專利名稱：表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境生物工程和基因工程，具體涉及采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆農(nóng)藥毒死蜱的降解酶基因，構(gòu)建基因工程菌株，快速降解污染環(huán)境的毒死蜱。
背景技術(shù)：
我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥的生產(chǎn)量和使用量均呈逐年遞加之勢(shì)。農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的大量應(yīng)用，對(duì)于防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害方面起到了極其重要的作用，為糧食豐收提供了可靠的保證。但是長(zhǎng)期大量地使用農(nóng)藥使得環(huán)境中的農(nóng)藥污染日益嚴(yán)重，危及人們身體健康、食品安全及其他環(huán)境問(wèn)題。有機(jī)磷類農(nóng)藥得到長(zhǎng)期、廣泛、大量的應(yīng)用，其中毒死蜱是世界上使用量最大的農(nóng)藥之一。在我國(guó)，毒死蜱是甲胺磷和甲基對(duì)硫磷等高毒農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種，生產(chǎn)量和使用量很大。雖然毒死蜱是低毒的農(nóng)藥，但是使用量之大、使用范圍之廣，已對(duì)我國(guó)大部分地區(qū)的土壤、水體造成了嚴(yán)重的污染。存儲(chǔ)在土壤、水體中的毒死蜱不僅對(duì)動(dòng)植物、微生物等生命體產(chǎn)生毒害作用，而且，毒死蜱還直接和間接地影響了人類的健康，所以，需要研發(fā)高效清除毒死蜱等有機(jī)磷殘留污染的生態(tài)修復(fù)技術(shù)，為農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)和環(huán)境安全提供技術(shù)支持和參考。已經(jīng)報(bào)道采用降解毒死蜱的酶來(lái)清除環(huán)境中的毒死蜱殘留，但這種技術(shù)的效率不高，只能進(jìn)行小規(guī)模試用。采用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效降解菌株，將會(huì)提高降解效率，為污染環(huán)境的生物修復(fù)提供可實(shí)用的材料。本發(fā)明的菌種已按專利法實(shí)施細(xì)則第二十五條第三款的規(guī)定在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位——中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)；玫瑰紅紅球菌rhodochrous R-D3)菌株的保藏日期2010年9月15日，保藏號(hào)CCTCC M 2010232，并附具存活性報(bào)告書(shū)；微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的保藏日期2010年9月15日，保藏號(hào)CCTCC M 2010231，并附具存活性報(bào)告書(shū)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決農(nóng)藥污染的生物修復(fù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生物材料及構(gòu)建方法，即用于降解毒死蜱的一種表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌及其構(gòu)建方法。表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌從-miModococcus rhodochrous R-D3)，其基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG
8TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0 表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的構(gòu)建方法包括以下操作步驟
2.1提取微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的基因組 DNA ；
2.2以所述基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的mpd基因，擴(kuò)增引物序列如下 正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3， 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3，
PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)
預(yù)變性94 °C5分鐘，
變性94 °C1分鐘，
復(fù)性58 °C1分鐘，
延伸72 °C1分鐘，
循環(huán)30個(gè)，
終止延伸72 °C10分鐘，
得到微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的PCR產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱為Gl菌株的PCR產(chǎn)物； 將Gl菌株的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)
物；
2. 3將片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物與大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)連接，構(gòu)建測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，操作方法如下 2.3. 1酶切Gl菌株的PCR產(chǎn)物
用限制性內(nèi)切酶》10 KNde I酶切片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物，酶切條件如
下
限制性內(nèi)切酶Xhο I0. 5uL
限制性內(nèi)切酶Nde I0. 5uL
Gl菌株的PCR產(chǎn)物如L
10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL
雙蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)；得到Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物； 2.3.2回收將Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收11Λ的Gl菌株的PCR 產(chǎn)物的酶切片段；
2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)
用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切pET_28a(+)質(zhì)粒，酶切條件如下
限制性內(nèi)切酶Uho I)0. 5uL
限制性內(nèi)切酶(Nde I)0. 5uL 大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+) 4uL
10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL
雙蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4h，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)； 得到酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)； 2. 3. 4連接
用連接試劑盒試劑將所述11Λ的的Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段和酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET18a(+)連接起來(lái)；連接條件如下
酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET-28a (+)IuL
Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段1 μ L
雙蒸水(ddH20)3μ L
溶液 I (Solusion I)5μ L
冰浴加樣，混勻后16°C、30分鐘，即為測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液； 2. 3. 5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
2.3.5. 1將大腸桿菌DHlOB接種于50ml的LB培養(yǎng)基中，溫度37°C，搖床培養(yǎng)16小時(shí)， 得到培養(yǎng)物；
2.3.5.2取3mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于300mL LB培養(yǎng)基中，在溫度37°C的搖床上劇烈振蕩培養(yǎng) 2. 5-3 小時(shí)，使其光密度=0. 4-0. 5 (0D600=0. 4-0. 5)；
2. 3. 5. 3將濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液置于冰上預(yù)冷，分裝6支50ml離心管，冰浴5分鐘，4°C、1600g離心7分鐘；
2. 3. 5. 4棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置10分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘；
2. 3. 5. 5棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置30分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘；
2. 3. 5. 6傾去上清液，加入1. 4ml濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，其中甘油濃度為10%，懸浮離心后沉淀的細(xì)胞，分別取懸浮的細(xì)胞100 μ 1分裝到1. 5ml離心管中，將離心管_70°C保存，即為大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞；
2. 3. 5. 7將10 μ 1所述測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液加入到100 μ 1大腸桿菌DHlOB 感受態(tài)細(xì)胞中；
2. 3. 5. 8輕輕搖勻，冰上放置10分鐘，充分混勻； 2. 3. 5. 9溫度42 °C水浴中熱擊2分鐘；
2. 3. 5. 10加入890 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，混勻，37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；得到大腸桿菌DHlOB菌液；2. 3. 5. 11分別取大腸桿菌DHlOB菌液100 μ 1涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基平板，溫度37°C、培養(yǎng)16 19小時(shí)，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果；
2.3.5. 12平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，條件同上述2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒 pET-28a(+)步驟，電泳圖譜顯示分別為11Λ和5. 3kb的條帶，證明測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C構(gòu)建正確；
2. 4測(cè)定測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，獲得測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C中mpd 基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCG GCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA 2. 5構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C
2. 5.1用PCR擴(kuò)增的方法從測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中克隆mpd基因，擴(kuò)增測(cè)序重組質(zhì)粒 pET-C上mpd基因的PCR擴(kuò)增引物如下
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’ PCR反應(yīng)參數(shù)
預(yù)變性94 °C5分鐘，
變性94 °C1分鐘，
復(fù)性56 °C1分鐘，
延伸72 °C1分鐘，
循環(huán)30個(gè)，
終止延伸72 °C10分鐘，
得到測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物；
2. 5. 2構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C
2. 5. 2. 1回收測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物
用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段；
2. 5. 2. 2酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物用兩種限制性內(nèi)切酶Kpn K Xba I分別酶切所述的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段，酶切條件如下
測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物片段5 μ L
10倍的酶切緩沖液(10XL Buffer)2μ L
限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下
回收的11Λ測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物 IOuL 10倍的酶切緩沖液(M Buffer)2 μ L
限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5uL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物； 2. 5. 2. 3 酶切質(zhì)粒pDA71 (美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種典藏中心American Type Culture Collection,縮寫(xiě) ATCC，檢索號(hào) 77474)
用兩種酶Kpn I ,Xba I分別酶切質(zhì)粒pDA71，酶切條件如下 質(zhì)粒 pDA715μ L
10倍的酶切緩沖液(10 X L buffer )2 μ L
限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下
回收的質(zhì)粒PDA71的一次酶切產(chǎn)物10 μ L
10倍的酶切緩沖液(IOXM buffer)2μ L
限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5yL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer),
瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物； 2. 5. 2. 4 連接
用連接試劑盒將所述質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物和測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C ；連接條件如下 質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物如L
測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物如L 10 倍連接緩沖液(10XLigase Buffer)IuL
T4 DNA 連接酶(Ligase)IuL,
16°C水浴12 - 16小時(shí)，即得表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物，表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C連接產(chǎn)物中含有降解農(nóng)藥毒死蜱的mpd基因；
2. 5. 2. 5用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如上述2. 3. 5. 1 2. 3. 5. 6步驟； 用表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，將10 μ 1表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物加入到100 μ 1大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中；操作方法如上述第 2. 3. 5. 8 2. 3. 5. 12步驟，但在第2. 3. 5. 11步驟中需用氨芐青霉素50mg/L取代卡那霉素， 獲得帶有表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子；
采用公知的方法從帶有表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子中提取表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C，具體提取方法如下
將一環(huán)表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子接種到3mL含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取1. 5mL菌液加入離心管中，4°C下lOOOOr/min離心Imin ； 棄上清，將管倒置吸水紙上，使液體流盡；
加入150μ 1用冰預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris-Cl)pH 8.0,10 mM/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0)，劇烈振蕩，重新懸浮菌體沉淀， 室溫放置;T5min ；加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mo 1/L氯化鈉(NaOH)，1%十二烷基硫酸鈉(SDS))，溫和混勻，切勿劇烈振蕩，室溫5min ；加入450 μ 1預(yù)冷的溶液III (乙酸鉀溶液，pH 4. 8)，反復(fù)顛倒數(shù)次，溫和混勻，室溫5 IOmin ； 12000r/min離心5min ；
將上清液轉(zhuǎn)入干凈的1. 5mL離心管中，加入1. 5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，冰上放置10分鐘，然后12000r/min離心IOmin ；徹底棄去上清液，沿壁加入ImlL 70%乙醇漂洗沉淀，顛倒數(shù)次，立即去上清，自然干燥；將沉淀物溶于30μ1 TE緩沖液(10mM/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris .Cl)，ImM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0，含 20μ g/mL 的核酸酶 RNaseA))中，37°C 保溫30min后即為表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C ；
采用與上述第2. 5. 2.3節(jié)中)(ba I酶切、Kpn I酶切同樣的條件酶切表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C，瓊脂糖電泳顯示兩個(gè)條帶，大小分別為11Λ和6. 21Λ，分別為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因和微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的pDA71質(zhì)粒載體，證明表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C構(gòu)建正確；
2. 5. 2. 6 玫瑰紅紅球菌 R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的轉(zhuǎn)化 2. 5. 2. 6. 1玫瑰紅紅球菌R-D3菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備 2. 5. 2. 6. 1. 1按1%的接種量將玫瑰紅紅球菌R-D3菌株接種到IOOmL的LB培養(yǎng)基中， 溫度30°C，培養(yǎng)18-M小時(shí)，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，簡(jiǎn)稱R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物；
2. 5. 2. 6. 1. 2取IOmL R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，用4°C的無(wú)菌水洗滌1次，再用4°C 10%甘油洗滌2次；
2. 5. 2. 6. 1. 3離心2次后，棄去上清液，用ImL濃度10%的甘油重懸，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞；
2. 5. 2. 6. 2用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C電轉(zhuǎn)化玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下
2. 5. 2. 6. 2. 1取1 μ L表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C與80 μ L的玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞混合，移入電擊杯中，冰浴10分鐘；將電擊杯置于電擊槽中電擊，電擊參數(shù)電擊杯0. 2cm,電壓2. OkV，電擊時(shí)間3. 5ms ；
2. 5. 2. 6. 2. 2電擊完畢，立即向杯中加入420 μ L的LB培養(yǎng)液，溫度30°C、振蕩培養(yǎng)3 小時(shí)，即為電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
2. 5. 2. 6. 2. 3將電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素和200mg/L農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑的牛肉膏蛋白胨平板，30°C培養(yǎng)5天；
2. 5. 2. 6. 3玫瑰紅紅球菌R-D3中mpd基因表達(dá)的檢測(cè)
平板上出現(xiàn)菌落，有的菌落周圍出現(xiàn)透明的水解圈，有的菌落周圍沒(méi)有透明的水解圈； 有透明水解圈者，是由于這些菌落中的細(xì)胞的mpd基因表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，因而形成透明的水解圈；證明微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因在這些菌落的細(xì)胞中表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，出現(xiàn)水解圈；這些菌落即為表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 (.Rhodococcus rhodochrous R-D3)。本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面
1、表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3可以快速降解水體中的農(nóng)藥毒死蜱殘留。在含有農(nóng)藥毒死蜱100mg/L的水中，添加構(gòu)建的帶有mpd基因的玫瑰紅紅球菌菌液，采用GC2010 島津氣相色譜測(cè)定，與沒(méi)有添加玫瑰紅紅球菌菌液的對(duì)照比較二4小時(shí)內(nèi)毒死蜱的降解達(dá) 70 %以上，說(shuō)明構(gòu)建的帶有mpd基因的玫瑰紅紅球菌具有高效降解水中農(nóng)藥毒死蜱殘留的能力。2、表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌可以快速降解土壤中的農(nóng)藥毒死蜱殘留。取2份土壤樣品，模擬土壤中農(nóng)藥毒死蜱殘留達(dá)200mg/kg;在其中一份土壤樣品中加入表達(dá)mpd 基因的玫瑰紅紅球菌基因工程菌株菌液，另一份不加菌液為對(duì)照。將這2份土壤樣品在 30°C培養(yǎng)2天，用GC2010島津氣相色譜測(cè)定，與對(duì)照比較，24小時(shí)內(nèi)毒死蜱的降解達(dá)80% 以上，說(shuō)明構(gòu)建的帶有mpd基因的玫瑰紅紅球菌能夠快速降解土壤中的高濃度農(nóng)藥毒死蜱殘留。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明。實(shí)施例
表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的基因序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGC ACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGC TGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCG GCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGT CAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGG CCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTG GGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTG GCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGA ACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCC AGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCT GATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGC ATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA。
表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3的構(gòu)建方法包括以下操作步驟
表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的構(gòu)建方法， 其特征在于包括以下操作步驟
2.1提取微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的基因組 DNA ；
2.2以所述基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的mpd基因，擴(kuò)增引物序列如下 正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3， 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3， PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù) 預(yù)變性94 °C
變性94 °C
復(fù)性58 °C
延伸72 °C
循環(huán)30個(gè)，
終止延伸72 °C
稱為Gl菌株的PCR產(chǎn)物；
將Gl菌株的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)
物；
2. 3將片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物與大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)連接，構(gòu)建測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，操作方法如下 2.3. 1酶切Gl菌株的PCR產(chǎn)物
用限制性內(nèi)切酶》10 KNde I酶切片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物，酶切條件如
下
限制性內(nèi)切酶》ιο I0. 5uL
限制性內(nèi)切酶Nde I0. 5uL
Gl菌株的PCR產(chǎn)物如L
10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL
雙蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)；得到Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物； 2.3.2回收
將Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收11Λ的Gl菌株的PCR 產(chǎn)物的酶切片段；
2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)
用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切pET_28a(+)質(zhì)粒，酶切條件如下 限制性內(nèi)切酶(Xho I)0. 5uL
5分鐘， 1分鐘， 1分鐘， 1分鐘，
10分鐘，得到微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的PCR產(chǎn)物，簡(jiǎn)
15限制性內(nèi)切酶(Nde I)0. 5uL 大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+) 4uL
10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL
雙蒸水(ddH20)13uL
37°C水浴4h，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)； 得到酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)； 2. 3. 4連接
用連接試劑盒試劑將所述11Λ的的Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段和酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET18a(+)連接起來(lái)；連接條件如下
酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET-28a (+)IuL
Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段1 μ L
雙蒸水(ddH20)3μ L
溶液 I (Solusion I)5μ L
冰浴加樣，混勻后16°C、30分鐘，即為測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液； 2. 3. 5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
2.3.5. 1將大腸桿菌DHlOB接種于50ml的LB培養(yǎng)基中，溫度37°C，搖床培養(yǎng)16小時(shí)， 得到培養(yǎng)物；
2.3.5.2取3mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于300mL LB培養(yǎng)基中，在溫度37°C的搖床上劇烈振蕩培養(yǎng) 2. 5-3 小時(shí)，使其光密度=0. 4-0. 5 (0D600=0. 4-0. 5)；
2. 3. 5. 3將濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液置于冰上預(yù)冷，分裝6支50ml離心管，冰浴5分鐘，4°C、1600g離心7分鐘；
2. 3. 5. 4棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置10分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘；
2. 3. 5. 5棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置30分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘；
2. 3. 5. 6傾去上清液，加入1. 4ml濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，其中甘油濃度為10%，懸浮離心后沉淀的細(xì)胞，分別取懸浮的細(xì)胞100 μ 1分裝到1. 5ml離心管中，將離心管_70°C保存，即為大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞；
2. 3. 5. 7將10 μ 1所述測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液加入到100 μ 1大腸桿菌DHlOB 感受態(tài)細(xì)胞中；
2. 3. 5. 8輕輕搖勻，冰上放置10分鐘，充分混勻； 2. 3. 5. 9溫度42 °C水浴中熱擊2分鐘；
2. 3. 5. 10加入890 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，混勻，37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；得到大腸桿菌DHlOB菌液；
2. 3. 5. 11分別取大腸桿菌DHlOB菌液100 μ 1涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基平板，溫度37°C、培養(yǎng)16 19小時(shí)，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果；
2.3.5. 12平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，條件同上述2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒 pET-28a(+)步驟，電泳圖譜顯示分別為11Λ和5. 3kb的條帶，證明測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C構(gòu)建正確；
2. 4測(cè)定測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，獲得測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C中mpd 基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCG GCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA 2. 5構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C
2. 5.1用PCR擴(kuò)增的方法從測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中克隆mpd基因，擴(kuò)增測(cè)序重組質(zhì)粒 pET-C上mpd基因的PCR擴(kuò)增引物如下
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’ PCR反應(yīng)參數(shù)
預(yù)變性94 0C5分鐘，變性94 0C1分鐘，復(fù)性56 0C1分鐘，延伸72 0C1分鐘，循環(huán)30個(gè)，
終止延伸72 °C10分鐘，
得到測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物； 2. 5. 2構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C 2. 5. 2. 1回收測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物
用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段；
2. 5. 2. 2酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物
用兩種限制性內(nèi)切酶Kpn K Xba I分別酶切所述的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段，酶切條件如下
測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物片段5 μ L
10倍的酶切緩沖液(10XL Buffer)2μ L
限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下
回收的11Λ測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物 IOuL 10倍的酶切緩沖液(M Buffer)2 μ L
限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5uL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物； 2. 5. 2. 3 酶切質(zhì)粒pDA71 (美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種典藏中心American Type Culture Collection,縮寫(xiě) ATCC,檢索號(hào) 77474)
用兩種酶Kpn I ,Xba I分別酶切質(zhì)粒pDA71，酶切條件如下 質(zhì)粒 pDA715μ L
10倍的酶切緩沖液(10 X L buffer )2 μ L
限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下
回收的質(zhì)粒PDA71的一次酶切產(chǎn)物10 μ L
10倍的酶切緩沖液(IOXM buffer)2μ L
限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5yL
無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L
37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer),
瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物； 2. 5. 2. 4 連接
用連接試劑盒將所述質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物和測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C ；連接條件如下 質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物如L
測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物如L 10 倍連接緩沖液(10XLigase Buffer)IuL
T4 DNA 連接酶(Ligase)IuL,
16°C水浴12 - 16小時(shí)，即得表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物，表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C 連接產(chǎn)物中含有降解農(nóng)藥毒死蜱的mpd基因；
2. 5. 2. 5用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如上述2. 3. 5. 1 2. 3. 5. 6步驟； 用表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，將10 μ 1表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物加入到100 μ 1大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中；操作方法如上述第2. 3. 5. 8 2. 3. 5. 12步驟，但在第2. 3. 5. 11中需用氨芐青霉素50mg/L取代卡那霉素，獲得帶有表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子；
將一環(huán)表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子接種到3mL含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取1. 5mL菌液加入離心管中，4°C下lOOOOr/min離心Imin ； 棄上清，將管倒置吸水紙上，使液體流盡；
加入150 μ 1用冰預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris -CDpH 8.0,10 mM/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0)，劇烈振蕩，重新懸浮菌體沉淀， 室溫放置3 5min ；加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mol/L氯化鈉(NaOH)，1%十二烷基硫酸鈉(SDS))，溫和混勻，切勿劇烈振蕩，室溫5min ；加入450μ 1預(yù)冷的溶液III (乙酸鉀溶液， PH 4. 8)，反復(fù)顛倒數(shù)次，溫和混勻，室溫5 IOmin ； 12000r/min離心5min ；
將上清液轉(zhuǎn)入干凈的1. 5mL離心管中，加入1. 5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，冰上放置10分鐘，然后12000r/min離心IOmin ；徹底棄去上清液，沿壁加入ImlL 70%乙醇漂洗沉淀，顛倒數(shù)次，立即去上清，自然干燥；將沉淀物溶于30μ1 TE緩沖液(10mM/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris .Cl)，ImM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0，含 20μ g/mL 的核酸酶 RNaseA))中，37°C 保溫30min后即為表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C ；
采用與上述第2. 5. 2. 3步驟中)(ba I酶切、Kpn I酶切同樣的條件酶切表達(dá)重組質(zhì)粒 pDA71-C，l%瓊脂糖電泳顯示兩個(gè)條帶，大小分別為11Λ和6. 21Λ，分別為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因和微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的pDA71質(zhì)粒載體，證明表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C構(gòu)建正確；
2. 5. 2. 6 玫瑰紅紅球菌 R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的轉(zhuǎn)化 2. 5. 2. 6. 1玫瑰紅紅球菌R-D3菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備 2. 5. 2. 6. 1. 1按1%的接種量將玫瑰紅紅球菌R-D3菌株接種到IOOmL的LB培養(yǎng)基中， 溫度30°C，培養(yǎng)18-M小時(shí)，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，簡(jiǎn)稱R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物；
2. 5. 2. 6. 1. 2取IOmL R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，用4°C的無(wú)菌水洗滌1次，再用4°C 10%甘油洗滌2次；
2. 5. 2. 6. 1. 3離心2次后，棄去上清液，用ImL濃度10%的甘油重懸，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞；
2. 5. 2. 6. 2用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C電轉(zhuǎn)化玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下
2. 5. 2. 6. 2. 1取1 μ L表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C與80 μ L的玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞混合，移入電擊杯中，冰浴10分鐘；將電擊杯置于電擊槽中電擊，電擊參數(shù)電擊杯 0. 2cm,電壓2. OkV，電擊時(shí)間3. 5ms ；
2. 5. 2. 6. 2. 2電擊完畢，立即向杯中加入420 μ L的LB培養(yǎng)液，溫度30°C、振蕩培養(yǎng)3 小時(shí)，即為電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
2. 5. 2. 6. 2. 3將電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素和200mg/L農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑的牛肉膏蛋白胨平板，30°C培養(yǎng)5天；
2. 5. 2. 6. 3玫瑰紅紅球菌R-D3中mpd基因表達(dá)的檢測(cè)
平板上出現(xiàn)菌落，有的菌落周圍出現(xiàn)透明的水解圈，有的菌落周圍沒(méi)有透明的水解圈；有透明水解圈者，是由于這些菌落中的細(xì)胞的mpd基因表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，因而形成透明的水解圈；證明微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因在這些菌落的細(xì)胞中表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，出現(xiàn)水解圈；這些菌落即為表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 (.Rhodococcus rhodochrous R-D3)，基因核苷酸序列如下
ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0構(gòu)建表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3所用材料如下 2. 2步驟擴(kuò)增引物
正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3，、 反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3，， 由上海生工生物工程有限公司根據(jù)所述的序列合成。質(zhì)粒pET48a(+)，購(gòu)自德國(guó)默克Novagen公司。質(zhì)粒pDA71，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種典藏中心(American Type Culture Collection，縮寫(xiě) ATCC)提供，檢索號(hào)77474。限制性內(nèi)切酶Kpn I ,Nde I、Xho I、Xho I和T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司。2. 5.1步驟擴(kuò)增引物
正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3，， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3，， 由上海生工生物工程有限公司根據(jù)所述的序列合成。大腸桿菌DHlOB菌株，上海雷浩信息科技有限公司提供。
權(quán)利要求
1.表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3{Rhodococcus rhodochrous R-D3)，其特征在于其基因核苷酸序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0
2.表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3{Rhodococcus rhodochrous R-D3)的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下操作步驟2.1提取微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的基因組 DNA ；2.2以所述基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl {Stenotrophomonas acidaminiphila Gl)菌株的mpd基因，擴(kuò)增引物序列如下正向5，-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3，反向5’ -GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3，PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94 0C5分鐘，變性94 0C1分鐘，復(fù)性58 0C1分鐘，延伸72 0C1分鐘，循環(huán)30個(gè)，終止延伸72 °C10分鐘，得到微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的PCR產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱為Gl菌株的PCR產(chǎn)物； 將Gl菌株的PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物；2.3將片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物與大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)連接，構(gòu)建測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，操作方法如下 2.3. 1酶切Gl菌株的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶》10 KNde I酶切片段大小11Λ的Gl菌株的PCR產(chǎn)物，酶切條件如下限制性內(nèi)切酶》ιο I0. 5uL限制性內(nèi)切酶Nde I0. 5uLGl菌株的PCR產(chǎn)物如L10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL雙蒸水(ddH20)13uL、37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)；得到Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物； 2.3.2回收將Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收11Λ的Gl菌株的PCR 產(chǎn)物的酶切片段；、2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切pET_28a(+)質(zhì)粒，酶切條件如下限制性內(nèi)切酶(Xho I)0. 5uL限制性內(nèi)切酶(Nde I)0. 5uL 大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+) 4uL、10倍的酶切緩沖液(H Buffer)2 uL雙蒸水(ddH20)13uL、37°C水浴4h，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液(10XLoading Buffer)終止酶反應(yīng)； 得到酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET48a(+)； 2. 3. 4連接用連接試劑盒試劑將所述11Λ的的Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段和酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET18a(+)連接起來(lái)；連接條件如下酶切的大腸桿菌質(zhì)粒pET-28a (+)IuL、Gl菌株的PCR產(chǎn)物的酶切片段1 μ L雙蒸水(ddH20)3μ L溶液 I (Solusion I)5μ L冰浴加樣，混勻后16°C、30分鐘，即為測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液； 2. 3. 5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、2.3.5. 1將大腸桿菌DHlOB接種于50ml的LB培養(yǎng)基中，溫度37°C，搖床培養(yǎng)16小時(shí)， 得到培養(yǎng)物；、2.3.5.2取3mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于300mL LB培養(yǎng)基中，在溫度37°C的搖床上劇烈振蕩培養(yǎng) 2. 5-3 小時(shí)，使其光密度=0. 4-0. 5 (0D600=0. 4-0. 5)；、2. 3. 5. 3將濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液置于冰上預(yù)冷，分裝6支50ml離心管，冰浴5分鐘，4°C、1600g離心7分鐘；、2. 3. 5. 4棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置10分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘；、2. 3. 5. 5棄去上清，加入7mL預(yù)冷濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，在冰放置30分鐘；4°C下IlOOg冷凍離心5分鐘； 、2. 3. 5. 6傾去上清液，加入1. 4ml濃度0. 5mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液，其中甘油濃度為10%，懸浮離心后沉淀的細(xì)胞，分別取懸浮的細(xì)胞100 μ 1分裝到1. 5ml離心管中，將離心管_70°C保存，即為大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞；2. 3. 5. 7將10 μ 1所述測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C連接反應(yīng)液加入到100 μ 1大腸桿菌DHlOB 感受態(tài)細(xì)胞中；2. 3. 5. 8輕輕搖勻，冰上放置10分鐘，充分混勻； 2. 3. 5. 9溫度42 °C水浴中熱擊2分鐘；2. 3. 5. 10加入890 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，混勻，37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)；得到大腸桿菌DHlOB菌液；2. 3. 5. 11分別取大腸桿菌DHlOB菌液100 μ 1涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基平板，溫度37°C、培養(yǎng)16 19小時(shí)，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果；2.3.5. 12平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，用限制性內(nèi)切酶》io I ,Nde I酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C，條件同上述2. 3. 3酶切大腸桿菌質(zhì)粒 pET-28a(+)步驟，電泳圖譜顯示分別為11Λ和5. 3kb的條帶，證明測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C構(gòu)建正確；2. 4測(cè)定測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，獲得測(cè)序重組質(zhì)粒pET_C中mpd 基因核苷酸序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCG GCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA 2. 5構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C2. 5.1用PCR擴(kuò)增的方法從測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C中克隆mpd基因，擴(kuò)增測(cè)序重組質(zhì)粒 pET-C上mpd基因的PCR擴(kuò)增引物如下正向5，- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3， 反向5’ - CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’ PCR反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94 °C5分鐘，變性94 °C1分鐘，復(fù)性56 °C1分鐘，延伸72 °C1分鐘，循環(huán)30個(gè)，終止延伸72 °C10分鐘，得到測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物； 2. 5. 2構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C 2. 5. 2. 1回收測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段；2. 5. 2. 2酶切測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物用兩種限制性內(nèi)切酶Kpn K Xba I分別酶切所述的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物片段，酶切條件如下測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物片段5 μ L10倍的酶切緩沖液(10XL Buffer)2μ L限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下回收的11Λ測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第一次酶切產(chǎn)物 IOuL 10倍的酶切緩沖液(M Buffer)2 μ L限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5uL無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收11Λ的測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物； 2. 5. 2. 3 酶切質(zhì)粒pDA71 (美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種典藏中心American Type Culture Collection,縮寫(xiě) ATCC，檢索號(hào) 77474)用兩種酶Kpn I ,Xba I分別酶切質(zhì)粒pDA71，酶切條件如下 質(zhì)粒 pDA715μ L10倍的酶切緩沖液(10 X L buffer )2 μ L限制性內(nèi)切酶KpnI0. 5yL無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 1%瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第一次酶切產(chǎn)物； 第二次酶切條件如下回收的質(zhì)粒PDA71的一次酶切產(chǎn)物10 μ L10倍的酶切緩沖液(IOXM buffer)2μ L限制性內(nèi)切酶)(ba I0. 5yL無(wú)菌水補(bǔ)至20 μ L37°C水浴4小時(shí)，加入1/10體積的10倍的上樣緩沖液(10X Loading Buffer), 瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物；·2. 5. 2. 4 連接用連接試劑盒將所述質(zhì)粒PDA71的第二次酶切產(chǎn)物和測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C ；連接條件如下·16°C水浴12 - 16小時(shí)，即得表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物，表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C 連接產(chǎn)物中含有降解農(nóng)藥毒死蜱的mpd基因；·2. 5. 2. 5用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞的制備方法如上述2. 3. 5. 1 2. 3. 5. 6步驟； 用表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，將10 μ 1表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C連接產(chǎn)物加入到100 μ 1大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中；操作方法如上述第 2. 3. 5. 8 2. ·3. 5. 12步驟，但在第2. 3. 5. 11步驟中需用氨芐青霉素50mg/L取代卡那霉素， 獲得帶有表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子；采用公知的方法從帶有表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子中提取表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C，具體提取方法如下將一環(huán)表達(dá)重組質(zhì)粒PDA71-C的轉(zhuǎn)化子接種到3mL含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取1. 5mL菌液加入離心管中，4°C下lOOOOr/min離心Imin ； 棄上清，將管倒置吸水紙上，使液體流盡；加入150μ 1用冰預(yù)冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris-Cl)pH 8.0,10 mM/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0)，劇烈振蕩，重新懸浮菌體沉淀， 室溫放置;T5min ；加入200μ 1新配制的溶液II (0. 2mo 1/L氯化鈉(NaOH)，1%十二烷基硫酸鈉(SDS))，溫和混勻，切勿劇烈振蕩，室溫5min ；加入450 μ 1預(yù)冷的溶液III (乙酸鉀溶液，pH 4. 8)，反復(fù)顛倒數(shù)次，溫和混勻，室溫5 IOmin ； 12000r/min離心5min ；將上清液轉(zhuǎn)入干凈的1. 5mL離心管中，加入1. 5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，冰上放置10分鐘，然后12000r/min離心IOmin ；徹底棄去上清液，沿壁加入ImlL 70%乙醇漂洗沉淀，顛倒數(shù)次，立即去上清，自然干燥；將沉淀物溶于30 μ 1 TE緩沖液(10mM/L三羥甲基氨基甲烷 (Tris .Cl)，ImM/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8. 0，含 20μ g/mL 的核酸酶 RNaseA))中，37°C 保溫30min后即為表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C ；采用與上述第2. 5. 2.3節(jié)中)(ba I酶切、Kpn I酶切同樣的條件酶切表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C，瓊脂糖電泳顯示兩個(gè)條帶，大小分別為11Λ和6. 21Λ，分別為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因和微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的pDA71質(zhì)粒載體，證明表達(dá)重組質(zhì)粒 PDA71-C構(gòu)建正確；·2. 5. 2. 6 玫瑰紅紅球菌 R-D3 {Rhodococcus rhodochrous R-D3)的轉(zhuǎn)化 2. 5. 2. 6. 1玫瑰紅紅球菌R-D3菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備 2. 5. 2. 6. 1. 1按1%的接種量將玫瑰紅紅球菌R-D3菌株接種到IOOmL的LB培養(yǎng)基中， 溫度30°C，培養(yǎng)18-M小時(shí)，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，簡(jiǎn)稱R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物；質(zhì)粒pDA71的第二次酶切產(chǎn)物測(cè)序重組質(zhì)粒PET-C的PCR產(chǎn)物的第二次酶切產(chǎn)物·10 倍連接緩沖液(10XLigase Buffer)T4 DNA 連接酶(Ligase)·2. 5. 2. 6. 1. 2取IOmL R-D3菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)物，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，用4°C的無(wú)菌水洗滌1次，再用4°C 10%甘油洗滌2次；·2. 5. 2. 6. 1. 3離心2次后，棄去上清液，用ImL濃度10%的甘油重懸，得到玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞；·2. 5. 2. 6. 2用表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C電轉(zhuǎn)化玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞，步驟如下·2. 5. 2. 6. 2. 1取1 μ L表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71_C與80 μ L的玫瑰紅紅球菌R-D3菌株感受態(tài)細(xì)胞混合，移入電擊杯中，冰浴10分鐘；將電擊杯置于電擊槽中電擊，電擊參數(shù)電擊杯 0. 2cm,電壓2. OkV，電擊時(shí)間3. 5ms ；·2. 5. 2. 6. 2. 2電擊完畢，立即向杯中加入420 μ L的LB培養(yǎng)液，溫度30°C、振蕩培養(yǎng)3 小時(shí)，即為電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；·2. 5. 2. 6. 2. 3將電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素和200mg/L農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑的牛肉膏蛋白胨平板，30°C培養(yǎng)5天；·2. 5. 2. 6. 3玫瑰紅紅球菌R-D3中mpd基因表達(dá)的檢測(cè)平板上出現(xiàn)菌落，有的菌落周圍出現(xiàn)透明的水解圈，有的菌落周圍沒(méi)有透明的水解圈； 有透明水解圈者，是由于這些菌落中的細(xì)胞的mpd基因表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，因而形成透明的水解圈；證明微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Gl菌株的mpd基因在這些菌落的細(xì)胞中表達(dá)，降解農(nóng)藥毒死蜱，出現(xiàn)水解圈；這些菌落即為表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3 (.Rhodococcus rhodochrous R-D3)，基因核苷酸序列如下ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTT GCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGAT GCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGC CGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTC GTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGC GGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACG TGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTC TGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCT GAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGG CCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGAC CTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGC GGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCC GGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTG A0
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌及其構(gòu)建方法。表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3可以快速降解水體中的農(nóng)藥毒死蜱殘留。其構(gòu)建方法包括以下步驟1、提取微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌G1菌株的基因組DNA；2、擴(kuò)增得到G1菌株的PCR產(chǎn)物；3、將G1菌株的PCR產(chǎn)物與大腸桿菌質(zhì)粒pET-28a(+)連接，構(gòu)建測(cè)序重組質(zhì)粒pET-C；4、構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C；構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pDA71-C電轉(zhuǎn)化玫瑰紅紅球菌R-D3菌株得到表達(dá)mpd基因的玫瑰紅紅球菌R-D3。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102174457SQ201110039040
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者唐欣昀, 王道勝, 甘旭華, 花日茂, 高婷婷 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)