專利名稱：用于制備固定化dna文庫的裝置,基因擴增的裝置,溫度控制方法以及系統(tǒng)比較基因的方法
工業(yè)領域本發(fā)明涉及一種反應裝置，它可通過加熱少量的溶液應用于分子生物學和生物化學領域諸如基因工程，蛋白質(zhì)工程，細胞工程，胚胎工程和免疫工程的多種反應。具體的，本發(fā)明涉及一種制備固定化DNA文庫的方法，一種基因擴增的方法，一種系統(tǒng)比較基因的方法，以及因此的裝置和固定化DNA文庫。
本發(fā)明背景常規(guī)地，聚合酶鏈式反應(PCR)已經(jīng)廣泛用作擴增基因的方法。在PCR方法中，將填充了反應溶液的管狀塑料反應容器插入到鋁塊中并用蓋子防止反應溶液的蒸發(fā)。鋁塊的溫度周期性地按順序變?yōu)闊嶙冃詼囟?，退火溫度和DNA合成溫度。按預定次數(shù)重復這種溫度控制循環(huán)。
但是，在常規(guī)PCR方法中，使用的設備是塑料反應器，它的熱容量相對較大并且熱傳導率很低。此外，溫度控制是對鋁塊本身進行操作。因而，需要花費更長的時間加熱/冷卻。由于反應溶液的溫度控制不完全，復制的目的DNA的收量相對較低。
本發(fā)明的一個目的是解決上述缺陷和提供易于操作的，其中的加熱/冷卻步驟可快速操作并且可縮短反應熱循環(huán)的基因擴增的裝置，以及擴增基因的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于固定化DNA的基體和制備適于上述裝置的固定化DNA的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供通過上述裝置進行基因系統(tǒng)比較的方法。
本發(fā)明的公開
本發(fā)明的制備固定化DNA文庫的裝置包括反應器主體，上面有凹槽部分來接納容器；在反應器主體上方有一個蓋子部分，含有加熱/冷卻裝置和冷卻裝置。其中該裝置的特征是容器由至少一種化學修飾的基體制成。
本發(fā)明的一種基因擴增的裝置包括反應器主體，上面有凹槽部分來接納容器；在反應器主體上方有一個蓋子部分，含有加熱/冷卻裝置和冷卻裝置。其中該裝置的特征是容器至少由一種化學修飾的基體制成。
本發(fā)明的一種基因擴增的裝置包括反應器主體，上面有凹槽部分來接納容器；在反應器主體上方有一個蓋子部分，含有加熱/冷卻裝置和冷卻裝置。其中該裝置的特征是容器至少由一種固定化了基因的基體制成。
在這些裝置中，基體優(yōu)選地是固相基體并且容器是可分離型的和盒型的。
在通過本發(fā)明的用于擴增基因的裝置的溫度控制的方法中，特征是將來自溫度測量部分61的信號輸入到計算機控制部分64，計算機控制部分64將信號與預先輸入的程序表比較，從而驅(qū)動加熱/冷卻裝置51的溫度控制部分62以及冷卻裝置52的溫度控制部分63。
本發(fā)明的固定化了DNA的基體的特征是該基體用于上述裝置。
本發(fā)明的將基體冷凍保存的方法，特征是將固定化了DNA的基體冷凍保存。
本發(fā)明的系統(tǒng)比較基因的方法，特征是將多種固定化DNA-文庫置入容器中。
附圖的簡要說明

圖1圖示了本發(fā)明的基因擴增裝置的平面圖，其中蓋子是打開的。
圖2是沿圖1中的線A-A的剖面圖。
圖3是沿圖1中的線B-B的剖面圖。
圖4圖示制造容器的流程。
圖5圖示本發(fā)明的基因擴增裝置的剖面圖。
圖6圖示控制本發(fā)明的基因擴增裝置的溫度的方法。
圖7圖示產(chǎn)生固定化cDNA文庫和擴增基因的流程。
圖8圖示產(chǎn)生固定化gDNA文庫和擴增基因的流程。
實施本發(fā)明的最佳方式下面描述本發(fā)明的基因擴增裝置。
圖1圖示本發(fā)明基因擴增裝置的平面圖，其中蓋子是打開的。圖2圖示本發(fā)明基因擴增裝置的沿圖1中的線A-A的橫截面圖。圖3圖示該裝置的沿圖1中的線B-B的橫截面圖。圖4圖示制造容器的流程。圖5圖示本發(fā)明的基因擴增裝置的橫截面圖。
如圖1至圖3所示，數(shù)字10表示反應器主體，數(shù)字11表示在反應器主體上形成的凹槽部分。優(yōu)選地，反應器主體10由化學穩(wěn)定的聚合物材料諸如丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂組成。在反應器主體上至少制成一個凹槽部分11。凹槽部分的形狀優(yōu)選的是圓柱體或多邊柱體諸如三角柱體和方柱體。優(yōu)選地，容器12由熱傳導性好的基體41如金剛石基體，陶瓷基體諸如氮化鋁和碳化硅以及金屬基體諸如鋁和不銹鋼基體等制成。
或者，它優(yōu)選地是一種金剛石樣的碳基體，其部分由金剛石，碳基體和化合物基體組成。亦為優(yōu)選的是塑料基體諸如聚碳酸酯基體和氟樹脂基體。此外，優(yōu)選地使用組合了上述基體的基體。
容器12可以有個底面部分，優(yōu)選地易于安裝到凹槽部分11和易于取下。
容器12優(yōu)選地含有可分解為底面部分和側(cè)壁部分的基體。例如，在方柱形容器時，基體可分為底面部分和四個側(cè)壁部分。如圖4(a)所示，各基體的每一邊分別為從5mm至10mm，厚度大約0.1mm。如圖4(b)所示，容器12可以是由底面部分43和側(cè)壁部分44用合成樹脂基體固定件42裝配到一起(參見圖4(c))。
這種情況下，優(yōu)選地容器的底面部分或側(cè)壁部分的至少其中之一，是由基因固定基體上而形成的。
另外，這些容器12可互相連接(盒型)，這樣多個容器可以一次性置入多個凹槽部分11或取出，從而增進操作效率。在固定化DNA文庫的描述中會詳細描述這種盒型容器。
圖5圖示了本發(fā)明的基因擴增裝置的橫截面圖。圖5(a)圖示反應容器10及在反應容器10上面的蓋子部分50。圖5(b)圖示沿圖5(a)中的線C-C的橫截面圖。在圖5中，數(shù)字50，51和52分別表示蓋子部分，加熱/冷卻裝置和冷卻裝置。優(yōu)選地，蓋子部分由化學穩(wěn)定的聚合物材料諸如丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂組成。
加熱/冷卻裝置51是通過與容器12接觸而加熱/冷卻容器12的裝置。優(yōu)選地，加熱/冷卻裝置51是珀耳帖元件，電加熱器，紅外線燈等等。通過直接與容器12接觸，可以直接控制容器12的溫度。將傳統(tǒng)擴增裝置和本發(fā)明的裝置比較，本發(fā)明的溫度控制準確性是卓越的。冷卻裝置52中含有管道，其中有冷卻劑或冷空氣流動，或含有冷卻風扇(fun)從而能夠快速冷卻容器12。
圖6圖示本發(fā)明的基因擴增裝置的溫控單元。在圖6中，容器12的溫度是根據(jù)溫度測量部分61的信息通過加熱/冷卻裝置51的溫度控制部分62和冷卻裝置62的溫度控制部分63來控制的。來自直接與容器12底部或側(cè)壁部分接觸的溫度測量部分61的信號輸入到計算機控制部分64。計算機控制部分64將輸入信號和預先輸入的程序表(溫度增加速度，保持溫度，保持時間，溫度降低速度等等)比較。結果是驅(qū)動了加熱/冷卻裝置51的溫度控制部分62和冷卻裝置52的溫度控制部分63。
實施方案本發(fā)明的實施方案將參考圖7和圖8進行描述。對于容器12，金剛石片41(5mm×5mm，厚度0.1mm)用作金剛石基體。如圖4所示，一個金剛石片用作底面部分，四個金剛石片用作側(cè)壁部分。這些金剛石片與合成樹脂基體固定件42組裝在一起形成容器12。用作側(cè)壁部分的金剛石片41是用有機羧酸化學修飾過的。組裝好容器12后，將蓋子部分50放到反應器主體10的上方。(制備固定化DNA文庫)下面，參照圖7和圖8描述制備固定化DNA文庫的實施例。首先，在mRNA(信使RNA)情況下，將寡dT16-20通過化學酯鍵反應固定到與容器12中的溶液接觸的四個金剛石片41的表面上。在gDNA(基因組DNA)情況下，將含有目的的限制性酶位點的寡核苷酸通過化學酯鍵反應固定到金剛石片41的表面上(參見圖7、圖8)。構成容器12的四個金剛石片41是用有機羧酸化學修飾過的。為了固定化，將寡dT16-20的3’末端和寡核苷酸的5’末端與含有氨基的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)聯(lián)結。在圖7和圖8中，標記“ADC-R-”表示用有機羧酸化學修飾過的金剛石片。
接著，在cDNA(互補DNA)文庫的情況下，從組織和細胞中提取含有mRNA的總RNA溶液，在0℃至4℃的低溫條件下使mRNA與寡dT16-20雜交。雜交后，在37℃至60℃的適當?shù)暮愣囟认峦ㄟ^逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成cDNA。此cDNA反應使用沿固定化寡dT16-20的末端5’端延伸反應而固定化了的。
將合成的固定化cDNA和mRNA的雜交溶液加熱至90℃將mRNA脫雜交。然后，將反應溶液交換成Tris-EDTA(TE)緩沖液。在0℃至4℃的低溫條件下再次用乙醇洗滌反應溶液。結果是，制備了單鏈DNA形式的純化固定化DNA文庫(參看圖7)。
在gDNA文庫情況下，類似寡dT16-20，將含有目的的限制性酶位點的固定化寡核苷酸(參看圖8)固定到金剛石片41的表面。隨后，將化學固定用反應溶液在0℃至4℃的低溫下與含有雜交的寡核苷酸與限制性酶的反應溶液交換。與寡核苷酸雜交后，將反應溶液加熱到37℃以進行半固定化寡核苷酸的限制性酶切割。
限制性酶切割后，再將反應容器在0℃至4℃的低溫冷卻。將反應溶液交換成含有用目的限制性酶片段化了的gDNA和連接酶的反應溶液。再將交換的溶液加熱至37℃以進行連接酶反應。結果是，制備了單鏈DNA形式的gDNA文庫(參看圖8)。
可將制備在金剛石片表面的固定化cDNA文庫或制備在金剛石片表面的固定化gDNA文庫置入不同的容器，以便為了(1)至(3)的目的進行系統(tǒng)比較。(1)比較多種樣本的同種組織和細胞的基因變異。(2)比較同一樣本的各組織和細胞的基因生產(chǎn)和變異。(3)比較同一樣本的原始基因和藥物治療，手術(sergeant)等之后的基因的基因表達變化。
例如，在(1)的情況下，將多種樣品(多種具有固定化DNA文庫的金剛石片)置入不同的容器，以比較同種組織和細胞的基因變異。這些多個容器稱為一個盒。這些盒安裝到反應器主體。如果系統(tǒng)地制備兩個或更多的盒，可以有效地比較多種樣品。
本發(fā)明中，連接了多個容器的一個盒或多個盒作為一個聚集體。在聚集體的每個容器設置了固定化DNA文庫，其定義為盒型固定化DNA文庫。本發(fā)明中，這些盒型固定化DNA文庫用于進行上述目的(1)和(2)的系統(tǒng)比較從而有效搜尋到基因的變異。
即使在使用或未使用PCR方法情況下，通過用TE緩沖液和乙醇溶液(70～75％)充分洗滌容器并將其冷凍和浸入乙醇溶液(100％)中保存，可以依照比較數(shù)據(jù)的要求等等半永久性的使用盒型固定化DNA文庫。(用固定化DNA文庫擴增基因)通過上述固定化cDNA或gDNA的盒型固定化DNA文庫形成容器12的側(cè)壁部分。用TE緩沖液充分洗滌容器12的內(nèi)表面。將容器12的內(nèi)面用TE緩沖液充分清洗后，裝入與要擴增的DNA相關的引物并加入包含四種核苷酸及DNA聚合酶的PCR反應溶液。加入溶液后，將容器12依次將溫度改變?yōu)闊嶙冃詼囟?，用于將雙鏈DNA分為單鏈DNA(95℃，大約1.5分鐘)，變?yōu)橥嘶饻囟?，用于將單鏈DNA與DNA引物連接(45℃，大約1分鐘)，以及變?yōu)镈NA擴增溫度，用于通過耐熱的DNA聚合酶延伸DNA鏈(74℃，大約2分鐘)。將這種溫度控制重復30分鐘以完成PCR方法(參看圖7和圖8)。為了相對短時間內(nèi)一次進行多種樣品的基因診斷，可提供一個系統(tǒng)，其中將用于制備盒型固定化DNA文庫和擴增基因的必需數(shù)目的裝置并列使用。例如，在50個樣品的情況下，可將本發(fā)明的5個擴增基因的裝置并列。
用于工業(yè)領域的機會本發(fā)明的裝置可在反應容器中快速加熱和冷卻反應溶液，這樣可以在相當短的時間內(nèi)擴增DNA。本發(fā)明的裝置適用于自動基因診斷裝置。在開發(fā)自動基因診斷裝置時，最重要的技術問題是制備可以半永久性使用的盒型固定化文庫和開發(fā)對基因擴增而言有卓越效率和特異性的的基因擴增裝置。
由于PCR方法中制備文庫的步驟的溫度控制可通過相同的基體控制，通過提供高效自動盒型固定化DNA文庫和最易于操作和最緊湊大小的基因擴增裝置，可以解決上述兩個問題。
也就是說，依照本發(fā)明的裝置，除了直接控制DNA固定化反應的溫度控制之外，使用金剛石片固定化文庫可以直接控制擴增基因的溫度控制。
依據(jù)本發(fā)明的裝置，PCR反應溶液的溫度控制可通過使用諸如高熱傳導率金剛石基體等基體直接控制，這樣PCR方法的溫度控制效率可以顯著提高并可顯著縮短所需的時間。此外，可以改進PCR效率諸如靶DNA的專一性擴增。
如果本發(fā)明的基體是高熱傳導率的，制備的固定化DNA文庫變得十分穩(wěn)定，因為金剛石基體相對于化學材料/溶液是穩(wěn)定的，耐熱性能是卓越的和輻射所致?lián)p傷小。一旦制備了盒型固定化DNA文庫，就可以提供半永久性的多次重復使用的DNA文庫。
通過利用金剛石基體的高熱傳導率，可將無化學修飾的金剛石基體等小片置入本發(fā)明的擴增裝置，從而進行常規(guī)PCR方法的操作。
權利要求
1．一種用于制備固定化DNA文庫的裝置，包括一個反應器主體，上面形成有用于接受容器的凹進部分，以及一個放在上述反應主體上部的蓋子部分，該蓋子部分包含加熱/冷卻裝置和冷卻裝置，其中所述容器由化學修飾的基體構成。
2．一種用于擴增基因的裝置，包括一個反應器主體，上面形成有用于接受容器的凹進部分，以及一個放在上述反應器主體上部的蓋子部分，該蓋子部分包含加熱/冷卻裝置和冷卻裝置，其中上述容器由化學修飾的基體構成。
3．一種用于擴增基因的裝置，包括一個反應器主體，上面形成有用于接受容器的凹進部分，以及一個放在上述反應主體上部的蓋子部分，該蓋子部分包含加熱/冷卻裝置和冷卻裝置，其中上述容器由固定了基因的基體構成。
4．一種權利要求1至3任一的裝置，其中上述基體是固相基體。
5．一種權利要求1至4任一的裝置，其中上述容器是分解型的。
6．一種權利要求1至5任一的裝置，其中上述容器是盒型的。
7．一種基因擴增裝置的溫度控制方法，其中在權利要求1至6任一的裝置中，將來自溫度測量部分61的信號輸入計算機控制部分64，計算機控制部分61將輸入信號和預先輸入的程序表比較，然后驅(qū)動加熱/冷卻裝置51的溫度控制部分62和冷卻裝置52的溫度控制部分63。
8．一種權利要求1至6任一的裝置使用的固定化了DNA的基體。
9．一種用于將固定化了DNA的基體冷凍保存的方法。
10．一種通過將多種DNA固定化文庫置入容器進行基因的系統(tǒng)比較的方法。
全文摘要
一種基因擴增的方法和裝置,其可用于迅速地進行加熱和冷卻并相應地在短時間內(nèi)進行熱循環(huán),并且也易于操作;一種制備適用于此裝置的固定化的DNA文文庫的方法;以及系統(tǒng)地比較基因的方法。本發(fā)明的用于制備固定化DNA文庫的裝置包含一個反應器主體(10),上面有凹進部分可以放置容器,一個蓋子部分(50)放在上述反應器主體上方,以及由用于固定化DNA的基體(41)構成的容器(12),其中該蓋子部分(50)包含一個加熱和冷卻裝置(51)和一個冷卻裝置(52)。在該裝置中,計算機控制部分(64)將來自溫度測量部分(61)的和程序表比較,且該計算機控制部分驅(qū)動加熱/冷卻(51)裝置的溫度控制部分(62)和冷卻裝置(52)的溫度控制部分(63)。而且將多種DNA文庫置入容器從而進行基因的系統(tǒng)比較。
文檔編號B01L3/00GK1295613SQ99804667
公開日2001年5月16日 申請日期1999年2月8日 優(yōu)先權日1998年2月10日
發(fā)明者高橋浩二郎, 丹花通文 申請人:東洋鋼鈑株式會社