具有進(jìn)行性(processive)，而且致力于轉(zhuǎn)錄感興趣基因。通過在宿主細(xì)胞中提供T7RNAP的來源來誘導(dǎo)所鑒定基因的表達(dá)。這通過使用含有T7RNAP基因的染色體拷貝的BL21大腸桿菌宿主來實(shí)現(xiàn)。T7RNAP基因在可由IPTG誘導(dǎo)的lacUV5啟動子的控制下。T7RNAP在誘導(dǎo)后進(jìn)行表達(dá)，并轉(zhuǎn)錄感興趣基因。pBAD表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)由特定碳源(諸如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在而容許感興趣蛋白質(zhì)或多肽的緊密控制的、可滴定的表達(dá)(Guzman等(1995)JBacteriology177(14):4121-30)。獨(dú)特地設(shè)計pBAD載體以對表達(dá)水平給予精確的控制。在araBAD啟動子處啟動來自pBAD載體的異源基因表達(dá)。啟動子受到araC基因產(chǎn)物的正向和負(fù)向調(diào)控。AraC是與L-阿拉伯糖形成復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。在沒有L-阿拉伯糖的情況中，AraC二聚體阻斷轉(zhuǎn)錄。為了最大限度的轉(zhuǎn)錄激活，需要兩種事件(i.)L-阿拉伯糖結(jié)合至AraC,這容許轉(zhuǎn)錄開始；(ii.)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP復(fù)合物結(jié)合至DNA,并刺激AraC結(jié)合至啟動子區(qū)的正確位置。^c表達(dá)系統(tǒng)容許大腸桿菌中自化c啟動子的高水平、可調(diào)型表達(dá)。,rc表達(dá)載體已經(jīng)得到了優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)真核基因。^c啟動子是自色氨酸Op)和乳糖(/ac)啟動子衍生的雜合強(qiáng)啟動子。它受到lacO操縱基因和lacIQ基因產(chǎn)物的調(diào)控(Brosius,J.(1984)Gene27(2):161-72)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何轉(zhuǎn)化方法來實(shí)施本文中所公開的載體對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而且可以以完整細(xì)胞或以原生質(zhì)體(即包括細(xì)胞質(zhì))來轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞。例示性的轉(zhuǎn)化方法包括穿孔法例如電穿孔、原生質(zhì)體融合、細(xì)菌接合、和二價陽離子處理例如氯化4丐處理或CaCl/Mg^處理、或本領(lǐng)域中其它公知方法。參見例如Morrison,J.Bact.，132:349-351(1977);Clark-Curtiss和Curtiss,MethodsinEnzymology，101:347-362(Wu等編，1983);Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第2版,1989);Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990);及CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等編，1994)。H.宿主細(xì)胞在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對于將可操作連接的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)或靶向入胞外空間中有用的表達(dá)系統(tǒng)。在一個實(shí)施方案中，此系統(tǒng)利用分泌信號肽。在另一個實(shí)施方案中，該表達(dá)系31統(tǒng)是用于表達(dá)包含本文中所公開的分泌信號的蛋白質(zhì)的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的這個方面基于如下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即熒光假單胞菌能夠正確地加工和靶向來自熒光假單胞菌和非熒光假單胞菌系統(tǒng)兩者的分泌信號。在此實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門(Proteobacteria)亞組18"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組18"定義為物種熒光假單胞菌的所有亞種、變種、菌抹和其它亞物種單位的組，包括那些屬于例如下列各項(xiàng)的(圓括號中顯示了例示性菌株的ATCC或其它保藏號)熒光假單胞菌生物型A,也稱為生物變型1或生物變型I(ATCC13525);熒光假單胞菌生物型B，也稱為生物變型2或生物變型II(ATCC17816);熒光假單胞菌生物型C，也稱為生物變型3或生物變型III(ATCC17400);焚光4叚單胞菌生物型F，也稱為生物變型4或生物變型IV(ATCC12983);熒光^i單力包菌生物型G，也稱為生物變型5或生物變型V(ATCC17518);熒光假單胞菌生物變型VI;熒光假單胞菌PfO-l;熒光假單胞菌Pf-5(ATCCBAA-477);熒光假單胞菌SBW25;及熒光假單胞菌纖維素亞種(NCIMB10462)。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組19"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組19"定義為熒光假單胞菌生物型A的所有菌抹的組。此生物型的特別優(yōu)選的菌株是熒光假單胞菌菌抹MBIOI(參見Wilcox的美國專利5,169，760)及其衍生物。它優(yōu)選的衍生物的例子是熒光假單胞菌菌抹MB214，它是通過將天然大腸桿菌PlacI-lacI-lacZYA構(gòu)建體(即其中刪除了PlacZ)插入MB101染色體"W(天冬氨酸脫氬酶基因)基因座中而構(gòu)建的。可在本發(fā)明中使用的別的熒光假單胞菌菌林包括熒光假單胞菌Migula和熒光假單胞菌Loitokitok，其具有下列ATCC名稱[NCIB8286];NRRLB-1244;NCIB8865菌抹C01;NCIB8866菌林032;1291[ATCC17458;IFO15837;NCIB8917;LA;NRRLB-1864;吡咯烷；PW2[ICMP3966;NCPPB967;NRRLB-899];13475;NCTC10038;NRRLB-1603[6;IFO15840];52-1C;CCEB488-A[BU140];CCEB553[EM15/47];IAM1008[AHH畫27];IAM1055[AHH-23];1[IFO15842];12[ATCC25323;NIH11;denDoorendeJong216];18[IFO15833;WRRLP-7];93[TR隱10];108[52-22;IFO15832];143[IFO15836;PL];149[2-40-40;IFO15838];182[IFO3081;PJ73];184[IFO15830];185[W2L-1];186[IFO15829;PJ79];187[NCPPB263];188[NCPPB316];189[PJ227;1208];191[IFO15834;PJ236;22/1];194[KlingeR-60;PJ253];196[PJ288];197[PJ290];198[PJ302];201[PJ368];202[PJ372];203[PJ376];204[IFO15835;PJ682];205[PJ686];206[PJ692];207[PJ693];208[PJ722];212.[PJ832];215[PJ849];216[PJ885];267[B-9];271[B-1612];401[C71A;IFO15831;PJ187];NRRLB-3178[4;IFO.15841];KY8521;3081;30-21;[IFO3081];N;PYR;PW;D946-B83[BU2183;FE腿畫P3328];P-2563[FERM-P2894;IFO13658];IAM-1126[43F];M-l;A506[A5-06];A505[A5-05-l];A526[A5-26];B69;72;NRRLB-4290;PMW6[NCIB11615];SC12936;Al[IFO15839];F1847[CDC-EB];F1848[CDC93];NCIB10586;P17;F畫12;AmMS257;PRA25;6133D02;6519E01;Ni;SC15208;BNL畫WVC;NCTC2583[NCIB8194];H13;1013[ATCC11251;CCEB295];IFO3903;1062;或Pf-5。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是能夠生成感興趣蛋白質(zhì)或多肽的任何細(xì)胞，包括上文所描述的熒光假單胞菌細(xì)胞。由于它們在大型分批培養(yǎng)中相對便宜的生長要求和生產(chǎn)蛋白質(zhì)的潛在能力，用于生成感興趣蛋白質(zhì)或多肽的最常用系統(tǒng)包括某些細(xì)菌細(xì)胞(特別是大腸桿菌)。酵母也用于表達(dá)生物學(xué)有關(guān)蛋白質(zhì)和多肽，特別是出于研究目的。系統(tǒng)包括釀酒酵母(&cc/zara，cescerev"/ae)或巴斯德畢赤氏酵母(P/c/n'a/a加r&)。這些系統(tǒng)是充分表征的，一般提供可接受水平的總蛋白質(zhì)表達(dá)，而且是比較快速且便宜的。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也已經(jīng)顯現(xiàn)為用于表達(dá)生物學(xué)活性形式的重組蛋白的備選。在一些情況中，可生成經(jīng)翻譯后修飾的正確折疊的蛋白質(zhì)。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)也已經(jīng)用于表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)在小規(guī)模上通常是有效的。某些生物制品可自蛋白質(zhì)衍生，特別是在動物或人保健應(yīng)用中。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，包括但不限于煙草細(xì)胞、玉米、來自擬南芥(Arabidopsis)物種的細(xì)胞、馬鈴薯或稻細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，在過程中分析或修^飾多細(xì)胞生物體，包括但不限于轉(zhuǎn)基因生物體。用于分析和/或修飾多細(xì)胞生物體的技術(shù)一般基于記載用于修飾下文所述細(xì)胞的技術(shù)。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是原核生物，諸如細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)或假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。典型的纟田菌纟田月包i己載于<列長口"BiologicalDiversity:BacteriaandArchaeans",即由MJFarabee十專士(EstrellaMountainCommunityCollege,Arizona,USA)在網(wǎng)^占33www.emc.maricotpa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity提供的在線生物學(xué)書籍的一章。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是^f叚單胞菌細(xì)胞，而且通常可以是熒光假單胞菌細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞也可以是大腸桿菌細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞，包括但不限于來自灰翅夜蛾屬(Spodoptera)、粉紋夜蛾屬(Trichoplusia)、果蟲黽屬(Drosophila)或頂燈蛾屬(Estigmene)物種的細(xì)月包，或哺乳動物細(xì)月包，包括但不限于鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、猴、靈長類或人細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)菌分類單位的成員。例如，細(xì)胞可以是真細(xì)菌的任何物種的成員。宿主可以是下組分類單位之任一種的成員酸桿菌門(Acidobacteria)、放線桿菌門(Actinobacteira)、產(chǎn)液菌門(Aquificae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、衣原體門(Chlamydiae)、綠屈撓菌門(Choroflexi)、金礦菌門(Chrysiogenetes)、藍(lán)纟田菌門(Cyanobacteria)、脫纟失才干菌門(Deferribacteres)、異常J求菌(Deinococcus)、網(wǎng)團(tuán)菌門(Dictyoglomi)、絲狀桿菌門(Fibrobacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)、才麥桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、硝'4b螺S走菌門(Nitrospirae)、浮霉4犬菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、熱微菌門(Thermomicrobia)、棲熱袍菌門(Thermotogae)、棲熱菌屬(Thermus)(棲熱菌目(Thermales))、或疣微菌門(Verrucomicrobia)。在真細(xì)菌宿主細(xì)胞的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是真細(xì)菌(除藍(lán)細(xì)菌門之外)的任何物種的成員。細(xì)菌宿主還可以是變形菌門的任何物種的成員。變形菌門宿主細(xì)胞可以是分類單位a-變形菌綱、(3-變形菌綱、Y-變形菌綱、5-變形菌綱或e-變形菌綱中任一種的成員。另夕卜，宿主可以是分類單位a-變形菌綱、|3-變形菌綱或，變形菌綱中任一種的成員，和Y-變形菌綱的任何物種的成員。在Y-變形菌綱宿主的一個實(shí)施方案中，宿主會是分類單位氣單胞菌目(Aeromonadales)、交替單胞菌目(Alteromonadales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、，支單月包菌目(Pseudomonadales)、或黃單月包菌目(Xanthomonadales)中任一種的成員；或腸桿菌目或假單胞菌目的任何物種的成員。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是腸桿菌目的，宿主細(xì)胞會是腸桿菌科的成員，或可以是歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、或沙雷氏菌屬(Serratia)中任一種的成員；或埃希氏菌屬的成員。若宿主細(xì)胞是假單胞菌目的，則宿主細(xì)胞可以是假單胞菌科的成員，包括假單胞菌屬。y-變形菌綱宿主包括物種大腸桿菌的成員和物種熒光假單胞菌的成員。其它假單胞菌生物體也可能是有用的。假單胞菌和緊密相關(guān)的物種包括革蘭氏陰性變形菌門亞組1，其包括屬于由R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(編):Bergey，sManualofDeterminativeBacteriology,頁217-289(第8版，1974)(TheWilliams&WilkinsCo"Baltimore,Md"USA)(下文中的"Bergey(1974)，，)以"革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌"描述的科和/或?qū)俚淖冃尉T組。表4呈現(xiàn)了這些科和屬的生物體。_<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在此標(biāo)題中的變形菌門。該標(biāo)題還包括先前分類在此部分中但不再在此部分中的組，諸如食酸菌屬(Acidovorax)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、氫嗟胞菌屬(Hydrogenophaga)、海洋單胞菌屬(Oceanimonas)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(及自其衍生的屬芽單胞菌屬(Blastomonas))(其通過對屬于黃單胞菌屬(且先前稱為黃單胞菌屬的種)的生物體重新分組而創(chuàng)建)、酸單胞菌屬(Acidomonas)(其通過對屬于Bergey(1974)中定義的酸桿菌屬(Acetobacter)的生物體重新分組而創(chuàng)建)。另夕卜，宿主可包括來自下組的細(xì)胞假單胞菌屬、海洋假單胞菌CP^i^o/wwase朋/Za)(ATCC14393)、生黑假單胞菌(尸化M6fomowa5w/gn/ac/e"w〕(ATCC19375)、和腐敗假單胞菌CP^Wowo"oy/7M&e/"c/e"力(ATCC8071)，它們已經(jīng)分別被重新分類為河豚毒素交替單胞菌C4/ferawowos/2a/o//a"A:他)、產(chǎn)黑交替單月包菌(yi/ferawo"os"/gn》c/em1)、牙口腐敗交替單月包菌pM^e々c/e附)。類4以i也，例^口后來食酉臾々支單月包菌(尸化W(iomowasacWovorafra)(ATCC15668)和睪丸酮假單胞菌CPwwtfowo"os^WoWerawe)(ATCCU996)已經(jīng)被分別重新分類為食酸叢毛單胞菌(Comamo"osac/(iovonms)和睪丸酮叢毛單胞菌(Ow^mo"os而生黑假單胞菌(ATCC1M乃)和殺魚假單胞菌(尸"w^mo"osp&c/cWa)(ATCC15057)已經(jīng)被分別重新分類為生黑假交替單月包菌(i^ewdoa/^rawoMOSm'gnyhcz'e"s)禾口殺魚有i交替單月包菌(尸化i^oateramo"oy/&c/cWa)。"革蘭氏陰性變形菌門亞組l"還包括變形菌門中分類為屬于任何如下科的假單胞菌科、固氮菌科(現(xiàn)在通常以同義詞即假單胞菌科的"固氮菌組"稱呼)、根瘤菌科、和甲基單胞菌科(現(xiàn)在通常以同義詞即"曱基球菌科"稱呼)。因此，在那些于本文中其它部分所述的屬之外，變形菌門中落入"革蘭氏陰性變形菌門亞組r內(nèi)的其它屬包括l)嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilus)的固氮菌組細(xì)菌；2)纖維弧菌屬(Cellvibrio)、寡源桿菌屬(Oligella)、和Teredinibacter的假單胞菌科細(xì)菌；3)螯合桿菌屬(Chelatobacter)、劍菌屬(Ensifer)、Liberibacter(也稱為"CandidatusLiberibacter")、和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的才艮瘤菌科細(xì)菌；及4)曱基細(xì)菌屬(Methylobacter)、曱基暖菌屬(Methylocaldum)、曱基《鼓菌屬(Methylomicrobium)、曱基八疊^求菌屬(Methylosarcina)、和曱基3求形菌屬(Methylosphaera)的曱基球菌科細(xì)菌。36在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"定義為下列屬(在圓括號中指明產(chǎn)品目錄列出的、公眾可獲得的、已保藏的其菌抹的總數(shù)，均保藏于ATCC,除非另有指明)的變形菌門組酸單胞菌屬(2);酸桿菌屬(93);葡糖桿菌屬(37);短波單胞菌屬(23);拜葉林克氏菌屬(Beyerinckia)(13);德克斯氏菌屬(2);布魯氏菌屬(4);土壤桿菌屬(79);螯合桿菌屬(2);劍菌屬(3);根瘤菌屬(144);中華根瘤菌屬(24);芽單胞菌屬(l);鞘氨醇單胞菌屬(27);產(chǎn)堿菌屬(88);博德特氏菌屬(43);伯克霍爾德氏菌屬(73);羅爾斯通氏菌屬(33);食酸菌屬(20);氫噬胞菌屬(9);動膠菌屬(9);曱基細(xì)菌屬(2);甲基暖菌屬(在NCIMB的1種)；曱基球菌屬(2);曱基微菌屬(2);曱基單胞菌屬(9);曱基八疊球菌屬(l);曱基球形菌屬；氮單胞菌屬(9);嗜氮根瘤菌屬(5);固氮菌屬(64);纖維弧菌屬C3);寡源桿菌屬(》;假單胞菌屬(1U9);弗朗西絲氏菌屬(4);黃單胞菌屬(229);寡養(yǎng)單胞菌屬(50);和海洋單胞菌屬(4)。"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"的例示性宿主細(xì)胞物種包括但不限于下列細(xì)菌(在圓括號中顯示其例示性菌抹的ATCC或其它保藏號)曱醇酸單胞菌(v4c油,wosmd/za/7o//c(3)(ATCC43581);醋化醋桿菌(v4c"o6a"erace")(ATCC15973);氧化葡糖桿菌(G/wco"o6a"erox;^ms)(ATCC19357);缺陷短波單胞菌(5vM"&wowwc^m'"wto)(ATCC11568);印度拜葉林克氏菌(5ez)'en'"ch'a/"cfca)(ATCC9039和ATCC19361);月交德克斯氏菌(Deo;z'agwmmosa)(ATCC15994);馬耳他布魯氏菌(Bn/ce〃ame/"era&)(ATCC23456);流產(chǎn)布魯氏菌(5race〃aWom^)(ATCC23448);根癌土壤桿菌^4gro6acfen'Mmfwwey^c/^w)(ATCC23308)、》欠射形土;泉^干菌(^4gro6acfen.MWraWo6acer)(ATCC19358)、發(fā)才艮土i裏才干菌(v4gra6acten'wmWzizogewes)(ATCC11325);何氏螯合桿菌(C/2e/ato6ac&r/ze/"te")(ATCC29600);粘著劍菌(￡>wzy^a<i/aerera)(ATCC33212);3兄豆才艮瘤菌(i/z/zo6/ww/egww/wosan/m)(ATCC10004);費(fèi)氏中華根瘤菌CS/"0r/^0Wwm/m^')(ATCC35423);祝osto附o"as"fl加cWa(ATCC35951);少動鞘氛醇單胞菌0Sp/z/"gowo"ospaw".mc^7/力(ATCC29837);糞產(chǎn)石咸菌(」/c"/^e"as/aecafc)(ATCC8750);百曰咳博德特氏菌(5orafefe〃apeWMM&)(ATCC9797);洋蔥伯克霍爾德氏菌(5w^/zo/(ie"'acepac/a)(ATCC25416);皮氏羅爾斯通氏菌屬(ia/加w.ap/cA:她7)(ATCC27511);敏捷食酸菌04"^/^0^^/""7/力(ATCC11228);黃色氬嗟胞菌37(外(irage"0//2aga_/7av")(ATCC33667);生枝動月交菌(Zoog7oearamz.gera)(ATCC19544);藤黃曱基細(xì)菌(Me^y/o&cter/wfewj)(ATCC49878);Me^/ocaW誦gra"7e(NCIMB11912);莢膜曱基球菌(Me勿/ococ，ca;ww/a^y)(ATCC19069);活潑甲基孩i菌(Me^y/om/croZ)/wmag/Ze)(ATCC35068);曱烷曱基單胞菌(Me決y/owo"oymeAaw'ca)(ATCC35067);Me^y/ayara'""(ATCC700909);Me/Z^/c^/^raZz(msom7(ACAM549);敏捷氮單胞菌(^bomo"oyag/fc)(ATCC7494);雀稗嗜氮根瘤菌(^zor/^op/H7ws/os^a//)(ATCC23833);褐3求固氮菌(Jzotok7cterc/zraococcww)(ATCC9043);混合纖維弧菌(CW/vAn'ow/x似》(UQM2601);尿道寡源桿菌((9//ge〃aweAra/^)(ATCC17960);銅綠假單胞菌CP化wafomowosaen^/"o^)(ATCC10145),熒光假單胞菌(尸化^fowo"os^/7worayce"》(ATCC35858);土拉熱弗朗西絲氏菌CFra"c/"〃a^/a^ra&)(ATCC6223);嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(5fe"o/ra//zo廳wos鵬/鄉(xiāng)M/a)(ATCC13637);野油菜黃單胞菌(J&w決蘭owascam/e欲&)(ATCC33913);和(9ceaw'mo"as(iowcbra,'(ATCC27123)。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組3"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組3"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；土壤桿菌屬；根瘤菌；中華根瘤菌屬；芽單胞菌；鞘氨醇單胞菌屬；產(chǎn)堿菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；曱基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組4"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組4"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；曱基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組5"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組5"定義為下列屬的變形菌門組曱基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組6"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組6"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組7"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組7"定義為下列屬的變形菌門組氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組8"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組8"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組9"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組9"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組10"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組10"定義為下列屬的變形菌門組伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組ll"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組ir定義為下列屬的變形菌門組々i單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組12"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組12"定義為下列屬的變形菌門組伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組13"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組13"定義為下列屬的變形菌門組伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組14"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組14"定義為下列屬的變形菌門組假單胞菌屬和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組15"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組15"定義為假單胞菌屬的變形菌門組。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組16"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組16"定義為下列假單胞菌物種(在圓括號中顯示了例示性菌抹的ATCC或其他保藏號)的變形菌門組尸"wcfowomw<a^etow>/2//a(ATCC700689);銅綠假單胞菌(尸"W(icww"as"en/g/wwa)(ATCC10145);產(chǎn)堿假單胞菌(i^ew(iowowas(ATCC14909);病錄假單胞菌CPsewfifomowosa/7爐.船e/"ca)(ATCC33660);香茅醇假單胞菌(/^ew^/cw20wascZ/raw^/oto)(ATCC13674);變黃假單胞菌(尸化wc/owo"os/7avesce"力(ATCC51555);門多薩假單胞菌(fteWomo"as(ATCC25411);硝基還原假單胞菌(/^ewofomowasm.^"we(iwce/w)(ATCC33634);食';由々支單月包菌(尸sew(iomowaso/eovoram1)(ATCC8062);類產(chǎn)石咸布支單月包菌(i^ewdowo"os/wewcfoa/ca/z'gewes)(ATCC17440);食樹脂W支單胞菌(尸化Mdowo"asw."ovora似)(ATCC14235);稻草假單胞菌(尸wwfifomo""sWraw/wea)(ATCC33636);傘菌假單胞菌(尸seMt/omo/7oyagar/c/)(ATCC25941);尸sew(iomowasa/c"/一z7a;i^ew(iomowaya/g/wovora;i^ewtiowowasaw<ieraom7;鐵角嚴(yán)假單月包菌(尸sewdomowosos//em7)(ATCC23835);壬二酸假單胞菌CPsew(iowowasaze/a/ca)(ATCC27162);拜氏^支單月包菌(/^et/(icwo/7asZeyen'wcA:/()(ATCC19372);Zjoz-ea/^;北》成布支單月包菌(i^ei^iomowasZoreqpo/^)(ATCC33662);尸se^/omowos6rai^/cacean/m;食丁酸j叚單月包菌(尸化z^/omowos6wtowovora)(ATCC43655);i^ewfifowowoce〃w/osa(ATCC55703);桔黃4艮單月包菌(尸sei^/omowasawrafw"aca)(ATCC33663);綠針假單胞菌(尸化i^owo"osc/7/orarap/2&)(ATCC9446，ATCC13985,ATCC17418,ATCC17461);莓實(shí)假單胞菌(尸化z^w7o"^(ATCC4973);隆德假單胞菌CPww/owo"os/ww;few》(ATCC49968);腐臭假單胞菌(i^eMdcwo"astodra/e/w)(ATCC4683);青紫葛"f艮單月包菌(尸sewdomowoyc&w'co/a)(ATCC33616);暈J趕有I單月包菌(尸sew(iomowascorowq/bc/em1);尸sew(iomo"as<i/ter/ew》/z//a;"f申長有I單月包菌(i^ewt/o附o"ose/o"gato)(ATCC10144);彎曲假單胞菌CP"Womo"osy7e"ms)(ATCC12775);產(chǎn)氮假單胞菌(尸化Mt/omowosozo/cj/brmara);6re朋m';尸"z^o,woscec/re〃a;鈹纟丈假單胞菌co/rwg她)(ATCC29736);尸化W(io脂was40ex/re附on'e"to/z's;焚光假單胞菌(/^eMdowowas//Momscem1)(ATCC35858);尸set^iomowasgawaWz.;i^ewt/owowas//6awe肌i;i^ewcfowowas1附a"cfe///(ATCC700871);邊緣假單胞菌(尸化wdomo"oswwg/"a//^(ATCC10844);尸sewcfowo"os/w'gw/ae;審味假單月包菌(尸sew(ilomo"aswwc油/e"力(ATCC4685);東方々支單月包菌(i^ewcfewo"as尸"wc/omo"osr/zodes/ae;類黃"f叚單月包菌(尸sei/(iomowa51j^"xaw^a)(ATCC9890);4乇4立氏々支單月包菌CPsew(icwzo"asto/aos7'z〕(ATCC33618);i^ewcfowowasveraw7(ATCC700474);i^ewt/omowos7^(ien^s6e/^e"w's;彎曲々I單月包菌(尸sewc/cwwwosgem'cw/a/")(ATCC19374);尸化M(iowo"asg/wge"';尸化"(iowo"asgramfm、；格氏假單月包菌(i^ew(iowo"asgh/wo""/);鹽脫氮々支單月包菌(尸^W(io附o"as1/za/o<ie""nyc<ms);嗜鹽，支單月包菌(/^ewt/omowoy/zaf/c;p/7z7a);棲木對堇々支單月包菌(/^ewcfo^70wos/7&c/co/a)(ATCC19867);哈特假單胞菌(尸化w^mo"os/zw衍era&)(ATCC14670);噬氫假單胞菌(T^ewciomowas/^ragewowra);i^eM6fowowasye"em7(ATCC700870);h'/owmy/s;尸sewtiow(was1/朋ceo/ato(ATCC14669);尸sew(iowowas1//m';劃界假單胞菌CP化^/omo"oswwg/"ato)(ATCC25417);臭味假單胞菌膨//zWca)(ATCC33665);脫氮假單月包菌(i^ez^owowastfem'^"訴C(my)(ATCC19244);百曰咳假單胞菌(尸"W(iomowaypeWwc/"ogewa)(ATCC190);皮克特假單胞菌(尸化wcfomomMp/ctoraw)(ATCC23328);尸sewdomowas/syc/^op/n7a;黃4曷々I單月包菌(尸sewcfomow(aw//va)(ATCC31418);蒙氏々支單月包菌(尸seMt/owowas1mo"fe///,)(ATCC700476);尸sew(iomowaymawe/&才西牙舀布支單月包菌(尸"wtfomowosoryzz7za6"ara)(ATCC43272);變形寸叚單胞菌(尸wwcfomo"asp/ecog/oM/c/^;)(ATCC700383);惡臭假單胞菌(尸sewcfomowoypw^fc)(ATCC12633);尸化M(iomowasmactora;多刺布支單胞菌(尸sewfifcwowos—wasa)(ATCC14606);尸sewsfomowos6a/eaWca;淺黃假單月包菌(尸sewcfo腳wos/w加/(3)(ATCC43273);施氏假單胞菌(i^ewcfcwowoss加zeW)(ATCC17588);扁桃假單胞菌CPMW6fowowasaw_ygtfa")(ATCC33614);尸sei^o附owasave〃awae(ATCC700331);番木瓜，I單月包菌(i^ewdcw20wascar/ca/a/ayae)(ATCC33615);菊苣々支單月包菌(尸化Mcfomcwasc/c/zoW)(ATCC10857);天仙果假單胞菌CP"Womo"w,cw化rectoe)(ATCC"1(M);褐鞘假單月包菌ykscovag/"ae);苦才東々i單月包菌(i^e"(iowo"as(ATCC33050);丁香假單胞菌CP"i^omo"oss,/"gae)(ATCC19310);綠黃假單胞菌(尸^^fomo"osv/n^/7"va)(ATCC13223);熱食碳酸假單胞菌^zermocw"6o;qy(iovorara1)(ATCC35961);耐熱"f艮單月包菌(/^ewcfomowoyf/zermoto/eraws);尸se^/omowosf/z/verva/eww^;S顯哥華々支單月包菌v朋com^ms/"(ATCC700688);威斯康辛假單胞菌(尸sewt/owo"asvWsco"w'"em7'力；和廈門々支單月包菌(/^ew6fo附o"os;da附e"e"s&)。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組17"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組17"定義為本領(lǐng)域中稱為"熒光假單胞菌"的變形菌門組，所述熒光假單胞菌包括那些屬于例如下列假單胞菌物種的產(chǎn)氮假單胞菌；i^ewcfowo"osex^ewcWe"to/i^;熒光假單月包菌；i^wcfowo"os;尸化w(/omo"os//Zwwem7i;/^ei^/omowoswawde///;邊纟彖"f艮單月包菌；尸sei/(iowcwas/w'gw/ae;霉味假單胞菌；東方假單胞菌；Wzotfes/ae;類黃假單胞菌；托^立氏作支單月包菌；和尸sewcfowowasverom7。蘭氏(+)變形菌門。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。已經(jīng)為大腸桿菌MG1655建立了大腸桿菌的基因組序列(Blattner等(1997)ThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK-12，Science277(5331):1453-74)，而且對于大腸桿菌K12，DNA微陣列是商品化的(MWGInc,HighPoint,N.C.)。大腸桿菌可在豐富培養(yǎng)基諸如Luria-Bertani(LB)(10g/L胰蛋白胨、5g/LNaCl、5g/L酵母提取物)或具有合適的碳源(諸如1°/。葡萄糖)的限定基本培養(yǎng)基諸如M9(6g/LNa2HP04、3g/LKH2P04、lg/LNH4Cl、0.5g/LNaCl、pH7.4)中培養(yǎng)。常規(guī)的是，將大腸桿菌細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物稀釋，并接種入搖瓶或發(fā)酵罐中的新鮮的豐富培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中，并于37。C培養(yǎng)。宿主也可以是哺乳動物起源的，諸如自包括任何人或非人哺乳動物的哺乳動物衍生的細(xì)胞。哺乳動物可以包括但不限于靈長類、猴、豬(porcine)、綿羊(ovine)、牛、嚙齒類、有蹄類、豬(pig)、豬(swine)、綿羊(sheep)、羔羊、山羊、牛、鹿、騾、馬、猴、猿、犬、貓、大鼠、和小鼠。宿主細(xì)胞也可以是植物起源的。可選擇任何植物來鑒定基因和調(diào)控序列。供基因和調(diào)控序列的分離用的合適的植物耙物的例子會包括但不限于苜蓿(alfalfa)、蘋果(apple)、杏(apricot)、擬南芥(Arabidopsis)、朝鮮薊(artichoke)、芝麻菜(arugula)、，夢(asparagus)、鱘梨(avocado)、香蕉(banana)、大麥(barley)、42豆類(beans)、甜菜(beet)、黑莓(blackberry)、藍(lán)莓(blueberry)、花椰菜(broccoli)、才包子甘藍(lán)(brusselssprouts)、甘藍(lán)(cabbage)、蕓苔(canola)、網(wǎng)纟文瓜(cantaloupe)、胡蘿卜(carrot)、■木薯(cassaya)、蓖麻(castorbean)、花椰菜(cauliflower)、芽菜(celery)、櫻桃(cheny)、菊苣(chicory)、芫荽(cilantro)、柑橘(citrus)、克萊門氏小柑橘(Clementines)、車軸草(clover)、椰子(coconut)、咖啡(coffee)、玉米(corn)、棉(cotton)、酸果蔓(cranberry)、黃瓜(cucumber)、黃杉(Douglasfir)、^S子(eggplant)、苣荬菜(endive)、菊苣(escarole)、按(eucalyptus)、茴香(fennel)、無花果(figs)、蒜(garlic)、葫蘆(gourd)、葡萄(grape)、葡萄柚(grapefruit)、蜜瓜(honeydew)、豆薯(jicama)、獼猴桃(kiwifruit)、萵苣(lettuce)、蔥(leeks)、檸檬(lemon)、來檬(lime)、火炬松(Loblollypine)、亞麻(linseed)、芒果(mango)、舌甘瓜(melon)、蘑菇(mushroom)、油才兆(nectarine)、堅果(nut)、燕麥(oat)、油棕(oilpalm)、油菜(oilseedrape)、-火蔡(okra)、椒沖覽(olive)、蔥(onion)、才計片禹(orange)、觀賞植物、棕櫚(palm)、番木瓜(papaya)、歐芽(parsley)、歐防風(fēng)(parsnip)、S宛豆(pea)、沖兆(peach)、花生(peanut)、梨(pear)、胡祐又(pepper)、沖市子(persimmon)、+>(pine)、鳳梨(pineapple)、車前(plantain)、對每(plum)、石對留(pomegranate)、楊(poplar)、馬鈴薯(potato)、南瓜(pumpkin)、揾梓(quince)、輻射+〉(radiatapine)、菊苣(radiscchio)、蘿卜(radish)、油菜沖予(rapeseed)、懸鉤子(raspberry)、稻(rice)、黑麥(rye)、高粱(sorghum)、南方松(Southernpine)、大豆(soybean)、菠菜(spinach)、西葫蘆(squash)、草蕃(strawberry)、甜菜(sugarbeet)、甘蔗(sugarcane)、向曰蔡(sunflower)、甘募(sweetpotato)、楓香樹(sweetgum)、橘(tangerine)、茶(tea)、煙草(tobacco)、番茄(tomato)、黑小麥(triticale)、草皮(turf)、蕪箐(turnip)、藤(vine)、西瓜(watermelon)、小麥(wheat)、薯蕷(yam)、和綠皮西葫蘆(zucchini)。在一些實(shí)施方案中，所述方法中有用的植物是擬南芥、玉米、小麥、大豆、和棉。III.方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法提供了包含選自下組的分泌信號多肽的融合蛋白的表達(dá)pbp*、dsbA、dsbC、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、ORF5550、Ttg2C、或ORF812分泌信號。在一個實(shí)施方案中，該方法包括表達(dá)連接至本發(fā)明的分泌信號的感興趣蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。該方法包括提供如下宿主細(xì)胞(優(yōu)選熒光假單胞菌宿主細(xì)胞)，其包含編碼包含可操作連接至本文中所公開的分泌信號序列的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的重組蛋白的載體，并在導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞?；蛘撸褂盟b定的分泌信號來表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方法可以在任何給定的宿主系統(tǒng)(包括真核或原核起源的宿主細(xì)胞)中使用。所述載體可具有上文所述特征之任一項(xiàng)。在一個實(shí)施方案中，載體包含編碼本文中公開為SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的分泌信號多肽或其變體和片段的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，載體包含包含SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、20、21、或23的核苦酸序列。在另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有周質(zhì)，并且分泌信號多肽的表達(dá)導(dǎo)致基本上所有的感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至細(xì)胞周質(zhì)。認(rèn)識到周質(zhì)中的小部分所表達(dá)蛋白質(zhì)實(shí)際上可穿過細(xì)胞膜而泄露入胞外空間中；然而，大部分的靶向多肽會保留在周質(zhì)間隙內(nèi)。表達(dá)可以進(jìn)一步導(dǎo)致胞外蛋白質(zhì)的生成。該方法還可包括從周質(zhì)或從胞外培養(yǎng)基中純化感興趣蛋白質(zhì)或多肽的步驟。分泌信號可以以如下方式表達(dá)，其中它是連接至蛋白質(zhì)的，且可自細(xì)胞純化與信號連接的蛋白質(zhì)。因此，在一個實(shí)施方案中，這種分離的多肽是分泌信號與感興趣蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白。然而，在將蛋白質(zhì)靶向至周質(zhì)后，也可自蛋白質(zhì)切除分泌信號。在一個實(shí)施方案中，對分泌信號和蛋白質(zhì)或多肽之間的連接進(jìn)行修飾以提高對分泌信號的切割。本發(fā)明的方法還可導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)感興趣蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)量(production)增加?；蛘?，產(chǎn)量增加可以是每克所生成蛋白質(zhì)或每克宿主蛋白質(zhì)中正確加工的蛋白質(zhì)或多肽的水平升高。產(chǎn)量增加還可以是每克重組物或每克宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)中所生產(chǎn)的可回收蛋白質(zhì)或多肽的水平升高。產(chǎn)量增加還可以是總蛋白質(zhì)的水平升高、正確加工的蛋白質(zhì)的水平升高、或有活性的或可溶性的蛋白質(zhì)的水平升高的任意組合。在此實(shí)施方案中，術(shù)語"升高的"是相對于沒有本發(fā)明的分泌信號多肽的情況中在細(xì)胞中表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽時生成的、正確加工的、可i^性的、和/或可回收的蛋白質(zhì)或多肽的水平而言的。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)改善也可指蛋白質(zhì)溶解度的增加?？缮筛信d趣蛋白質(zhì)或多肽，并自宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或胞外培養(yǎng)基回收。蛋白質(zhì)或多肽可以是不溶的或可溶的。蛋白質(zhì)或多肽可包括一種或多種耙向序列以幫助純化，如上文所討論的。如本文中所使用的，術(shù)語"可溶的"指通過以約5,000和20,000x重力之間的離心在旋轉(zhuǎn)10-30分鐘后在生理學(xué)條件下的緩沖液中蛋白質(zhì)不被沉淀?？扇苄缘鞍踪|(zhì)不是包含體或其它沉淀塊的一部分。類似地，"不溶的"指通過以5，000和20,000x重力之間的離心在旋轉(zhuǎn)10-30分鐘后在生理學(xué)條件下的緩沖液中蛋白質(zhì)或多肽可被沉淀。不溶性蛋白質(zhì)或多肽可以是包含體或其它沉淀塊的一部分。術(shù)語"包含體"意圖包括細(xì)胞內(nèi)含有的任何胞內(nèi)體，其中已經(jīng)隔離蛋白質(zhì)或多肽的聚集體。本發(fā)明的方法可生成定位于宿主細(xì)胞周質(zhì)的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中生成正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽。在另一個實(shí)施方案中，分泌信號多肽的表達(dá)可以在細(xì)胞中生成有活性的感興趣蛋白質(zhì)或多肽。與沒有本發(fā)明的分泌信號的情況中表達(dá)蛋白質(zhì)時相比，本發(fā)明的方法還可導(dǎo)致感興趣蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)率(yield)提高。在一個實(shí)施方案中，該方法在周質(zhì)區(qū)室中生成至少0.1g/L蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中生成0.1-10g/L周質(zhì)蛋白質(zhì)，或至少約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或至少約1.0g/L周質(zhì)蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，所生成的總體感興趣蛋白質(zhì)或多肽是至少1.0g/L、至少約2g/L、至少約3g/L、約4g/L、約5g/L、約6g/L、約7g/L、約8g/L、約10g/L、約15g/L、約20g/L、至少約25g/L、或更多。在一些實(shí)施方案中，所生成的周質(zhì)蛋白質(zhì)的量是所生成的總體感興趣蛋白質(zhì)或多肽的至少約5。/。、約10%、約15%、約20%、約25%、約30°/。、約40%、約50%、約60°/。、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98°/0、約99%、或更多。在一個實(shí)施方案中，該方法生成至少0.1g/L正確加工的蛋白質(zhì)。正確加工的蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)的氨基端。在一些實(shí)施方案中，至少50%的感興趣蛋白質(zhì)或多肽包含天然氨基端。在另一個實(shí)施方案中，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或更多的蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)的氨基端。在多個實(shí)施方案中，該方法在細(xì)胞中生成O.1-1Og/L正確加工的蛋白質(zhì)，包括至少約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或至少約1.0g/L正確加工的蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，所生成的總體、正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽是至少1.0g/L、至少約2g/L、至少約3g/L、約4g/L、約5g/L、約6g/L、約7g/L、約8g/L、約10g/L、約15g/L、約20g/L、約25g/L、約30g/L、約35g/1、45約40g/1、約45g/1、至少約50g/L、或更大。在一些實(shí)施方案中，所生成的正確加工的蛋白質(zhì)的量是正確加工形式的總體重組蛋白的至少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40°/。、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、至少約99%、或更多。本發(fā)明的方法還可導(dǎo)致感興趣蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)率提高。在一個實(shí)施方案中，該方法生成占總體細(xì)胞蛋白質(zhì)(tcp)的至少約5。/。、至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70°/。、約75%、或更大的感興趣蛋白質(zhì)或多肽。"百分比總體細(xì)胞蛋白質(zhì)"是宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)或多肽的量占聚集細(xì)胞蛋白質(zhì)的百分比。百分比總體細(xì)胞蛋白質(zhì)的測定在本領(lǐng)域中是公知的。在一個具體的實(shí)施方案中，在礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)(即于約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)，包括約10。C、約15。C、約20。C、約25。C、約30。C、約35。C、約40。C、約45。C、和約50。C)時，宿主細(xì)胞可以具有至少l。/otcp的重組多肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段表達(dá)水平和至少40g/L的細(xì)胞密度。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在礦物鹽培養(yǎng)基中以至少約10L發(fā)酵規(guī)模培養(yǎng)(即于約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)，包括端點(diǎn))時，表達(dá)系統(tǒng)會具有至少5。/otcp的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)水平和至少40g/L的細(xì)胞密度。實(shí)際上，通常在培養(yǎng)基中找到靶向至周質(zhì)的異源蛋白質(zhì)(參見歐洲專利號EP0288451)，這可能是由于對細(xì)胞外膜的破壞或細(xì)胞外膜流動性的增加。這種"被動"分泌的速率可以通過使用透化細(xì)胞外膜的多種機(jī)制來提高大腸菌素(Miksch等(1997)Arch.Microbiol.167:143-150);生長速率(Shokri等(2002)AppMiocrobiolBiotechnol58:386-392);TolIII過表達(dá)(Wan和Baneyx(1998)ProteinExpressionPurif.14:13-22);細(xì)菌素釋放蛋白(Hsiung等(1989)Bio/Technology7:267-71);大腸菌素A溶解蛋白(Lloubes等(1993)Biochimie75:451-8)突變體，其泄露周質(zhì)蛋白質(zhì)(Furlong和Sundstrom(1989)DevelopmentsinIndus.Microbio.30:141-8);鬲蟲合酉己J禺體(Jeong禾口Lee(2002)AppLEnviron.Microbio.68:4979-4985);通過滲壓震擾進(jìn)行的回收(Taguchi等(1990)BiochimicaBiophysicaActa1049:278-85)。工程化蛋白質(zhì)向周質(zhì)間隙的轉(zhuǎn)運(yùn)(隨后定位于培養(yǎng)基中)已經(jīng)用于在大腸桿菌中生成正確折疊的且有活性的蛋白質(zhì)(Wan和Baneyx(1998)ProteinExpressionPurif.14:13-22;Simmons等(2002)J.Immun.Meth.263:133-147;Lundell等(1990)J.Indust.Microbio.5:215-27)。A.活性蛋白質(zhì)的生成在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)也可以以活性形式生成。術(shù)語"有活性的"指生物學(xué)活性的存在，其中所述生物學(xué)活性與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)或多肽的生物學(xué)活性相當(dāng)或基本上對應(yīng)。在蛋白質(zhì)的背景中，這通常意味著多核苷酸或多肽包含在使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)衡量時與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)或多肽相比具有至少約20%、約50%、優(yōu)選至少約60-80%、最優(yōu)選至少約90-95%活性的生物學(xué)功能或效應(yīng)?？梢岳脤μ囟ǖ牡鞍踪|(zhì)或多肽相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)靶向比較生物學(xué)測定法來實(shí)施蛋白質(zhì)或多肽活性測定。感興趣蛋白質(zhì)或多肽維持生物學(xué)活性的一種指征是多肽與天然多肽有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。本發(fā)明還能改善有活性的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的回收?；钚缘鞍踪|(zhì)可具有衍生該序列的天然蛋白質(zhì)或多肽的比活的至少約20%、至少約30%、至少約40%、約50%、約60%、至少約70%、約80%、約90%、或至少約95%的比活。此外，任選地，底物特異性(kcat/KJ基本上類似于天然蛋白質(zhì)或多肽。通常，keat/Km會是至少約30。/。、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、至少約90%、至少約95%、或更大。測定和量化蛋白質(zhì)和多肽活性和底物特異性(k^/KJ的度量的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性也可以與先前建立的天然蛋白質(zhì)或多肽標(biāo)準(zhǔn)活性進(jìn)行比較?；蛘?，感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性可以在同時的、或基本上同時的比較測定法中與天然蛋白質(zhì)或多肽一起測定。例如，可以使用體外測定法來測定感興趣蛋白質(zhì)或多肽與靶物之間(例如所表達(dá)的酶與底物之間，所表達(dá)的激素與激素受體之間，所表達(dá)的抗體與抗原之間等)的任何可檢測的相互作用。此檢測可包括量熱變化、增殖變化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞排斥、放射性變化、溶解度變化、通過凝膠電泳和/或凝膠排阻方法所測量的分子量變化、磷酸化能力、抗體特異性測定法(諸如ELISA測定法)等的測量。另夕卜，體內(nèi)測定法包括但不限于用于檢測與天然蛋白質(zhì)或多肽的生理學(xué)效應(yīng)相比假單胞菌所生成的蛋白質(zhì)或多肽的生理學(xué)效應(yīng)(例如重量增加、電解質(zhì)平衡的變化、血液凝固時間的變化、凝塊溶解的變化和抗原應(yīng)答的誘導(dǎo))的測定法。一般而言，可以使用任何體外或體內(nèi)測定法來測定容許與天然蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行比較分析的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性性質(zhì)，只要此類活性是可測定的。或者，可以對本發(fā)明中所生成的蛋白質(zhì)或多肽測定刺激或抑制蛋白質(zhì)或多肽和通常與所述蛋白質(zhì)或多肽相互作用的分子(例如信號途徑中通常與天然蛋白質(zhì)相互作用的成分或底物)之間的相互作用的能力。此類測定法通?？梢园ㄈ缦虏襟E，即在容許蛋白質(zhì)或多肽與靶分子相互作用的條件下組合蛋白質(zhì)與底物分子，并檢測蛋白質(zhì)與靶分子相互作用的生化后果?？捎糜跍y定蛋白質(zhì)或多肽活性的測定法記載于例如Ralph,P.J.等(1984)J.Immunol.132:1858或Saiki等(1981)J.Immunol.127:1044;Steward,W,E.II(1980)TheInterferonSystems.Springer-Verlag，Vienna和NewYork;Broxmeyer,H.E.等(1982)Blood60:595;MolecularCloning:ALaboratoryManua",第2版:ColdSpringHarborLaboratoryPress,Sambrook，J.，E.RFritsch和T.Maniatis編:1989;及MethodsinEnzymology:GuidetoMolecularCloningTechniques,AcademicPress,Berger,S.L.和A.R.Kimmel編，1987;AKPatra等，ProteinExprPurif,18(2):p/182-92(2000);Kodama等，J.Biochem.99:1465-1472(1986);Stewart等，Proc.Nat，lAcad.Sci.USA90:5209-5213(1993);Lombillo等，J.CellBiol.128:107-115(1995);Vale等,Cell42:39-50(1985)。B.細(xì)胞生長條件本文中所描述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞生長條件可以包括促進(jìn)感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)的，和/或促進(jìn)所表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的發(fā)酵的。如本文中所使用的，術(shù)語"發(fā)酵"包括采用字面上的發(fā)酵的實(shí)施方案和采用其它非發(fā)酵培養(yǎng)模式的實(shí)施方案兩者。發(fā)酵可以以任何規(guī)模實(shí)施。在一個實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以自豐富培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、和礦物鹽培養(yǎng)基中選擇；可使用豐富培養(yǎng)基，但優(yōu)選避免豐富培養(yǎng)基。在另一個實(shí)施方案中，選擇基本培養(yǎng)基或礦物鹽培養(yǎng)基。在又一個實(shí)施方案中，選擇基本培養(yǎng)基。在又一個實(shí)施方案中，選擇礦物鹽培養(yǎng)基。礦物鹽培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的。礦物鹽培養(yǎng)基由礦物鹽和碳源(諸如例如葡萄糖、蔗糖、或甘油)組成。礦物鹽培養(yǎng)基的例子包括例如M9培養(yǎng)基、假單胞菌培養(yǎng)基(ATCC179)、Davis和Mingioli培養(yǎng)基(參見BDDavis和ESMingioli(1950)J.Bact.60:17-28)。用于構(gòu)成礦物鹽培養(yǎng)基的礦物鹽類包括那些自例如磷酸鉀、碌u酸銨或氯化銨、硫酸鎂或氯化鎂、和痕量礦物(諸如氯化4丐、硼酸鹽、及鋅、錳、銅和鐵的硫酸鹽)之中選擇的。礦物鹽培養(yǎng)基中不包括有機(jī)氮源，諸如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。使用無機(jī)氮源代替，并且這可以自例如銨鹽、氨水、和氨氣中選擇。一種優(yōu)選的礦物鹽培養(yǎng)基會含有作為碳源的葡萄糖。與礦物鹽培養(yǎng)基相比，基本培養(yǎng)基也可以含有礦物鹽和碳源，但是可以補(bǔ)充有例如低水平的氨基酸、維生素、蛋白胨、或其它成分，雖然這些以極低水平添力口。在一個實(shí)施方案中，可以使用下文表5中所列的成分來制備培養(yǎng)基?？梢砸匀缦马樞蛱砑痈鞒煞质紫瓤蓪?NH4)HP04、KH2P04和檸檬酸溶解于約30L蒸餾水中；然后可添加痕量元素的溶液，接著添加消泡劑，諸如UcolubN115。然后，熱滅菌(諸如于約121。C)后，可以添加葡萄糖MgS04和鹽酸石克胺素的無菌溶液。可以使用氨水來將pH控制在約6.8。然后可添加無菌蒸鎦水來將起始體積調(diào)至371減去甘油原液(123mL)。化學(xué)品可以購自多個供應(yīng)商，諸如Merck。對于假單胞菌物種和相關(guān)細(xì)菌的生長，這種培養(yǎng)基能容許高細(xì)胞密度培養(yǎng)(HCDC)。HCDC可以以分批過程開始，接著是兩階段補(bǔ)料-分批培養(yǎng)。在分批部分中不受限制的生長后，可以在3個倍增時間的期間里將生長控制在降低的比生長速率，其中生物質(zhì)濃度可增加數(shù)倍。此類培養(yǎng)規(guī)程的進(jìn)一步詳情記載于Riesenberg，D,;Schulz,V.;Knorre，W.A.;Pohl,H.D.;Korz,D.;Sanders,E.A.;Ross,A.;Deckwer,W.D.(1991)"Highcelldensitycultivationof.Escherichiacoli，atcontrolledspecificgrowthrate"JBiotechnol:20(1)17-27。表5:培養(yǎng)基組成<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可以以任何發(fā)酵形式培養(yǎng)。例如，本文中可采用分批、補(bǔ)料-分批、半連續(xù)、和連續(xù)發(fā)酵模式。若蛋白質(zhì)被分泌入胞外培養(yǎng)基中，則優(yōu)選連續(xù)發(fā)酵。依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)對于任何發(fā)酵規(guī)模(即體積)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是有用的。如此，例如可以使用微升規(guī)模、厘升規(guī)模、和分升規(guī)^莫發(fā)酵體積；并且可以使用l升規(guī)模和更大的發(fā)酵體積。在一個實(shí)施方案中，發(fā)酵體積會處于或超過1升。在另一個實(shí)施方案中，發(fā)酵體積會處于或超過5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、l，OOO升、2,000升、5,000升、IO，OOO升、或50，000升。在本發(fā)明中，在容許宿主細(xì)胞生存的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選于約4。C-約55。C的范圍內(nèi)(包括端點(diǎn))的溫度實(shí)施受轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的生長、培養(yǎng)和/或發(fā)酵。如此，例如如本文中關(guān)于本發(fā)明宿主細(xì)胞所使用的，術(shù)語"生長"、"培養(yǎng)"和"發(fā)酵"內(nèi)在地指約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)(包括端點(diǎn))的"生長"、"培養(yǎng)"和"發(fā)酵"。另外，"生長"用于指明活躍的細(xì)胞分裂和/或擴(kuò)大的生物學(xué)狀態(tài)以及非分裂和/或非擴(kuò)大的細(xì)胞在新陳代謝方面得到維持的生物學(xué)狀態(tài)兩者，術(shù)語"生長"的后者應(yīng)用與術(shù)語"維持"同義。在表達(dá)分泌型蛋白質(zhì)中使用熒光假單胞菌的另一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)包括與一些其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比熒光假單胞菌以高細(xì)胞密度培養(yǎng)的能力。為此，依照本發(fā)明的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)可以提供約20g/L或更多的細(xì)胞密度。依照本發(fā)明的熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)同樣也能提供至少約70g/L的細(xì)胞密度，就每體積生物質(zhì)而言，生物質(zhì)以細(xì)胞干重測量。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞密度會是至少約20g/L。在另一個實(shí)施方案中，細(xì)胞密度會是至少約25g/L、約30g/L、約35g/L、約40g/L、約45g/L、約50g/L、約60g/L、約70g/L、約80g/L、約90g/L、約100g/L、約110g/L、約120g/L、約130g/L、約140g/L、約或至少約150g/L。在另一個實(shí)施方案中，誘導(dǎo)時的細(xì)胞密度會在約20g/L和約150g/L之間；在約20g/L和約120g/L之間；在約20g/L和約80g/L之間；在約25g/L和約80g/L之間；在約30g/L和約80g/L之間；在約35g/L和約80g/L之間；在約40g/L和約80g/L之間；在約45g/L和約80g/L之間；在約50g/L和約80g/L之間；在約50g/L和約75g/L之間；在約50g/L和約70g/L之間；在約40g/L和約80g/L之間。C.感興趣蛋白質(zhì)或多肽的分離為了測量感興趣蛋白質(zhì)的產(chǎn)量(yield)、溶解度、構(gòu)象、和/或活性，自宿主細(xì)胞和/或胞外培養(yǎng)基分離蛋白質(zhì)可能是想要的。分離可以是粗略的、半粗略的、或純凈的分離，這取決于用于進(jìn)行合適的測量的測定法的要求。蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞質(zhì)中生成，靶向至周質(zhì)，或可以分泌入培養(yǎng)物或發(fā)酵培養(yǎng)基中。為了自周質(zhì)釋放靶向蛋白質(zhì)，使用了牽涉如下化學(xué)品的處理，諸如氯仿(Ames等(1984)J.Bacteriol.，160:1181-1183)、鹽酸胍、和TritonX畫IOO(Naglak和Wang(1990)EnzymeMicrob.Technol.,12:603-611)。然而，這些化學(xué)品不是惰性的，并且可能對許多重組蛋白產(chǎn)物或隨后的純化規(guī)程具有有害的影響。也有報告，對大腸桿菌細(xì)胞的甘氨酸處理(引起外膜的透化)釋放周質(zhì)內(nèi)容物(Ariga等(1989)J.Ferm.Bioeng.,68:243-246)。重組蛋白的周質(zhì)釋放的最廣泛使用的方法是滲壓震擾(Nosal和Heppel(1966)J.Biol.Chem.，241:3055-3062;Neu和Heppel(1965)J.Biol.Chem.，240:3685-3692)、雞蛋清(HEW)溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)處理(Neu和Heppel(1964)J.Biol.Chem.，239:3893-3900;Witholt等(1976)Biochim.Biophys.Acta,443:534-544;Pierce等(1995)IChemeResearch.Event,2:995-997)、和HEW溶菌酶/'滲壓震擾組合處理(French等(1996)EnzymeandMicrob.Tech.,19:332-338)。弗氏法牽涉細(xì)胞在分級緩沖液中的重懸，接著是周質(zhì)級分的回收，其中滲壓震擾就在溶菌酶處理后。通常，這些規(guī)程包括滲壓穩(wěn)定化培養(yǎng)基中的起始破壞，接著是非穩(wěn)定化培養(yǎng)基中的選擇性釋放。這些培養(yǎng)基的組成(pH、保護(hù)劑)和所使用的破壞方法(氯仿、HEW溶菌酶、EDTA、超聲處理)在所報告的具體規(guī)程中有所不同。使用雙極性離子型去垢劑替換EDTA的一種HEW溶菌酶/EDTA處理變化形式記載于Stabel等(1994)VeterinaryMicrobiol.，38:307-314。關(guān)于使用胞內(nèi)溶胞酶系統(tǒng)來破壞大腸桿菌的一般性綜述，參見Dabora和Cooney(1990)于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,巻43,A.Fiechter,編(Springer-Verlag:Berlin),頁11-30。用于自細(xì)胞質(zhì)以可溶性蛋白質(zhì)或折射顆粒回收感興趣蛋白質(zhì)或多肽的常規(guī)方法牽涉通過機(jī)械破壞來碎裂細(xì)菌細(xì)胞。機(jī)械破壞通常牽涉在液體懸浮液中產(chǎn)生局部空化、用剛性珠子進(jìn)行的快速攪動、超聲處理、或細(xì)胞懸液的研磨(BacterialCellSurfaceTechniques,Hancock禾口Poxton(JohnWiley&SonsLtd,1988),章3,頁55)。HEW溶菌酶以生化方式起水解細(xì)胞壁肽聚糖骨架的作用。該方法最初由Zinder和Amdt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42:586-590開發(fā)，他們用卵清蛋白(其含有HEW溶菌酶)處理大腸桿菌以產(chǎn)生稱為原生質(zhì)球的圓形細(xì)胞球。這些結(jié)構(gòu)保留了一些細(xì)胞壁成分但是具有大的表面積，其中細(xì)胞質(zhì)膜是暴露的。美國專利No.5,169，772披露了用于自細(xì)菌純化肝素酶的方法，包括使用例如EDTA、溶菌酶、或有機(jī)化合物在滲壓穩(wěn)定化培養(yǎng)基(例如20%蔗糖溶液)中破壞細(xì)菌的包膜，通過將細(xì)菌暴露于低離子強(qiáng)度緩沖液來自被破壞細(xì)菌的周質(zhì)間隙釋放非肝素酶樣蛋白質(zhì)，和通過將經(jīng)低離子強(qiáng)度清洗的細(xì)菌暴露于緩沖鹽溶液來釋放肝素酶樣蛋白質(zhì)。已經(jīng)對廣泛的表達(dá)系統(tǒng)使用了這些方法的許多不同改良，獲得了不同程度的成功(Joseph-Liazun等(1990)Gene，86:291-295;Carter等(1992)Bio/Technology，10:163-167)。誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)物生成溶菌酶的努力已經(jīng)有報告。EP0，155,189披露了用于誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)物生成溶菌酶的手段，通常預(yù)期所述手段會通過破壞或溶解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的手段來殺死此類宿主細(xì)胞。美國專利No.4,595，658披露了用于促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì)外化(extemalization)的方法。這種方法容許在不需要對細(xì)胞進(jìn)行溶菌酶處理、機(jī)械研磨、或滲壓震擾處理的情況中選擇性分離位于周質(zhì)中的蛋白質(zhì)。美國專利No.4，637，980披露了如下生成細(xì)菌產(chǎn)物，即用編碼(直接地或間接地)產(chǎn)物的DNA分子轉(zhuǎn)化溫度敏感性溶源體，在允許條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以在胞內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物，并通過提高溫度來誘導(dǎo)噬菌體編碼的功能而使產(chǎn)物外化。Asami等(1997)J.FermentandBioeng"83:511-516披露了通過T4噬菌體感染來同步破壞大腸桿菌細(xì)胞，而Tanji等(1998)J.Ferment,andBioeng.,85:74-78披露了T4噬菌體中所編碼溶解基因的受控表達(dá)以溫和破壞大腸桿菌細(xì)胞。細(xì)胞溶解后，基因組DNA泄露出細(xì)胞質(zhì)而進(jìn)入培養(yǎng)基中，并導(dǎo)致流體粘度的顯著升高，這可阻止固體在離心場中的沉降。在沒有剪切力(諸如那些在機(jī)械破壞過程中所施加的用以打碎DNA聚合物的)的情況中，固體穿過粘性流體的較慢沉降速率導(dǎo)致離心期間固體與流體的分開不足。除機(jī)械剪切力之外，還存在有降解DNA聚合物的溶核酶。在大腸桿菌中，內(nèi)源基因endA編碼內(nèi)切核酸酶(成熟蛋白質(zhì)的分子量為約24.5kD)，其通常分泌至周質(zhì)，并以內(nèi)切溶核方式將DNA切割成寡脫氧核糖核苷酸。已經(jīng)有4是示，endA由大腸桿菌相對較弱地表達(dá)(Wackemagel等(1995)Gene154:55-59)。在一個實(shí)施方案中，不需要額外的促進(jìn)二硫鍵的條件或試劑以便自宿主細(xì)胞回收有活性的、可溶性形式的含有二好u鍵的所鑒定的多肽。在一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因多肽、多肽、蛋白質(zhì)、或其片段在其活性狀態(tài)中具有折疊的分子內(nèi)構(gòu)象。在一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因多肽、多肽、蛋白質(zhì)、或其片,殳在其活性狀態(tài)中含有至少一個分子內(nèi)二硫鍵；并且或許有多至2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個、18個、或20個或更多個二石;U建。可以通過本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)并純化至基本上純凈，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、鎳層析、羥磷灰石層析、反相層析、凝集素層析、制備電泳、去污劑增溶、用諸如柱層析的物質(zhì)進(jìn)行的選擇性沉淀、免疫純化法等。例如，可以將具有已建立的分子粘附特性的蛋白質(zhì)與配體可逆地融合。憑借合適的配體，可以將蛋白質(zhì)選擇性吸附至純化柱，然后以相對純凈的形式從柱中釋放。然后通過酶活性切出所融合的蛋白質(zhì)。另外，可以使用免疫親和柱或Ni-NTA柱來純化蛋白質(zhì)。一般性才支術(shù)進(jìn)一步i己載于如J長口R.Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher,GuidetoProteinPurification,AcademicPress(1990);美國專利No.4，511，503;S.Roe，ProteinPurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag等，ProteinMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatra等，ProteinExprPurif,18(2):p/182-92(2000);及R.Mukhija等，Gene165(2):頁303-6(1995)。還可參見例如Ausubel等(1987和定期補(bǔ)充);Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification",MethodsinEnzymology巻182,及此叢書中的其它巻；Coligan等(1996和定期補(bǔ)充)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene,NY;及制造商關(guān)于蛋白質(zhì)純化產(chǎn)品的文獻(xiàn)，例如Pharmacia,Piscataway，N丄或Bio-Rad，Richmond,Calif。與重組技術(shù)的組合容許與合適的區(qū)段融合，例如與FLAG序列或等同物，它們可經(jīng)由蛋白酶可切除的序列來融合。還可參見例如Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantProteinswithMetalChelateAbsorbent"于Setlow(編)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98，PlenumPress,NY;及Crowe等(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&ProteinPurificationSystemQUIAGEN，Inc.,Chatsworth,Calif。通過本領(lǐng)域中已知的方法來實(shí)現(xiàn)所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測，包括例如放射性免疫測定法、Western印跡技術(shù)或免疫沉淀。本發(fā)明中所表達(dá)的某些蛋白質(zhì)可以形成不溶性聚集體("包含體")。數(shù)種方案適于自包含體純化蛋白質(zhì)。例如，包含體的純化通常牽涉通過破壞宿主細(xì)胞(例如通過在50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、ImMDTT、O.lmMATP、和lmMPMSF的緩沖液中溫育)對包含體的提取、分離和/或純化。通常通過2-3次通過弗氏壓碎器來溶解細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞懸浮液也可以使用Polytron(BrinkmanInstruments)進(jìn)行勻漿化或在冰上進(jìn)行超聲處理。溶解細(xì)菌的備選方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的(參見例如Sambrook等，見上文；Ausubel等，見上文)。在必要時，可以溶解包含體，并且通?？梢詫θ芙獾募?xì)胞懸浮液離心，以便除去不想要的不溶性物質(zhì)?？梢酝ㄟ^用相容的緩沖液進(jìn)行的稀釋或透析來使形成包含體的蛋白質(zhì)復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于尿素(約4M-約8M)、曱酰胺(至少約80%，體積/體積計)、和鹽酸胍(約4M-約8M)。雖然鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但是這種變性不是不可逆的，并且復(fù)性可以在除去(例如通過透析)或稀釋變性劑后發(fā)生，這容許免疫學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的重新形成。其它合適的緩沖液對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)能將上清液中存在的異源表達(dá)的蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)分開。例如，起始的鹽分級可將許多不想要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(或自細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的蛋白質(zhì))與感興趣蛋白質(zhì)或多肽分開。一個這樣的例子可以是石克酸銨。硫S交銨通過有效地降低蛋白質(zhì)混合物中的水量而使蛋白質(zhì)沉淀。然后蛋白質(zhì)根據(jù)它們的溶解度而沉淀。蛋白質(zhì)越疏水，其越有可能在較低的硫酸銨濃度沉淀。一個典型方案包括將飽和硫酸銨添加至蛋白質(zhì)溶液，使得所得硫酸銨濃度在20-30%之間。此濃度會沉淀大多數(shù)疏水性蛋白質(zhì)。然后棄去沉淀物(除非感興趣蛋白質(zhì)是疏水的)，并將硫酸銨添加至上清液至使感興趣蛋白質(zhì)沉淀的已知濃度。然后將沉淀物溶解于緩沖液中，并在必要時除去過量的鹽，其經(jīng)由透析或滲濾實(shí)現(xiàn)。依賴于蛋白質(zhì)溶解度的其它方法(諸如冷乙醇沉淀)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并可用于對復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分級。可以利用感興趣蛋白質(zhì)或多肽的分子量來將其與較大和較小尺寸的蛋白質(zhì)分離，其使用穿過不同孔徑的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超濾來實(shí)現(xiàn)。作為第1步，蛋白質(zhì)混合物可以穿過孔徑的分子量截留比感興趣蛋白質(zhì)的分子量低的膜而進(jìn)行超濾。然后超濾的保留物可以針對分子截留比感興趣蛋白質(zhì)的分子量大的膜進(jìn)行超濾。感興趣蛋白質(zhì)或多肽會穿過膜而進(jìn)入濾液中。然后可以對濾液進(jìn)行層析，如下文所述的。分泌型感興趣蛋白質(zhì)或多肽也可以根據(jù)其大小、表面凈電荷、疏水性、和對配體的親和力而與其它蛋白質(zhì)分開。另外，可以將針對蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的抗體偶聯(lián)至柱基質(zhì)，并對蛋白質(zhì)免疫純化。所有的這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。對于技術(shù)人員會顯而易見的是，可以以任何規(guī)模和使用來自許多不同制造商(例如PharmaciaBiotech)的儀器進(jìn)行層析技術(shù)。D.復(fù)性和重折疊在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所生成的超過50%的所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因多肽、多肽、蛋白質(zhì)或其片段可以在宿主細(xì)胞中以可復(fù)性形式生成。在另一個實(shí)施方案中，約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的所表達(dá)的蛋白質(zhì)以活性形式獲得或可以復(fù)性成活性形式。不溶性蛋白質(zhì)可以復(fù)性或重折疊以產(chǎn)生二級和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象。必要時，可以在完成重組產(chǎn)物的構(gòu)造中使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。可以使用本領(lǐng)域中已知的用于促進(jìn)蛋白質(zhì)解離/結(jié)合的試劑來實(shí)現(xiàn)重折疊和復(fù)性。例如，可將蛋白質(zhì)與二硫蘇糖醇一起溫育，接著與氧化型谷胱甘肽二鈉鹽一起溫育，接著與含有重折疊試劑(諸如尿素)的緩沖液一起溫育。也可以例如通過使其針對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM醋酸鈉，pH6緩沖液加200mMNaCl的透析來使感興趣蛋白質(zhì)或多肽復(fù)性?；蛘?，可以在固定化于柱(諸如NiNTA柱)上時，通過使用500mMNaCl、20%甘油、20mMTris/HClpH7.4(含有蛋白酶抑制劑)中的6M-1M尿素線性梯度來使蛋白質(zhì)重折疊?？梢栽?.5小時或更長的一段時間里實(shí)施復(fù)性。復(fù)性后，可以通過添加250mM咪唑來洗脫蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^針對PBS或50mM醋酸鈉pH6緩沖液加200mMNaCl的最終透析步驟來除去咪唑。純化的蛋白質(zhì)可以于4。CI&存或于-80。C冷凍。其它方法包括例如那些可記載于MHLee等，ProteinExpr.Purif.,25(1):頁166-73(2002);W.K.Cho等，J.Biotechnology,77(2-3):頁169-78(2000);Ausubel等(1987和定期補(bǔ)充)；Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification,"MethodsinEnzymology巻182,及此叢書中的其它巻；Coligan等(1996和定期補(bǔ)充)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene,NY;S.Roe,ProteinPurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag等，ProteinMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996)。E.感興趣蛋白質(zhì)本發(fā)明的方法和組合物對于在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生成高水平的正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽是有用的。感興趣蛋白質(zhì)或多肽(在本文中也稱為"耙蛋白質(zhì)"或"靶多肽")可以是任何物種的和任何大小的。然而，在某些實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是在治療方面有用的蛋白質(zhì)或多肽。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白質(zhì)，例如人蛋白質(zhì)，而且可以是例如生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子或血液蛋白質(zhì)。感興趣蛋白質(zhì)或多肽可以以與天然蛋白質(zhì)或多肽類似的方式加工。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或多肽不包括編碼序列中的分泌信號。在某些實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是小于100kD、小于50kD、或小于30kD大小的。在某些實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是具有至少約5個、IO個、15個、20個、30個、40個、50個或100個氨基酸的多肽。分子遺傳學(xué)和遺傳工程技術(shù)所要求的大量序列信息是可廣泛地公開獲得的?？勺訥enBank于網(wǎng)站〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez獲得哺乳動物以及人的基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因組的全部核苷酸序列的訪問(access)。別的信息也可自GeneCards(來自魏茨曼^f學(xué)基因組和生物信息學(xué)研究所(WeizmannInstituteofScienceGenomeandBioinformatics)的整合關(guān)于基因及其產(chǎn)物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的信息的電子百科全書(bioinformatics.weizmann.ac.il/cards))獲得，核香酸序列信息也可自EMBL核苷酸序歹'J數(shù)據(jù)庫(www.ebi.ac.uk/embl/)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，www.ddbi.nig.ac.ii)獲得；關(guān)于氨基酸序列的信息的別的位置包括Georgetown的蛋白質(zhì)信息資源網(wǎng)站(www-nbrf.Reorgetown.edu/pirl)和Swiss-Prot(au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)?？梢栽诒景l(fā)明中表達(dá)的蛋白質(zhì)的例子包括如下分子，諸如例如，腎素、生長激素，包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；曱狀旁腺激素；促曱狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；血小板生成素；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和vonWillebmnds因子；抗凝血因子，諸如蛋白C;心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和-(3;腦啡肽酶；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；繆勒抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance);+>弛素八鏈；；f^弛素B鏈；+>弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)多肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如(3-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素(activin);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素的或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)、或神經(jīng)生長因子，諸如NGF-(3;心肌營養(yǎng)蛋白(心臟肥大因子)，諸如心肌營養(yǎng)蛋白-1(CT-1);血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長因子，諸如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-卩，包括TGF-卩1、TGF-(32、TGF-卩3、TGF-卩4、或TGF-卩5;胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD-3、CD-4、CD-8、和CD-19;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素，諸如干擾素-a、-卩、和-y;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF;白介素(IL),例如IL-1至IL-10;抗HER-2抗體；超氧化物》支化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS被膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；抗體；及上文所列多肽中任一種的片段。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或多肽可選自IL-1、IL-la、IL-lb、IL-2、IL-3、IL-4、IL畫5、IL-6、IL-7、IL-8、IL畫9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL國24、VIP、紅細(xì)胞生成素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF;例如a-FGF(FGF-l)、卩-FGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如IGF-1、IGF-2);腫瘤壞死因子(例如TNF、淋巴毒素)、神經(jīng)生長因子(例如NGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);干擾素(例如IFN-a、IFN-f3、IFN-y);白血病抑制因子(LIF);睫狀節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);制瘤素M;干細(xì)胞因子(SCF);轉(zhuǎn)化生長因子(例如TGF-a、TGF-卩1、TGF-卩2、TGF-卩3);TNF超家族(例如LIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13B(BLy5、BAFF、THANK)、TNFa/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12);或趨化因子(BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-l、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROa/MGSA、HCC畫1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP畫3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD畫1、MIP-l.quadrature.、MIP-1.quadrature.、MIP-2.quadrature./GRO.quadrature.、MIP畫3quadrature./Exodus/LARC、MIP-3/Exodus-3/ELC、MIP陽4/PARC/DC畫CK1、PF-4、RANTES、SDF1、TARC、或TECK)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是多亞基蛋白質(zhì)或多肽?？梢员磉_(dá)的多亞基蛋白質(zhì)包括同聚體和異聚體蛋白質(zhì)。多亞基蛋白質(zhì)可以包括兩個或更多個亞基，它們可以是相同的或不同的。例如，蛋白質(zhì)可以是包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個、ll個、12個或更多個亞基的同聚體蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)也可以是包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、ll個、12個、或更多個亞基的異聚體蛋白質(zhì)。例示性的多亞基蛋白質(zhì)包括受體，包括離子通道受體；胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，包括軟骨素；膠原；免疫調(diào)節(jié)劑，包括MHC蛋白、全鏈抗體、和抗體片段；酶，包括RNA聚合酶、和DNA聚合酶；及膜蛋白。在另一個實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是血液蛋白質(zhì)。在此實(shí)施方案中所表達(dá)的血液蛋白質(zhì)包括但不限于載體蛋白，諸如清蛋白(包括人的和牛的清蛋白)，運(yùn)鐵蛋白、重組運(yùn)鐵蛋白半分子、觸珠蛋白、血纖蛋白原和其它凝結(jié)因子、補(bǔ)體成分、免疫球蛋白、酶抑制劑、物質(zhì)(諸如血管緊張素和緩激肽)的前體、胰島素、內(nèi)皮縮血管肽、和球蛋白(包括a、卩、y-球蛋白)，及主要在哺乳動物的血液中找到的其它類型的蛋白質(zhì)、多肽及其片段。已經(jīng)報告了許多血液蛋白質(zhì)的氨基酸序列(參見S.S.Baldwin(1993)Comp.BiochemPhysiol.106b:203-218)，包括人血清清蛋白的(Lawn，L.M.等(1981)NucleicAcidsResearch,9:6103-6114)和人血清運(yùn)鐵蛋白的氨基酸序歹寸(Yang,f.等(1984)Pro"Natl.Acad.Sci.USA81:2752-2756)。在另一個實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是重組體的酶或輔因子。在此實(shí)施方案中所表達(dá)的酶和輔因子包括但不限于醛縮酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、天冬氨酸酶、B12依賴性酶、羧肽酶、羧酸酯酶(carboxyesterase)、羧酸分解酶(carboxylyase)、化學(xué)胰蛋白酶(chemotrypsin)、需要CoA的酶(CoArequiringenzyme)、輕腈合成酶、胱石克醚合酶(cystathionesynthase)、脫羧酶、脫氫酶、醇脫氫酶、脫水酶、心肌黃酶(diaphorase)、加雙氧酶、烯酸還原酶(enoatereductase)、環(huán)氧化物水化酶(epoxidehydrase)、延胡索酸酶(fiimerase)、半乳糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、腈水化酶(nitrilehydrase)、核苷磷酸化酶、氧化還原酶、氧腈酶(oxynitilase)、肽酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、與治療活性多肽融合的酶、組織纖溶酶原激活物；尿激酶、蛇毒凝血酶(reptilase)、鏈激酶；過氧化氫酶、超氧化物歧化酶；DNA酶、氨基酸水解酶(例如天膠原酶；神經(jīng)氨酸酶；乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、和阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一個實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是單鏈、Fab片段和/或全鏈抗體或其片段或部分。單鏈抗體可以包括抗體中在穩(wěn)定折疊的多肽單鏈上的抗原結(jié)合區(qū)。Fab片段可以是特定抗體中的一段。Fab片段可以含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段可以含有2條鏈輕鏈和重鏈片段。這些片段可經(jīng)由接頭或二硫鍵連接。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列可以是靶多肽的天然編碼序列(若可獲得的話)，但是會更優(yōu)選的是如下編碼序列，其已經(jīng)經(jīng)過選擇、改良或優(yōu)化以在選定的表達(dá)宿主細(xì)胞中使用例如，通過合成反映假單胞菌物種(諸如熒光假單胞菌)或其它合適的生物體的密碼子使用偏愛的基因來實(shí)現(xiàn)。所得的基因會在一種或多種載體內(nèi)得到構(gòu)建或會被插入一種或多種載體中，然后所述載體會被轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主細(xì)胞中。要以"可表達(dá)形式，，提供的核酸或多核脊酸指含有能由選定的表達(dá)宿主細(xì)胞表達(dá)的至少一種基因的核酸或多核香酸。在某些實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是天然蛋白質(zhì)(諸如天然哺乳動物或人蛋白質(zhì))或與其基本上同源。在這些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)沒有以多聯(lián)體形式找到，而是僅連接至分泌信號和任選的供純化和/或識別用的標(biāo)簽序列。在其它實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是在約20至約42。C的溫度有活性的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在生理溫度是有活性的，而在加熱至高的或極端的溫度(諸如超過65。C的溫度)時被滅活。在一個實(shí)施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是如下蛋白質(zhì)，其在約20至約42。C的溫度是有活性的，和/或在加熱至高的或極端的溫度(諸如超過65。C的溫度)時被滅活；是天然蛋白質(zhì)(諸如天然哺乳動物或人蛋白質(zhì))或與其基本上同源，并且不是自多聯(lián)體形式的核酸表達(dá)的；并且啟動子不是熒光假單胞菌中的天然啟動子，而是衍生自另一種生物體，諸如大腸桿菌。在其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在生成時還包括別的靶向序列，例如將蛋白質(zhì)靶向至胞外培養(yǎng)基的序列。在一個實(shí)施方案中，別的靶向序列可操作連接至蛋白質(zhì)的羧基端。在另一個實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包括自運(yùn)輸物、雙配偶體分泌系統(tǒng)、主端分枝系統(tǒng)或菌毛引座孔蛋白的分泌信號。為了例示而非為了限制，提供了下列實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例l:A6C前導(dǎo)序列的鑒定I.材料和方法A.pDOW2258表達(dá)質(zhì)4立的構(gòu)建在用于表達(dá)DsbC前導(dǎo)肽-Skp融合蛋白的質(zhì)粒pDOW2258的構(gòu)建中使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)(圖1)。使用HerculaseMaster混合物(Stratagene,#600610-51)、引物RC-322(5,-AATTACTAGTAGGAGGTACATTATGCGCTT-3'，SEQIDNO:25)和RC-323(5'-TATACTCGAGTTATTTAACCTGTTTCAGTA-3'，SEQIDNO:26)、和模板質(zhì)粒pDOW3001(已經(jīng)含有通過SOEPCR所產(chǎn)生的克隆的tM>C前導(dǎo)-A;編碼序列融合物)使用制造商的方案來實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增521bpA6C"^7編碼序列。使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒(Qiagen,#28704)來純化PCR片段，用5^el和^/zoI限制性核酸酶(NewEnglandBiolabs,R0133和R0146)來消化，然后使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，M0202)連接至表達(dá)質(zhì)粒pDOW1169(已經(jīng)用5^I和^7zoI消化的)，其依照制造商的方案實(shí)現(xiàn)。通過電穿孔將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化入熒光假單胞菌DC454Oc::/ac7^dpyi0中，在含大豆的SOC培養(yǎng)基(SOC-with-Soymedium)中恢復(fù)，并鋪板于選擇培養(yǎng)基(M9葡萄糖瓊脂)上。通過對質(zhì)粒DNA的限制性消化(Qiagen,產(chǎn)品目錄編號27106)來分析菌落。10個含有插入物的克隆經(jīng)測序證實(shí)了無錯^K^Ap編碼序列的存在。將來自經(jīng)序列證實(shí)的分離群的質(zhì)粒稱為pDOW2258。B.搖瓶中的生長和表達(dá)分析通過標(biāo)準(zhǔn)的Dow1L規(guī)模搖瓶表達(dá)方案來分析含有pDOW2258的熒光假單胞菌菌抹DC4540c.v/ac7^4;^巧分離群。簡言之，使用在補(bǔ)充有1°/。葡萄糖和痕量元素的M9培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物來接種200mL含有作為碳源的5。/。甘油的限定極限鹽培養(yǎng)基(defmedminimalsaltsmedium)。起始的24小時生長階段后，用0.3mM異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)經(jīng)由Ptac啟動子的表達(dá)。在誘導(dǎo)時(IO)、誘導(dǎo)后24小時(124)、和誘導(dǎo)后48小時(I48)對培養(yǎng)物取樣。通過600nm的光密度(OD6。o)來測量細(xì)胞密度。將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至006()。=20，并將100pL的等分試樣以14,000xrpm離心5分鐘，并除去上清液。使用EASYLYSEtm(EpicentreTechnologies)自搖瓶樣品產(chǎn)生可溶性和不溶性級分。重懸細(xì)胞沉淀物，在溶解緩沖液中以1:4稀釋，并在搖動的情況中于室溫溫育30分鐘。將溶胞物以14,000rpm離心20分鐘(4。C),并除去上清液。將上清液作為可溶性級分保存。將樣品與含有(3-巰基乙醇(BioRad產(chǎn)品目錄編號161-0737)的2XLaemmli樣品緩沖液以l:l混合，并煮沸5分鐘，之后在12%Bis-Tris凝膠(BioRad產(chǎn)品目錄編號45-0112批號cx090505C2)上加載20pL,并在1XMES緩沖液(產(chǎn)品目錄編號161-0788批號210001188)中電泳。用SIMPLYBLUEtmSafeStain(Invitrogen產(chǎn)品目錄編號LC6060)依照制造商的方案對凝膠染色，并使用AlphaInnotech成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。C.N端測序分析使用10mMCAPS(2.21g/L)pHll(含NaOH)和10%曱醇作為轉(zhuǎn)移緩沖液將通過SDS-PAGE分開的可溶性和不溶性級分以40V1.5小時轉(zhuǎn)移至測序級PVDF膜(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄編號162-0236)。將印跡在染色溶液(0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250、40%甲醇、10%乙酸)中染色10秒，然后立即脫色3次，每次IO秒。自印跡切出感興趣蛋白質(zhì)條帶，并使用在來自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的PROCISE⑧蛋白質(zhì)測序儀(494型)上實(shí)施的Edman降解來測序。II.結(jié)果SDS-PAGE分析證實(shí)在誘導(dǎo)后24小時(I24)和48小時(I48)可溶性和不溶性級分兩者中Skp的預(yù)測分子量(約17kDa)處的蛋白質(zhì)的顯著積累(圖2)。N端測序分析證實(shí)I24時Skp蛋白預(yù)期大小的所誘導(dǎo)可溶性條帶產(chǎn)生經(jīng)加工形式的DsbC-Skp的預(yù)測蛋白質(zhì)序列的前5個氨基酸(ADKIA,SEQIDNO:27)。N端分析還顯示I24時不溶性級分中所積累的兩條條帶產(chǎn)生經(jīng)加工形式的和未加工形式的DsbC-Skp兩者。較高的分子量條帶產(chǎn)生未加工形式的DsbC-Skp的預(yù)測蛋白質(zhì)序列的前10個氨基酸(MRLTQIIAAA，SEQIDNO:28),而較低的分子量條帶產(chǎn)生經(jīng)加工形式的DsbC-Skp蛋白質(zhì)的預(yù)測蛋白質(zhì)序列的前10個氨基酸(ADKIAIVNMGSEQIDNO:29)。參見圖3A和圖3B。實(shí)施例2:pbpA分泌信號的鑒定I.材^l"和方法A.菌抹如下構(gòu)建DC206(4,F，/w.7ac701)，即使用摻入/ac/^啟動子突變(Calos等1980)的引物自pCN51/(3c/(Schneider等2005b)PCR擴(kuò)增大腸桿菌/ac/基因，并通過等位基因交換將該基因重組入MB101Ap,F(Schneider,Jenings等2005b)的/sc(左聚糖蔗糖酶)基因座中。B.構(gòu)建轉(zhuǎn)座體(transposome)以篩選熒光假單胞菌信號序列通過將^wi基因(編碼對卡那霉素的抗性)和p/zo4報告基因(其缺少起始密碼子和N端信號序列)插入轉(zhuǎn)座體載體pMOD-2<MCS>(EpicentreTechnologies)中的載體編碼的轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點(diǎn)("鑲嵌末端")之間來改造轉(zhuǎn)座體載體。通過用Io/進(jìn)行的限制性消化來從pUC4-KIXX(Pharmacia)中純化1.6kB^"i基因，然后連接入經(jīng)消化的pMOD2<MCS>中以形成pDOW1245。自大腸桿菌K12(ATCC)PCR擴(kuò)增出缺少信號序列的;^o^4基因，其中通過引物添加5awHI和J^al位點(diǎn)。限制性消化后，將基因連接入經(jīng)BamHI和J^"I消化的pDOW1245中以制備pDOW1208。通過用尸AA1限制性消化pDOW1208并使用UltrafreeDA(Amicon)對側(cè)翼為鑲嵌末端的3.3kb片段進(jìn)行凝膠純化來制備線性轉(zhuǎn)座體。流過MicroBioSpin6柱(Biorad)后，將30ng與4個單位的轉(zhuǎn)座酶(Epicentre)混合，并將等分試樣電穿孔入焚光假單胞菌MB101中。C.改良pbp信號序列的鑒定將戶6p-腐4,/^p/zoJ表達(dá)質(zhì)粒設(shè)計成將pbp-胰島素原蛋白融合至成熟的PhoA酶，從而能測量胰島素原-phoA在周質(zhì)中的積累，并能通過測定PhoA活性來選擇積累改善的菌抹。通過SOEPCR(Horton等1990)使用與分泌前導(dǎo)和胰島素原的編碼序列及胰島素原和成熟形式PhoA(即不含天然分泌前導(dǎo))的編碼序列交疊的引物在pINS-008中構(gòu)建/6p信號序列、人胰島素原、和//zo」之間的融合物。在用和^Tzo1限制性消化并用奸石咸性磷酸酶處理的pDOW1169(Schneider等2005a;Schneider,Jenings等2005b)中在toc啟動子的控制下克隆融合物，然后連4矣，并電穿孔入DC206中以形成pINS-008。為了在熒光假單胞菌中表達(dá)，優(yōu)化胰島素原基因模板的密碼子，并合成(DNA2.0)。自大腸桿菌MG1655基因組DNA擴(kuò)增出;/zoA基因。在含有BCIP(堿性磷酸酶活性的一種比色指示劑)的瓊脂平板上篩選菌落，其中用IPTG來誘導(dǎo)pbp-胰島素原-phoA基因的表達(dá)。在展現(xiàn)出BCIP水解的菌落中，一個菌落比其它菌落生長得大得多。發(fā)現(xiàn)此分離群在編碼分泌肽的區(qū)域中具有C至T單突變，引起第20位氨基酸從丙氨酸變成纈氨酸(A20V,SEQIDNO:2;參見表6)。通過標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶方案來評估這兩種菌林的表達(dá)。添加IPTG誘導(dǎo)物后不久，兩者的生長便變得平坦。突變型pINS-008-3菌林中的堿性磷酸酶活性高3-4倍(圖6),并且(可溶性)蛋白質(zhì)的積累較高(圖7)。表6:熒光假單胞菌中所鑒定的Sec分泌信號安排的蛋白質(zhì)功能縮寫預(yù)測的信號序列(SigiialP-HMM)DNA序列SEQIDNO:pbp(信號序列突變體)pbp*MKUOIMAAMTFV'AAOV4SVNAVA■■2'at脾恥tgaaacgtttgatggcggcaatg鮮ttttgtcgctgctggcgttgc卿鵬aacfe敏卿:e1孔蛋白E1前體PG).:.MKR.STLAVAVTLOAIAQQAGA31必脅,gtc&acctt敏t跑gctgtaacgtt鵬Cgcaa坊gcccagcaagca鵬gct30外膜孔蛋白FOPMKLKNTLGLAIGSLIAATSFGVLA33atgaaactgaaaaacaccttgggcttggccattggttctcttattgccgctac加tttcggcgttctggca32周質(zhì)磷酸結(jié)合蛋白(Pbp)PBMKLKRLMAAMTFVAAGVATANAVA35atgaaactgaaacgtttgatggcggcaatgacttttgtcgctgctggcgttgqgaccgccaacgcggtggcc34天青蛋白AZMFAKLVAVSLLTLASGQLLA37atgtttgccaaactc鵬gctgtttccctgctgactctggcgagcggccagttg卿ct36罕見的脂蛋白B前體MIKRNLLVMGLAVLLSA39atgatcaaacgcaatotgctggttatgggccttgccgtgctgttgagcgct38賴氨酸-精氨酸-鳥氨酸結(jié)合蛋白LAOMQNYKKFLLAAAVSMAFSATAMA41atgcagaactataaaaaattccttctggccgcggccgtctegatggcgttcagcgcca鄉(xiāng)ccatggca40鐵(III)結(jié)合蛋白IBMIRDNRLKTSLLRG■UELTLLSLTIXSPAAHS43atgatccgtgacaaccgactcaagapatc:ccttctgogcgg:cetgaccp鄉(xiāng)j5cctaeteag^欲gaccctgctctegp改魄gccca:抹ct42D.基因組測序通過DNAEasy試劑盒(Invitrogen)來純化基因組DNA，并將10嗎作為模板用于測序，其4吏用2XABIPRISMBigDye終止物v3.0循環(huán)試劑盒(AppliedBiosystems)用轉(zhuǎn)座子特異性引物進(jìn)行。純化反應(yīng)物，并在ABIPRISM3100遺傳分析儀(AppliedBiosystems)上依照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行加載。E.信號序列編碼區(qū)的克隆通過SPScan軟件測定信號序列，或如(De等1995)中那樣測定。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果已經(jīng)披露于2004年11月22日提交的共同懸而未決的美國專利申請?zhí)?0060008877。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增外膜孔蛋白F(oprF)、磷酸結(jié)合蛋白(pbp)、孔蛋白El(po/^)、天青蛋白、脂蛋白B和鐵結(jié)合蛋白分泌前導(dǎo)。將所得的PCR產(chǎn)物克隆入pCRIIBluntTOPO載體中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌64ToplO細(xì)胞(Invitrogen)中，其依照制造商的方案進(jìn)行。通過用M13正向引物和M13反向引物測序來對所得轉(zhuǎn)化體篩選正確的插入物。陽性克隆命名如下oprF(pDOW1112)、pbp(pDOW1113)、孑L蛋白E1(pDOW1183)、天青蛋白(pDOW1180)、脂蛋白B(pDOW1182)、鐵結(jié)合蛋白(pDOW1181)。F.用于在熒光假單胞菌中分泌的gal2scFv克隆的構(gòu)建。使用pDOWl112或pDOWl113作為模板來擴(kuò)增OprF和pbp信號序列以于十2位處融合至Gal2編碼序列。使用pGal2(Martineau等1998)作為模板來擴(kuò)增ga/2編碼序列。將837bpSOE-PCR產(chǎn)物克隆入pCRBLUNTIITOPO載體中，并證實(shí)序列。用^Z7al和Sa/I限制酶自TOPO載體切割出與信號序列融合的scFv基因，并使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)(Sambrook等2001)克隆入pMYC1803的5^el和屈ol位點(diǎn)中以產(chǎn)生pDOW1122(oprF:ga/2)和pDOW1123(p6;rga/2)。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入在補(bǔ)充有30pg/mL四環(huán)素和50^ig/mL卡那霉素的LB瓊脂上選定的DC191中。通過SOE-PCR將來自pDOW1183的/orE信號序列融合至自pDOW1123擴(kuò)增的gal2并通過凝膠提取來純化PCR產(chǎn)物。將所得的PCR產(chǎn)物克隆入PCRIIBluntTOPO中，隨后依照制造商的指示(Invitrogen)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO細(xì)胞中。對所得的克隆測序，并選擇陽性克隆(pDOW1185)進(jìn)行亞克隆。用SpeI和5^/I限制性消化pDOW1185,并對porE-gal2片段進(jìn)行凝膠純化。使用T4DNA連接酶(NEB)將純化的片段連接至經(jīng)5^I-5WI消化的pDOW1169。將連接混合物轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)DC454中，并在M91%葡萄糖瓊脂平板上選擇。通過使用5^I和5W/I限制性消化質(zhì)粒DNA來篩選轉(zhuǎn)化體。分離陽性克隆，并以pDOW1186貯存。分別自克隆pDOW1180、pDOW1181和pDOW1182擴(kuò)增出天青蛋白、鐵結(jié)合蛋白和lipB的信號序列。使用合適的引物自pDOW1123擴(kuò)增出ga/2基因以融合至每種分泌前導(dǎo)，分離所得的PCR產(chǎn)物，并通過SOE-PCR來融合，如上文所述的。將SOE-PCR產(chǎn)物克隆入pCR-BLUNTIITOPO中，對所得的克隆測序，并將每種融合物的陽性克隆亞克隆入pDOW1169中，如上文所述的。G.有C端組氨酸標(biāo)簽的焚光假單胞菌分泌載體的構(gòu)建通過DNA2.0(pJ5:G03478)合成含有如下插入物的克隆，所述插入物具有pbp分泌前導(dǎo)、MCS及C端His標(biāo)簽和廳"TlT2轉(zhuǎn)錄終止子。通過用5^el和MM進(jìn)行的限制性消化來分離450bp分泌盒，并進(jìn)行凝膠純化。將該片段連接至用相同酶消化的pDOW1219(自pMYC1803(Shao等2006)衍生的)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌JM109中。制備質(zhì)粒DNA，并通過使用載體特異性引物的PCR篩選插入物。所得的質(zhì)粒進(jìn)行序列證實(shí)，并命名為pDOW3718。然后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化電感受態(tài)焚光假單胞菌DC454，并在補(bǔ)充有250pg/mL尿嘧啶和30|ug/mL四環(huán)素的LB瓊脂上選擇。使用來自人ORF組(ORFeome)集合(Invitrogen)的模板來擴(kuò)增編碼人蛋白質(zhì)的可讀框。用iWzel和^oI限制性消化PCR產(chǎn)物，然后連接至經(jīng)Mzel-^7zo1消化的pDOW3718。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)熒光假單胞菌DC454中，并在補(bǔ)充有250ng/mL尿嘧啶和30jig/mL四環(huán)素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。對陽性克隆測序以證實(shí)插入物序列。H.大腸桿菌分泌克隆的構(gòu)建如上文那樣擴(kuò)增人ORF,只是設(shè)計了如下引物，其中5，引物上有7VcoI位點(diǎn)且3，引物上有l(wèi)01。用7VcoI和l01(NEB)限制性消化PCR產(chǎn)物，然后使用Qiaquick提取試劑盒(Qiagen)來純化。使用T4DNA連接酶(NEB)將經(jīng)消化的產(chǎn)物連接至經(jīng)A^oI:狄oI消化的pET22b(Novagen)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌ToplO細(xì)胞中。在LB瓊脂氨芐青霉素平板(Teknova)中選擇轉(zhuǎn)化體。制備質(zhì)粒DNA(Qiagen),并對陽性克隆測序以證實(shí)插入物序列。隨后將每種的一個經(jīng)證實(shí)的所克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)(Invitrogen)中進(jìn)行表達(dá)分析。I.DNA測序使用G刁0(Sigma)來純化測序反應(yīng)(Big染料第3.1版(AppliedBiosystems))，并加載入ABI3100測序儀中。J.高通量(HTP)表達(dá)分析使用標(biāo)準(zhǔn)的DowHTP表達(dá)方案來分析熒光假單胞菌菌抹。簡言之，使用在補(bǔ)充有1。/。葡萄糖和痕量元素的M9培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物來接種在30。C的起始生長階段后，用0.3mM異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)經(jīng)由Ptoc啟動子的表達(dá)。通過600nm的光密度(OD6。。)來測量細(xì)胞密度。K.供SDS-PAGE分析用的HTP樣品的制備使用EASYLYSETM(EpicentreTechnologies產(chǎn)品目錄編號RP03750)自培養(yǎng)物樣品產(chǎn)生可溶性和不溶性級分。如下溶解25pL完全培養(yǎng)基樣品，即添加175mLEASYLYSEtm緩沖液，在溫和搖動的情況中于室溫溫育30分鐘。將溶胞物以14,000rpm離心20分鐘(4。C)，并除去上清液。將上清液作為可溶性級分保存。然后將沉淀物(不溶性級分)重懸于等體積的溶解緩沖液中，并通過上下吹吸來重懸。對于選定的克隆，融化無細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品，并在不進(jìn)行稀釋的情況中分析。L.感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)和分泌分析使用在補(bǔ)充有1%葡萄糖(Teknova)、補(bǔ)充有痕量元素溶液的IXM9中所培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物來以2。/。接種物接種50mLDow限定極限鹽培養(yǎng)基，并于30。C在搖動的情況中溫育。用0.3mMIPTG(異丙基-(3-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)細(xì)胞約M小時耗用發(fā)酵時間(EFT，elapsedfermentationtime)。在誘導(dǎo)時(10)和誘導(dǎo)后16小時(116)、24小時(124)、或40小時(I40)采集樣品以進(jìn)行分析。通過600nm的光密度(OD6(x))來測量細(xì)胞密度。將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至006()()=20，并將lmL以14000xg離心5分鐘。將上清液(無細(xì)胞培養(yǎng)基)移液入新的微量離心管中，然后將細(xì)胞沉淀物和無細(xì)胞培養(yǎng)基樣品冷凍于-80。C,用于后面的力口工。M.SDS-PAGE分析使用EASYLYSETM緩沖液(EpicentreTechnologies)自搖瓶樣品產(chǎn)生可溶性和不溶性級分。將冷凍的沉淀物重懸于lmL溶解緩沖液中。將50uL添加至另外的150uLEASYLYSEtm緩沖液，并在搖動的情況中于室溫溫育30分鐘。將溶胞物以14,000rpm離心20分鐘(4。C)，并除去上清液。將上清液作為可溶性級分保存。然后將沉淀物重懸于等體積(200iiiL)的溶解緩沖液中，并通過上下吹吸來重懸；這作為不溶性級分保存。融化無細(xì)胞培養(yǎng)基樣品，并足額使用。N.Western分析使用依照制造商的方案所制備的lX轉(zhuǎn)移緩沖液(Invitrogen),將所制備的并通過SDS-PAGE分開的可溶性和不溶性級分以100Vl小時轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(BioRad)。轉(zhuǎn)移后，用POLY-HRP稀釋劑(ResearchDiagnostics,Inc.)封閉印跡，并用l:5,000稀釋的抗His標(biāo)簽抗體(Sigma或USBiologicals)探查。用IXPBS-Tween清洗印跡，隨后使用Immunopure^屬增強(qiáng)DAB底物試劑盒(Pierce)來顯現(xiàn)。O.20L發(fā)酵如下產(chǎn)生每一種發(fā)酵罐培養(yǎng)物的接種物，即用冷凍的培養(yǎng)物原種來接種裝有600mL補(bǔ)充有酵母提取物和甘油的化學(xué)限定培養(yǎng)基的搖瓶。在搖動的情況中于32。C溫育16-24小時后，然后在無菌條件下將搖瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至20L裝有設(shè)計用于支持高生物量的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。通過調(diào)節(jié)噴射氣流和攪動速率來在液體培養(yǎng)物中將溶解氧維持在正水平(positivelevel)。經(jīng)由添加氨水來將pH控制在想要的設(shè)定點(diǎn)。補(bǔ)料-分批高密度發(fā)酵過程分成約24小時的起始生長階段和添加IPTG來啟動重組基因表達(dá)的基因表達(dá)階段。然后讓發(fā)酵的表達(dá)階段進(jìn)行24小時。P.N端氨基S臾序列分析如上文在SDS-PAGE分析中所描述的那樣運(yùn)行樣品，并轉(zhuǎn)移至CriterionSequi-BlotPVDF膜(Biorad)。用GelCodeBlue染色劑試劑(Pierce)對膜染色，隨后用50%曱醇1%乙酸脫色，用10%曱醇接著用去離子水漂洗，然后干燥。自膜切出感興趣的條帶，提取，并在Procise蛋白質(zhì)測序系統(tǒng)，494型(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上進(jìn)行8輪Edman降解。P.Edman,ActaChem.Scand.4，283(1950);綜述R.A.Laursen等，MethodsBiochem.Anal.26,201-284(1980)。II.結(jié)果A.通過轉(zhuǎn)座子誘變鑒定天然分泌信號序列為了鑒定會將異源蛋白質(zhì)分泌至周質(zhì)或培養(yǎng)基的熒光假單胞菌信號序列，將分泌報告基因克隆入轉(zhuǎn)座體。所使用的分泌報告基因是不含起始密碼子或N端信號序列的大腸桿菌堿性磷酸酶基因(p/7a4)。PhoA在周質(zhì)(而非細(xì)胞溶膠)中是有活性的，這是由于容許二聚化成活性形式的分子內(nèi)二硫4建的形成(Derman等1991)。使用一種稱為"基因組掃描"的類似方法在大腸桿菌中尋找分泌蛋白質(zhì)(Bailey等2002)。//2o4基因也已經(jīng)用于分析大腸桿菌中(Manoil等1985)和其它細(xì)菌中(Gicqud等1996)周質(zhì)的、膜的、和輸出的蛋白質(zhì)中的分泌信號。電穿孔和在指示培養(yǎng)基上鋪板后，分離了8個藍(lán)色菌落。對轉(zhuǎn)座體在基因組中的插入位點(diǎn)測序，并用于搜索熒光假單胞菌MB101的私有基因組數(shù)據(jù)庫。表6中顯示了鑒定為能夠表達(dá)活性PhoA的8種基因融合物。B.信號序列-gal2融合物的克隆使用SignalP程序(J.D.Bendtsen2004)來預(yù)測上文所鑒定的分泌蛋白質(zhì)，外膜孔蛋白F(OP)、磷酸結(jié)合蛋白pw^(PB)、鐵結(jié)合蛋白(IB)、天青蛋白(AZ)、脂蛋白B(L)和賴氨酸-鳥氨酸-精氨酸結(jié)合蛋白(LOA)的信號序列。OP、PE和AZ的信號序列先前已經(jīng)在其它系統(tǒng)中鑒定[Arvidsson,1989#25;De，1995#24;Yamano,1993#23]。還平行分析了另一項(xiàng)研究中所鑒定的別的分泌前導(dǎo)pbpA20V(Schneider等2006)的活性。在此研究中，通過材料和方法中所描述的交疊延伸PCR(SOE-PCR)使用剪接來將6種天然熒光假單胞菌信號序列和熒光假單胞菌磷酸結(jié)合蛋白信號序列的突變體的編碼區(qū)(參見表6)各自融合至ga/2scFv基因，使得切割信號肽后Gal2的N端的4個氨基酸會是AQVQ。擴(kuò)增LAO信號序列的反復(fù)嘗試失敗了，并且從進(jìn)一步分析中去掉此信號序列。將基因融合物克隆入熒光假單胞菌表達(dá)載體pDOW1169中，并轉(zhuǎn)化入DC454宿主菌抹(A;yF/sc:.7ac/g7)中。隨后對所得的菌株評估Ga12scFv表達(dá)和分泌前導(dǎo)的正確加工。C.分泌的Gal2scFv的表達(dá)在搖瓶規(guī)模，PB、OP、PO、AZ、IB、和L與gal2scFv的融合物達(dá)到預(yù)期的OD6。0,只是L-gal2scFv在傳代培養(yǎng)入生產(chǎn)培養(yǎng)基中后未能生長(數(shù)據(jù)未顯示)。Western印跡分析證實(shí)，自Gal2scFv融合物切出PB、OP、PO、AZ和IB信號序列。然而，Western印跡顯示未加工的PB-Gal2和OP-Ga12的存在。在無細(xì)胞培養(yǎng)基中找到自AZ和IB融合物表達(dá)的一些可溶性Ga12scFv,這指明可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)了，并自周質(zhì)間隙泄漏。實(shí)施了氨基端序列分析以證實(shí)對信號序列的切割。自天青蛋白(pDOW1191)融合物表達(dá)的不溶性Gal2蛋白顯示具有經(jīng)加工的和未加工的分泌信號的蛋白質(zhì)的混合物。然而，觀察到信號序列是自IB-Gal2融合物完全加工的。使用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件，在20L發(fā)酵規(guī);漠評估與7種前導(dǎo)之每一種融合的Gal2scFv的表達(dá)。所有菌林如預(yù)期的那樣生長，18-24小時時達(dá)到誘導(dǎo)OD,(約180個單位)。lipB-Gal2菌抹比其它菌林生長得略微慢些。這不是完全出乎意料的，因?yàn)閘ipB-Gal2菌抹在以小規(guī)模發(fā)酵接種搖瓶培養(yǎng)基后不生長。通過SDS-PAGE和Western印跡來評估Ga12scFv的表達(dá)和加工。SDS-PAGE分析顯示，在融合至OP或PB分泌信號時表達(dá)高水平的Ga12。然而，僅一部分(約50%)的OP-Gal2融合蛋白表現(xiàn)出分泌至周質(zhì)，且信號序列被切除。如在小規(guī)模時所觀察到的，Gal2主要以不溶性級分表達(dá)，雖然通過Westem印跡檢測出可溶性蛋白質(zhì)。還在培養(yǎng)物上清液中檢測出少量的蛋白質(zhì)，指明自周質(zhì)的泄漏(圖7)。N端序列分析證實(shí)，ibp和天青蛋白前導(dǎo)得到如預(yù)期的那樣的加工，導(dǎo)致N端氨基酉踏列AQVQL(SEQIDNO:44)。同樣地，根據(jù)Western分析，PorE分泌前導(dǎo)表現(xiàn)為得到加工，并通過N端分析得到證實(shí)。不溶性PorE-Gal2的表達(dá)水平比不溶性ibp-Gal2和天青蛋白-Gal2的表達(dá)水平略低。LipB-Gal2以與PorE-Gal2的水平類似的水平顯示經(jīng)加工的Gal2的表達(dá)。自表達(dá)pbp-Gal2和pbpA20V-Gal2的菌抹觀察到最大量的蛋白質(zhì)。自pbpA20V-Ga12菌抹表達(dá)的Gal2量表現(xiàn)為甚至高于由pbp-Gal2菌抹所生成的(圖6)。通過Western分析檢測出可溶性的、經(jīng)加工的Gal2,其是未加工的和經(jīng)加工的不溶性蛋白質(zhì)的混合物(圖7)。不溶性蛋白質(zhì)的N端序列分析證實(shí)未加工的和正確加工的Gal2的混合物。實(shí)施例3:bce前導(dǎo)序列的鑒定I.材料和方法BceL是一種分泌前導(dǎo)，其鑒定為由含有來自凝結(jié)芽孢桿菌(Sa"7/wcoagM/朋"CMC104017的水解酶的基因的DNA插入物的一部分所編碼。此菌株凝結(jié)芽孢桿菌在多個商業(yè)培養(yǎng)物保藏中心中也稱為NCIMB8041、ATCC10545和DSMZ2311,并且其起源為NRS784。NRS784來自形成孢子的細(xì)菌的NHSmithH欠集(Smith等AerobicsporeformingbacteriaUS.Dep.Agr.Monogra.16:1-148(1952))。由NCIMB所引用的、關(guān)于此菌林的其它原始參考文獻(xiàn)是Cambell，L丄.和SniffE.E.(1959.J.Bacteriol.78:267AninvestigationofFolicacidrequirementsof5a"7/wscoagw/ara)。序列和生物信息學(xué)分析對來自凝結(jié)芽孢桿菌CMC104017的4，127bpDNA插入物測序并分析，以定位潛在編碼水解酶的編碼序列。在5，端的/ac啟動子后面鑒定出一種1,314bp的編碼序列，稱為CDS1。CDS1的DNA和預(yù)測蛋白質(zhì)序列分別在SEQIDNO:45和46中列出。根據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)序列的BLASTP分析，確定CDS1最有可能編碼水解酶。CDS1序列顯示與來自沼澤紅假單胞菌(//206fo戸ewfifomowwp"/w的'力HaA2的P-內(nèi)酰胺酶的同源性(E值2e-36)。CDSl的SignalP3.0隱藏Markov模型分析(BendtsenJD,NielsonG，vonHeijneGBrunakS:Improvedpredictionofsignalpeptides:Signal3.0.J.Mol.Biol2004,340:783.)預(yù)測生物體類別革蘭氏陽性細(xì)菌的信號序列的存在，且在SEQIDNO:46的殘基33/34間有信號肽酶切割位點(diǎn)。70蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法(SambrookJ，RussellD:MolecularCloningaLaboratoryManual,第3版ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborPress;2001)。使用SOE-PCR方法來實(shí)施DNA序列融合(Horton,R.M.,Z.Cai，S.N.Ho和L.R.Pease(1990)."Genesplicingbyoverlapextension:tailor-madegenesusingthepolymerasechainreaction."BioTechniques8(5):528-30,532，534-5))。對所有的PCR^應(yīng)使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs產(chǎn)品目錄編號F531S)。設(shè)計質(zhì)粒以表達(dá)和定位進(jìn)入熒光假單胞菌的細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)間隙中的來自凝結(jié)芽孢桿菌CMC104017的酯酶蛋白。用5^I和loI限制性內(nèi)切核酸酶(NewEnglandBiolabs產(chǎn)品目錄編號R0133和R0146)消化最終的PCR產(chǎn)物，然后使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs產(chǎn)品目錄編號M0202S)連接入表達(dá)載體pDOW1169(也用5^el和^oI消化的)中以生成細(xì)胞質(zhì)CMC104641CDS-1表達(dá)載體p484-001和天然Bce前導(dǎo)CMC104641CDS-1表達(dá)載體p484-002。然后通過電穿孔將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化入熒光假單胞菌菌抹DC454(A;fF,/ac727)，在含大豆的SOC培養(yǎng)基(Teknova產(chǎn)品目錄編號2S2699)中恢復(fù)，并鋪板于選擇培養(yǎng)基(M9葡萄糖瓊脂，Teknova產(chǎn)品目錄編號2M1200)上。通過限制性消化微量制備的質(zhì)粒DNA(Qiagen，產(chǎn)品目錄編號27106)來分析菌落。對來自每次轉(zhuǎn)化的10個克隆測序以證實(shí)正確的插入物。表達(dá)分析在裝有200mL具有作為碳源的5。/。甘油的限定極限鹽培養(yǎng)基("Dow培養(yǎng)基，，)的搖瓶中檢查攜帶每種克隆的熒光假單胞菌菌林DC454。起始生長階段后，用0.3mM異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)經(jīng)由toc啟動子的表達(dá)。在誘導(dǎo)時(IO)、和誘導(dǎo)后24小時(I24)對培養(yǎng)物取樣。通過600nm處的光密度(OD6oo)來測量細(xì)胞密度。表7中顯示了顯示搖瓶編號方案的表格。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在每個取樣時間，將樣品的細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至OD,=20，并將lmL等分試樣以14000xg離心5分鐘。將上清液(無細(xì)胞培養(yǎng)基)移液入新的微量離心管中，然后于-20。C冷凍細(xì)胞沉淀物和無細(xì)胞培養(yǎng)基樣品。細(xì)胞溶解和SDS-PAGE分析使用EasyLyse(EpicentreTechnologies)自搖瓶樣品產(chǎn)生可溶性和不溶性級分。重懸冷凍的沉淀物，在溶解緩沖液中以1:4溶解，并在搖動的情況中于室溫溫育30分鐘。將溶胞物以14，000rpm離心20分鐘(4。C)，并除去上清液。將上清液作為可溶性級分保存。然后將沉淀物(不溶性級分)重懸于等體積的溶解緩沖液中，并通過上下吹吸來重懸。融化無細(xì)胞培養(yǎng)基樣品，并足額使用。將樣品與含有P-巰基乙醇(BioRad產(chǎn)品目錄編號161-0737)的2XLaemmli樣品緩沖液以l:l混合，并煮沸5分鐘，之后在Bio-RadCriterion10%CriterionXT凝膠(BioRad產(chǎn)品目錄編號45-0112)上加載20pL,并通過在推薦的1XMOPS緩沖液(產(chǎn)品目錄編號161-0788批號210001188)中電泳來分開。用SIMPLYBLUESafeStain(Invitrogen產(chǎn)品目錄編號LC6060)依照制造商的方案對凝膠染色，并使用AlphaInnotech成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。通過與加載于相同凝膠上的BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品比較來評估感興趣的凝膠條帶的蛋白質(zhì)數(shù)量。II.結(jié)果使用了總共6個搖瓶(每種菌林3個燒瓶)來評估水解酶表達(dá)。周質(zhì)的和細(xì)胞質(zhì)的設(shè)計菌抹的生長與熒光假單胞菌菌抹的正常生長相一致，在誘導(dǎo)后24小時達(dá)到OD6o。約15。實(shí)施了SDS-PAGE分析以評估誘導(dǎo)時和誘導(dǎo)后24小時的水解酶(CDS1蛋白)表達(dá)。通過SDS-PAGE分析了可溶性級分、不溶性級分、和無細(xì)胞培養(yǎng)基級分。對于細(xì)胞質(zhì)的CDS-l菌抹(p484-001)，具有細(xì)胞質(zhì)水解酶的預(yù)期大小(44.1kDa)的蛋白質(zhì)在I24(IPTG誘導(dǎo)后24小時)時在所有3種分離群中以0.1mg/mL的估計產(chǎn)率幾乎完全積累于可溶性級分中。圖8顯示了以EP484-003評估的細(xì)胞質(zhì)菌抹的代表性結(jié)果。在不溶性級分中能檢測到具有預(yù)期大小的可忽略條帶，而在無細(xì)胞培養(yǎng)基中沒檢測到CDS1蛋白。對于表達(dá)天然Bce前導(dǎo)-CDSl的周質(zhì)菌抹(p484-002)，具有天然酯酶預(yù)期大小的蛋白質(zhì)在I24時在所有3種分離群中以0.8mg/mL的估計產(chǎn)率幾乎完全積累于可溶性級分中。圖8顯示了以EP484-004評估的含有Bce前導(dǎo)融合物的細(xì)胞質(zhì)菌抹的代表性結(jié)果。不清楚所表達(dá)的天然酯酶是否是完全加工的，因?yàn)樗褂玫哪z加載使其難以辨別預(yù)測的47.6kDa的未加工大小和44.lkDa的經(jīng)加工大小。與細(xì)胞質(zhì)表達(dá)菌抹的結(jié)果類似，在不溶性級分中能檢測到具有預(yù)期大小的可忽略條帶，而在無細(xì)胞培養(yǎng)基中沒檢測到CDS1蛋白。感興趣Bce前導(dǎo)的翻i爭序列在SEQIDNO:8中列出。實(shí)施例4:熒光假單胞菌分泌前導(dǎo)的鑒定和分析用信號肽預(yù)測程序SignalP2.0(Nielsen,H.等ProteinEng,1997.10(1):l-6)分析6，433種來自MB214基因組的翻譯性O(shè)RF。通過HMM模型預(yù)測1326種含有信號肽。用PsortB2.0(Gardy,J丄.等Bioinformatics,2005.21(5):617-23)分析這些蛋白質(zhì)，除去所有那些PsortB最終定位鑒定為細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞質(zhì)膜的，留下891種。除去其中含有信號肽的SignalPHMM概率低于0.79的82種蛋白質(zhì)，產(chǎn)生809種。選擇0.79的截留，因?yàn)槟鞘遣慌懦齛prA(RXFO4304，已知為胞外蛋白質(zhì))的最高數(shù)值。使用CLUSTALX1.81(Thompson,J.D.等NucleicAcidsRes,1997.25(24):4876-82)比對這809種翻譯性O(shè)RF的氨基端序列，其含有通過SignalP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法所預(yù)測的信號肽加上經(jīng)加工蛋白質(zhì)的前7個氨基酸。Huber等提示，高度疏水的信號序列更有可能在共翻譯的情況中被分泌(Huber，D.等JBacteriol,2005.187(9):2983-91)。出于鑒定在共翻譯的情況中所分泌的蛋白質(zhì)的目的，發(fā)現(xiàn)Wertz-Scheraga(WS)的氨基酸指數(shù)(Wertz,D.H.和H.A.Scheraga,Macromolecules，1978.11(1):9-15)是最好的。對于此研究，在萬維網(wǎng)上于www.genome.jp/dbget-bin/www—bgetaaxl:WERD780101自AAindex獲得這些指數(shù)。改良由Boyd報告的算法(Boyd，D.，C.Schierle和J.Beckwith,ProteinSci，1998.7(1):201-5)，并用于根據(jù)疏水性對809種蛋白質(zhì)分級。該算法掃描每個序列，在12的窗口內(nèi)計算WS得分的平均值。使用最疏水的區(qū)域來為整個蛋白質(zhì)指派WS得分。這產(chǎn)生WS得分大于0.69的142種信號序列，0.69是Huber等中限定的截留。這種較小的列表與來自由印地安那應(yīng)用蛋白質(zhì)科學(xué)中心(IndianaCentersforAppliedProteinSciences,INCAPS)實(shí)施的2D-LC全蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相互參照。這些實(shí)驗(yàn)試圖鑒定和量化多種生長條件下在MB214(源于焚光假單胞菌MB101的)中所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。在此列表中出現(xiàn)的具有高的最大限度表達(dá)水平的蛋白質(zhì)是有可能高度表達(dá)的。在這些數(shù)據(jù)中，l或3的優(yōu)先級(priority)得分指明蛋白質(zhì)鑒定的高置信度。表8中以它們最大限度表達(dá)水平的順序列出了來自INCAPS實(shí)驗(yàn)中所鑒定的142種的列表的、優(yōu)先級為1或3的的蛋白質(zhì)。表8:以最大限度表達(dá)水平的順序列出的、來自INCAPS實(shí)驗(yàn)過程中找到的142種的列表的、優(yōu)先級為1或3(指明鑒定的高度置信)的7種獨(dú)特蛋白質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>已經(jīng)鑒定出數(shù)種在大腸桿菌中在共翻譯的情況中分泌的蛋白質(zhì)。使用這些中的數(shù)種的序列來對MB214基因組搜尋同源物。大腸桿菌基因是DsbA、TorT、SfmC、FocC、CcmH、Yral、To舊、NikA、Flgl。使用BLASTP算法(Altschul，S,F.等，JMolBiol,1990.215(3):403-10)來對MB214的數(shù)據(jù)庫搜尋翻譯性O(shè)RF。根據(jù)它們與它們的大腸桿菌對應(yīng)物所顯示的同源性程度，將MB214蛋白放入兩種種類中。高同源性蛋白質(zhì)與2e，或更好的預(yù)期得分匹配。低同源性蛋白質(zhì)具有8e-卩和5e-"之間的預(yù)期得分。這種方法產(chǎn)生ll種獨(dú)特的潛在同源物，其中一些與上文所獲得的7種靶物交疊。使用SignalP來分析具有18種獨(dú)特蛋白質(zhì)的組合列表，并選擇預(yù)測具有單一可能信號肽酶切割位點(diǎn)的9種最終的靶物進(jìn)行表達(dá)研究。分泌前導(dǎo)的分離和序列分析自DC454(源自熒光假單胞菌MB101的)基因組DNA擴(kuò)增所鑒定的熒光假單胞菌分泌前導(dǎo)，并克隆入pCRBLUNTII-TOPO(Invitrogen)中以進(jìn)行DNA序列驗(yàn)證。表9中提及了所分離的每種熒光假單胞菌分泌前導(dǎo)的DNA和推導(dǎo)氨基酸序列。表9:熒光假單胞菌分泌前導(dǎo)序列前導(dǎo)DNASE(jIDNO:^J^酸SEQIDNO:74<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>分泌前導(dǎo)與Ga12scFv和大腸桿菌硫氧還蛋白的融合和表達(dá)分析通過交疊延伸PCR(HortonR.M.等1990Biotechniques8:528),使用剪接，將每種分泌前導(dǎo)(表9)以符合讀碼框的方式融合至Ga12scFv序列(Martineau，P.等1998J.MolBio.280:117)和/或大腸桿菌硫氧還蛋白(TrxA)序列(SEQIDNO:46)。純化所得的片段，隨后作為模板用于第二輪PCR以將NikA分泌前導(dǎo)編碼序列融合至化"序列。然后將融合物克隆入熒光假單胞菌表達(dá)載體pDOW1169中，在toc啟動子的控制下。將每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入熒光假單胞菌DC454中，并以高通量形式評估表達(dá)。將培養(yǎng)物在補(bǔ)充有5%甘油的限定礦物鹽培養(yǎng)基中在2mL深孔板中以0.5mL的培養(yǎng)體積培養(yǎng)。24小時生長階段后，用0.3mMIPTG誘導(dǎo)重組蛋白，并容許表達(dá)24小時。通過超聲處理來使培養(yǎng)物分級，并通過SDS-CGE和Western印跡來評估蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌前導(dǎo)加工(圖9)。發(fā)現(xiàn)所測試的每種前導(dǎo)(除Bce前導(dǎo)之外)是自Gal2scFv蛋白質(zhì)序列部分或完全加工的。與編碼細(xì)胞質(zhì)Ga12scFv的表達(dá)菌抹(無)相比，每種也極大地改善Ga12scFv的表達(dá)，指明在指導(dǎo)亞細(xì)胞定位之外，這些分泌前導(dǎo)還能改善總體表達(dá)。預(yù)料之中的是，還觀察到不同水平的Gal2scFv表達(dá)和溶解。Western分析證實(shí)，在融合至CupA2、CupC2、NikA、FlgI和ORF5550時生成了一些可溶性Ga12(圖IO)。雖然與Gal2融合的To舊前導(dǎo)的表達(dá)低于用其它前導(dǎo)所觀察到的，但是Westem分析顯示所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)是可溶的。N端分析顯示To舊、CupA2、CupC2、Flgl、NikA和ORF5550前導(dǎo)自Gal2scFv切割，如預(yù)期的(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然Bce前導(dǎo)沒有自Gal2scFv加工，但是發(fā)現(xiàn)其自TrxA力。工。硫氧還蛋白已經(jīng)被記載為用于鑒定共翻譯分泌前導(dǎo)的模式蛋白質(zhì)，因?yàn)槠湓诩?xì)胞質(zhì)中快速地折疊(Huber等2005J.Bateriol.187:2983)。利用Bce前導(dǎo)的可溶性TrxA的成功分泌可以指明此前導(dǎo)以共翻譯方式起作用以促進(jìn)周質(zhì)分泌。說明書中所提及的所有出版物和專利申請指明本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的技術(shù)人員的水平。本文通過提及而收錄所有出版物和專利申請，其程度就像明確且單獨(dú)指明通過提及而收錄每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾堃粯?。雖然出于理解清晰的目的，已經(jīng)通過例示和實(shí)施例較為詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是顯而易見的是，可以在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實(shí)施某些變化和改良。權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，其包含選自下組的分泌多肽的分泌信號編碼序列蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp*)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、FlgI、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、甲苯耐受蛋白(Ttg2C)、和接納甲基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽。2.權(quán)利要求l的核酸分子，其中所述核酸分子選自下組a)包含SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核苷酸序列的核酸分子；b)包含與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼分泌多肽；c)編碼包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基S臾序列的聚多肽的核酸分子；d)包含編碼與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少90。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；e)包含編碼與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；f)在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核苷酸序列的基本上全長里雜交的核苷酸序列；和，g)在嚴(yán)格條件下在基本上全長里與編碼選自下組的氨基S臾序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、和22。3.權(quán)利要求2的核酸分子，其中所述雜交條件包括約60。C至約70。C的溫度。4.權(quán)利要求2或3的核酸分子，其中所述雜交條件包括約68。C的溫度。5.權(quán)利要求l的核酸分子，其中所述核酸分子已經(jīng)得到調(diào)節(jié)以反映選擇用來表達(dá)所述核酸分子的宿主生物體的密碼子偏愛。6.—種載體，其包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp*)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(Ttg2C)、或接納曱基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽的分泌信號編碼序列。7.權(quán)利要求6的載體，其中所述核酸分子選自下組a)包含SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核普酸序列的核酸分子；b)包含與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼分泌多肽；c)編碼包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列的聚多肽的核酸分子；d)包含編碼與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；e)包含編碼與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核苦酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；f)在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核普酸序列的基本上全長里雜交的核苷酸序列；和，g)在嚴(yán)格條件下在基本上全長里與編碼選自下組的氨基S吏序列的核苷酸序列雜交的核芬酸序列:SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、和22。8.權(quán)利要求7的載體，其中所述雜交條件包括約60。C至約70。C的溫度。9.權(quán)利要求7或8的載體，其中所述雜交條件包括約68。C的溫度。10.權(quán)利要求6的載體，其中所述核酸分子已經(jīng)得到調(diào)節(jié)以反映選擇用來表達(dá)所述核酸分子的宿主生物體的密碼子偏愛。11.權(quán)利要求6的載體，其中所述分泌信號編碼序列是可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的序列的。12.權(quán)利要求ll的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽對于表達(dá)所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的宿主生物體而言是天然的。13.權(quán)利要求6的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽對于熒光假單胞菌而言是天然的。14.權(quán)利要求ll的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自對于表達(dá)所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的宿主生物體而言不是天然的蛋白質(zhì)或多肽。15.權(quán)利要求ll的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽來自不是假單胞菌的生物體。16.權(quán)利要求6的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自真核生物體。17.權(quán)利要求16的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自哺乳動物生物體。18.權(quán)利要求6的載體，其進(jìn)一步包含所述信號多肽序列與所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽序列之間的連接序列。19.權(quán)利要求18的載體，其中所述連接序列可被信號肽酶切割。20.權(quán)利要求6的載體，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽序列是可操作連接至第二信號序列的。21.權(quán)利要求20的載體，其中所述第二信號序列包含靶向至外膜分泌信號的序列。22.權(quán)利要求6的載體，其中所述載體進(jìn)一步包含啟動子。23.權(quán)利要求22的載體，其中所述啟動子對于細(xì)菌宿主細(xì)胞是天然的。24.權(quán)利要求22的載體，其中所述啟動子對于細(xì)菌宿主細(xì)胞不是天然的。25.權(quán)利要求23的載體，其中所述啟動子對于大腸桿菌是天然的。26.權(quán)利要求22的載體，其中所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。27.權(quán)利要求22的載體，其中所述啟動子是/ac啟動子或/ac啟動子衍生物。28.—種重組細(xì)胞，其包含選自下組的分泌多肽的分泌信號編碼序列蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp"、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(Ttg2C)、和接納曱基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽。29.權(quán)利要求28的重組細(xì)胞，其中所述編碼序列選自下組a)包含SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核苷酸序列的核酸分子；b)包含與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苦酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核香酸序列編碼分泌多肽；c)編碼包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列的聚多肽的核酸分子；d)包含編碼與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；e)包含編碼與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核普酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；f)在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核苷酸序列的基本上全長里雜交的核苷酸序列；和，g)在嚴(yán)格條件下在基本上全長里與編碼選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列雜交的核芬酸序列SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、和22。30.權(quán)利要求28的細(xì)胞，其中所述分泌信號編碼序列是在表達(dá)載體中的。31.權(quán)利要求28的細(xì)胞，其中所述分泌信號編碼序列是可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的序列的。32.權(quán)利要求31的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)可操作連接至所述分泌信號多肽的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽。33.權(quán)利要求32的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)或多肽在所述細(xì)胞的周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)。34.權(quán)利要求32的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的酶自所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽切割所述分泌信號多肽。35.權(quán)利要求28的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞衍生自細(xì)菌宿主。36.權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中所述宿主是假單胞菌。37.權(quán)利要求36的細(xì)胞，其中所述宿主是熒光假單胞菌。38.權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中所述宿主是大腸桿菌。39.—種分離的多肽，其包含選自下組的分泌多肽蛋白質(zhì)二好J建異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp"、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(Ttg2C)、和接納曱基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽。40.權(quán)利要求39的分離的多肽，其中所述多肽選自下組a)包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核苷酸序列編碼的多肽；c)包含與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是分泌信號多肽；d)包含與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽是分泌信號多肽；e)由與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苷斷列至少90%相同的核苦酸序列編碼的多肽，其中所述多肽是分泌信號多肽；和，0由在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核苷酸序列的基本上全長里雜交的核普酸序列所編碼的多肽。41.權(quán)利要求40的多肽，其中所述雜交條件包括約60。C至約70。C的溫度。42.權(quán)利要求39的多肽，其中所述雜交條件包括約68。C的溫度。43.權(quán)利要求39的多肽，其中所述分泌信號多肽是可操作連接至感興趣蛋白質(zhì)或多肽的。44.權(quán)利要求43的多肽，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自不是熒光假單胞菌生物體的生物體。45.用于表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)系統(tǒng)，其包含a)宿主細(xì)"包；和b)載體，其包含編碼可操作連接至選自下組的分泌信號多肽的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子蛋白質(zhì)二石危鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp^、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(Ttg2C)、和接納曱基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽。46.權(quán)利要求45的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述分泌信號多肽由選自下組的核酸分子編碼a)包含SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核苦酸序列的核酸分子；b)包含與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核香酸序列編碼分泌多肽；c)編碼包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列的聚多肽的核酸分子；d)包含編碼與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；e)包含編碼與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；f)在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核苷酸序列的基本上全長里雜交的核苷酸序列；和，g)在嚴(yán)格條件下在基本上全長里與編碼選自下組的氨基S吏序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、和22。47.權(quán)利要求46的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述雜交條件包括約60。C至約70。C的溫度。48.權(quán)利要求46的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述雜交條件包括約68。C的溫度。49.權(quán)利要求45的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)可操作連接至所述分泌信號多肽的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽。50.權(quán)利要求49的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽在所述細(xì)胞的周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)。51.權(quán)利要求49的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞中的酶自所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽切割所述信號多肽。52.權(quán)利要求45的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞衍生自細(xì)菌宿主。53.權(quán)利要求45的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述宿主是假單胞菌。54.權(quán)利要求53的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述宿主是熒光^f〖I單胞菌。55.權(quán)利要求52的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述宿主是大腸桿菌。56.權(quán)利要求45的表達(dá)系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括發(fā)酵培養(yǎng)基。57.權(quán)利要求56的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含化學(xué)誘導(dǎo)物。58.用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白的方法，包括提供包含如下載體的宿主細(xì)胞，所述載體編碼可操作連接至選自下組的分泌信號多肽的感興趣蛋白質(zhì)或多肽蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp"、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、Bce、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、Flgl、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、曱苯耐受蛋白(Ttg2C)、和接納甲基的趨化蛋白(ORF8124)分泌多肽。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述分泌信號多肽由選自下組的核酸分子編碼a)包含SEQIDNO:5、1、3、7、9、11、13、15、17、19、21、或23的核苷酸序列的核酸分子；b)包含與SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、21、或23的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼分泌多肽；c)編碼包含SEQIDNO:6、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、或24的氨基酸序列的聚多肽的核酸分子；d)包含編碼與SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、22、或24的氨基酸序列具有至少卯％氨基酸序列同一性的聚多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；e)包含編碼與SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少96。/。氨基酸序列同一性的聚多肽的核芬酸序列的核酸分子，其中所述聚多肽是分泌多肽；f)在嚴(yán)格條件下在SEQIDNO:5、3、7、9、11、13、15、17、或21的核香酸序列的基本上全長里雜交的核苷酸序列；和，g)在嚴(yán)格條件下在基本上全長里與編碼選自下組的氨基S吏序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列SEQIDNO:6、4、8、10、12、14、16、18、和22。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述雜交條件包括約60。C至約7(TC的溫度。61.權(quán)利要求59的方法，其中所述雜交條件包括約68。C的溫度。62.權(quán)利要求58的方法，其中所述細(xì)胞在礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。63.權(quán)利要求58的方法，其中所述細(xì)胞以高細(xì)胞密度培養(yǎng)。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述細(xì)胞以至少20g/L的細(xì)胞密度培養(yǎng)。65.權(quán)利要求58的方法，其進(jìn)一步包括純化所述重組蛋白。66.權(quán)利要求65的方法，其中通過親和層析來純化所述重組蛋白。67.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽和所述分泌信號多肽的所述可操作連接可被對于所述宿主細(xì)胞而言天然的酶切割。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述分泌信號多肽是在表達(dá)期間中自所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽切割的。69.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽對于衍生所述宿主細(xì)胞的生物體而言是天然的。70.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽對于熒光假單胞菌生物體而言是天然的。71.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽對于衍生所述宿主細(xì)胞的生物體而言不是天然的。72.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自不是假單胞菌的生物體。73.權(quán)利要求58的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽衍生自真核生物體。74.權(quán)利要求58的方法，其中所述重組蛋白包含包括至少兩個半胱氨酸殘基的序列。75.權(quán)利要求58的方法，其中在所述細(xì)胞中的所述重組蛋白中形成至少一個二硫鍵。76.權(quán)利要求58的方法，進(jìn)一步包括所述信號多肽序列和所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的序列之間的連接序列。77.權(quán)利要求69的方法，其中至少50%的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽包含天然氨基末端。78.權(quán)利要求77的方法，其中至少80%的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽包含天然氨基末端。79.權(quán)利要求78的方法，其中至少90%的所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽包含天然氨基末端。80.權(quán)利要求58的方法，其中至少50%的所述重組蛋白是有活性的。81.權(quán)利要求80的方法，其中至少80。/。的所述重組蛋白是有活性的。82.權(quán)利要求58的方法，其中至少50。/。的所述重組蛋白在周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)。83.權(quán)利要求82的方法，其中至少75%的所述重組蛋白在周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)。84.權(quán)利要求83的方法，其中至少90%的所述重組蛋白在周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)。85.權(quán)利要求58的方法，其中所述宿主細(xì)胞是假單胞菌細(xì)胞。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述細(xì)胞是熒光假單胞菌細(xì)胞。87.權(quán)利要求58的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。全文摘要提供了用于改善感興趣蛋白質(zhì)或多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和/或分泌的組合物和方法。提供了包含細(xì)菌分泌信號肽編碼序列的組合物?？梢栽谟糜谠谒拗骷?xì)胞中轉(zhuǎn)化和表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽的載體構(gòu)建體或表達(dá)系統(tǒng)中使用該編碼序列。本發(fā)明的組合物對于增加正確加工的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙中的積累，或者對于增加正確加工的蛋白質(zhì)自宿主細(xì)胞的分泌是有用的。具體地，該分泌信號肽包含蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶C(dsbC)、突變型磷酸結(jié)合蛋白(pbp^*)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A(dsbA)、CupA2、CupB2、CupC2、NikA、FlgI、三十四肽重復(fù)家族蛋白(ORF5550)、甲苯耐受蛋白(Ttg2C)、或接納甲基的趨化蛋白(ORF8124)分泌信號。文檔編號C12N15/62GK101641441SQ200880009677公開日2010年2月3日申請日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2007年1月31日發(fā)明者托馬斯·M·拉姆西爾,拉塞爾·J·科爾曼,斯泰西·L·李,查爾斯·D·赫什伯格,簡·C·施奈德,索爾·里斯尼克,黛安娜·雷塔拉克申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司