專利名稱：利用rna干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，屬于生物醫(yī) 藥技術領域。
背景技術：
腫瘤治療的手段主要分為手術切除、化療、放療和其他方法。腫瘤化療，即用化學藥物 進行腫瘤的治療。近年來在腫瘤治療中發(fā)展最快的是化療，它己成為當今臨床治療腫瘤的最 重要手段之一，屬于腫瘤的全身治療方法。隨著化學藥物種類的逐漸增多，用藥方法的不斷 改進，臨床經(jīng)驗的不斷積累，其療效日益提高，化療已從以前的姑息性治療向根治性治療階 段過渡。
化療的原理是利用通過化學方法合成或從其他物質(zhì)中提取出來的藥物作用在細胞生長繁 殖的不同環(huán)節(jié)上，抑制或殺滅腫瘤細胞，從而達到治療的目的?；熜Ч麤Q定于腫瘤細胞對 化療藥物的敏感性。這一敏感性是腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性和敏感性的綜合，并決定于 腫瘤細胞的耐藥基因和敏感基因。
腫瘤細胞的耐藥性限制了腫瘤化療的使用和療效，因而人們試圖通過確定腫瘤耐藥基因， 并據(jù)此選擇化療藥物、制定化療方案，從而改善化療的效果。多年來，利用各種基因過表達 手段，人們找到了一些藥物耐受基因，如多藥耐藥基因蛋白、肺耐藥相關蛋白、拓撲異構(gòu)酶 II、谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶等。遺憾的是，由于腫瘤細胞的耐藥性表現(xiàn)為多藥耐藥，即指腫瘤細 胞接觸一種化療藥物后產(chǎn)生針對這種藥物，和對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機制相同和不同的化療 藥物亦產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象。這樣一來，即使找到了腫瘤的耐藥基因，確定了腫瘤的多藥耐藥性 也很難找到有效的化療方案，達到改善化療的目的，使得多年來腫瘤的治療沒有大的改觀。
在這種情況下，我們試圖從腫瘤細胞的藥物敏感性著手改善腫瘤化療的效果。不過，篩 選藥物敏感性需要通過降低藥物敏感基因表達來實現(xiàn)。由于沒有可靠的降低表達手段，長期 以來只確定了有限的藥物敏感基因，使得對藥物敏感基因的研究、開發(fā)、利用無法進行，腫 瘤化療的效果受到了極大的限制。
最近，美國科學家安德魯 法爾和克雷格 梅洛1998年發(fā)現(xiàn)了 RNA干擾機制，2006年他 們倆分享了諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。 一項全新的技術在提出后短短幾年就得到諾貝爾獎的肯定，足見RNA干擾在醫(yī)學領域的開創(chuàng)性意義和極大的應用前景。這一可以使得基因在體降低
表達的機制，也為尋找藥物敏感基因提供了條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，而提供一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化 療藥物敏感基因的方法。它從腫瘤細胞的藥物敏感性著手，利用RNA干擾文庫使得人類基因 組的各種基因分別在個體細胞任意地降低表達，在藥物敏感基因降低表達的細胞，藥物的敏 感性降低，受化療藥物處理后更容易存活下來，通過克隆可以確定存活細胞內(nèi)的藥物敏感基 因。
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來完成的，該方法是利用降低基因表達的RNA干擾 文庫，對腫瘤細胞的藥物敏感基因表達進行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受 性升高，從而在高濃度藥物處理條件下存活下來，并形成細胞克隆，通過基因克隆找到并篩 選到藥物敏感基因。
本發(fā)明從存活下來的細胞內(nèi)提取基因組DNA， PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片 段，用TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測序確定篩選基 因。
本發(fā)明在篩選基因后進一步分析對藥物敏感性的影響，它們是
a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of function分析；
b. 利用過表達作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實驗分析篩選基因影響藥物敏感性的機制。
本發(fā)明在篩選基因后，分析其在腫瘤中對藥物敏感性的影響等狀況，它們是
a. 檢測篩選基因是否在腫瘤中過表達；
b. 檢測篩選基因是否在腫瘤中低表達；
c. 檢測篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。
本發(fā)明是通過利用人類基因組的RNA干擾文庫，結(jié)合藥物敏感基因的作用原理發(fā)明了一 種藥物敏感基因篩選的新技術，并率先進行了肝癌細胞的藥物敏感基因篩選，世界上首次確 定了一批真正的藥物敏感基因。
本發(fā)明從基因組水平篩選腫瘤細胞藥物敏感基因，并用于
4(1) 指導腫瘤化療的藥物選擇當針對某一藥物的敏感基因表達正常時，推薦選用該藥物； 當針對某一藥物的敏感基因降低表達或發(fā)生突變時，避免選用該藥物。
(2) 開發(fā)應用此類基因作為腫瘤的生物標志，在診斷之前，用于風險評估和發(fā)病普查；在診 斷時，用于腫瘤的分類和定級；在診斷之后，用于評估治療效果和檢測復發(fā)。
具體實施例方式
本發(fā)明從腫瘤細胞的藥物敏感性著手，利用RNA干擾文庫使得人類基因組的各種基因分 別在個體細胞任意地降低表達，這樣，在藥物耐受基因降低表達的細胞，藥物的耐受性降低， 受化療藥物處理后更容易被殺死、清除，因而不能找到藥物耐受基因；相反，在藥物敏感基 因降低表達的細胞，藥物的敏感性降低，受化療藥物處理后更容易存活下來，通過克隆可以 確定存活細胞內(nèi)的藥物敏感基因。
本發(fā)明的主要構(gòu)思是由于存在多藥耐藥性，部分細胞可以在臨床使用高濃度的抗癌藥 物作用下存活下來。不過，當藥物濃度升高到一定程度時，所有的細胞將被殺死。經(jīng)過RNA 干擾文庫處理后，由于一些細胞內(nèi)的藥物敏感基因表達被降低，使得它們的藥物敏感性減弱， 藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理條件下存活下來，并形成細胞克隆。通過基因克隆 可找到藥物敏感基因。
本發(fā)明的主要特征是
A、 與過去從腫瘤藥物耐受性著手不同，反向從腫瘤藥物敏感性著手；
B、 與過去篩選藥物耐受基因不同，反向篩選藥物敏感基因；
C、 與過去利用過表達文庫不同，反向利用降低基因表達的RNA干擾文庫。 本發(fā)明采用的主要技術方案是
A、 表型篩選
a. 在低濃度時，對照和RNA文庫處理細胞都存活下來，但RNA文庫處理細胞存活下來更多；
b. 在中等濃度時，對照和RNA文庫處理細胞都形成克隆，但RNA文庫處理細胞形成克隆更 多；
c. 在一定濃度時，只有RNA文庫處理細胞存活下來并形成克隆；
d. 在更高濃度時，RNA文庫處理細胞和對照細胞都沒有細胞存活下來。
B、 候選基因鑒定
a.從存活下來的細胞內(nèi)提取基因組DNA;b. PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測序確定篩選基因。
C、 分析篩選基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊?br> a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of function分析；
b. 利用過表達作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實驗分析篩選基因影響藥物敏感性的機制。
D、 分析篩選基因在腫瘤中的狀況(對藥物敏感性的影響)
a. 檢測篩選基因是否在腫瘤中過表達；
b. 檢測篩選基因是否在腫瘤中低表達；
c. 檢測篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。 實施例1
利用本發(fā)明技術，我們已經(jīng)進行了肝癌細胞(H印G2， A謂:HB-8065)的阿霉素和順 鉑的敏感基因的篩選，并分別篩選到了肝癌細胞的31種阿霉素敏感基因和23種順鉑敏感基 因(另外申請產(chǎn)品專利)。以篩選肝癌細胞的阿霉素敏感基因為例介紹
具體實施例方式
一、利用RNA干擾文庫DNA轉(zhuǎn)染菲尼克思(Phoenix)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞 第一天準備菲尼克思反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞
1、 轉(zhuǎn)染之前18-24小時，按3x10710厘米平板接種菲尼克思細胞到平板上；
2、 讓細胞貼壁10-24小時；
3、 當細胞密度達到2/3時， 一個10厘米平板大約有5xl()6細胞。這時的包裝細胞最容易轉(zhuǎn)染 并產(chǎn)生最高滴度的病毒37°C;
*培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。 第二天轉(zhuǎn)染
1、 準備好轉(zhuǎn)染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；
2、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的儲藏濃度為50毫摩)；
*氯喹通過中和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運微泡內(nèi)的pH而抑制溶酶體內(nèi)的DNA酶；3、 在一個15毫升的試管內(nèi)，加入(以10厘米平板為例、室溫條件)
20微克文庫DNA和20微克輔助質(zhì)粒DNA; 62.5微升2摩爾的氯化鈣(手指輕彈混勻)； 加無菌雙蒸水至500微升總體積。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES緩沖液，然后利用全自動移液槍激烈吹氣泡5-15秒；
5、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，給包裝細胞換已預熱至、含終濃度25微摩氯喹的培養(yǎng)液9毫升；
6、 20分鐘之后，將HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在顯微鏡下觀察，應該看到一些大小均一、分布均勻的細小黑色顆粒； *將平板放入37"C孵箱，前后左右輕輕轉(zhuǎn)動平板使DNA/CaP04顆粒均勻分布； * HEPES購于Sigma (商品目錄號:H-7006) *氯化鈣購于Mallinkrodt (商品目錄號H-4160)
*由于pH非常重要，可分別配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的緩沖液進行測試； *使用之前將所有的試劑復蘇到室溫。 第三天轉(zhuǎn)染后24小時，換液、準備好感染細胞
1、 轉(zhuǎn)染后24小時，給包裝細胞換預熱至37°C的培養(yǎng)液10毫升(不要讓氯喹在培養(yǎng)液中影響 細胞超過24小時)；
2、 將感染靶細胞分盤，細胞密度為2x10710厘米平板，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1% 青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
第四天轉(zhuǎn)染后24小時，用含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染靶細胞
1、 用移液槍從轉(zhuǎn)染后的包裝細胞中吸取上清并置于15毫升的試管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘以除去細胞碎片；
2、 用0.45微米濾膜過濾；
3、 從耙細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸除2毫升培養(yǎng)液；
4、 在靶細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入5微升polybrene(polybrene的1000倍儲藏濃度為5毫克/毫升)， 混勻；
5、 在靶細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入2毫升含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，置于32-37。C，輕輕混勻；6、每隔4-6小時進行重復感染。 第五天吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清
感染后24小時吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，加入新鮮的培養(yǎng)基DMEM, 10%胎牛血清，1%青 -鏈霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍儲藏濃度為5毫克/ 毫升)篩選24小時。
二、 處理(表型篩選)
第六天感染后48小時(puromycin作用24小時)，靶細胞可用于各種處理，進行表型篩選。
1、 將感染靶細胞分盤，培養(yǎng)液為DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
2、 分盤后12小時，以不同濃度加入不同藥物處理。
三、 挑細胞克隆
2周后，存活細胞形成了細胞克隆
1、 吸除細胞上清，加入無菌PBS洗一遍并吸除PBS;
2、 用消毒無菌的槍頭挑取單個細胞克隆，置于含100微升1毫摩EDTA/0. 25%胰酶的48孔平 板內(nèi)；
3、 37。C消化5分鐘；
4、 加入200微升培養(yǎng)基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺，200微克/毫升 puromycin)反復吹打；
5、 24小時后，換新鮮培養(yǎng)基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺，200微克/ 毫升puromycin);
6、 將增殖細胞逐漸轉(zhuǎn)到體積大的平板上生長；
7、 待細胞擴增到足夠時，冷凍保存細胞克?。煌瑫r收集細胞用于提取基因組DNA。
四、 基因鑒定
1、 利用Roche生產(chǎn)的High Pure PCR Template Preparation試劑盒(商品目錄號 11796828001)從收集的細胞中提取基因組DNA;
2、 以基因組DNA為模板，通過PCR擴增插入細胞基因組DNA的RNA干擾文庫特異片段 (1)擴增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at_3， (20bp)RNAi clone 2: 5， _gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg卿tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反應體系
H20 13. 0 |xl
10xPCR Buffer 2. 5 pi
25mM MgCl2 2. 0 pi
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
10nM primer F2. 0 pi
lO(iM Primer R 2. 0 |xl
Taq 0.5 pi
Template 1. 0 pi
Total 25.0 pi
(3) PCR反應條件
1. 940C 3:00
2. 94。C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 720C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72。C 4:00
7. 4QC forever
(4) PCR反應結(jié)果在0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，觀察一0.6 kb條帶。
3、 利用Invitrogen Life Technologies生產(chǎn)的T0P0 TA克隆試劑盒(商品目錄號 K4600-01)將PCR擴增的插入細胞基因組DNA的RNA干擾文庫特異片段克隆；
4、 挑選得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB內(nèi)，37T振蕩培養(yǎng)16小時；
用Sigma-Aldrich生產(chǎn)的GeneElutePlasmidMinipr印試劑盒(商品目錄號:PLN350)提取 質(zhì)粒；
5、 將質(zhì)粒送測序公司測序，測序引物為反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)確定基 因；對候選基因作生物信息學分析，了解基因的基本情況及其已知的功能。
931種阿霉素敏感基因被鑒定出來，在此僅給出其中三種基因為例-
(1) CDK10: shRNA片段為 ATCAGCTCCACGATGTTCGGATGACGCAGGTTGGCTTGCGTTATCCGGACATCGTGGAGTTGA;
(2) GP5: shRNA片段為 CTCCAGAAACACCACCTTATCCAGCAACGCCAACGCTGCTGGATAAGATGGTGCTCCTGGAG;
(3) INTS12: shRNA片段為 GATGTTGCCAGACCAGTCAAACCCACAGGTTGGCTTGTGGGTTTGATTGGTCTGGTAATATC。
其中CDK10已在最近被證實與乳腺癌細胞對他莫西芬的敏感性相關(Iorns et al. 2008. Identification of CDK10 as an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Cancer Cell, 13(2): 83-85 )。 五、藥物敏感基因?qū)λ幬锩舾行缘蔫b定
1、 分別構(gòu)建藥物敏感基因的基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA干擾和過表達質(zhì)粒；
2、 利用RNA文庫同樣的技術和步驟分別建立穩(wěn)定RNA干擾和過表達細胞；
3、 檢測各細胞的藥物敏感性-(1)半抑制率(IC50)檢測
a. 將肝癌細胞按畫個/100微升/孔接種到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小時，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置換帶有0、 5、 10、 15、 20、 30納摩阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)三天，設置三復孔；
c. 置換50微升/孔帶有MTT (3毫克/毫升)、不含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37°C， 5%C02培 養(yǎng)4小時；
d. 吸除培養(yǎng)液，按50微升/孔加入二甲基亞砜(DMS0)，搖床搖動10分鐘；
e. 利用分光光度計讀取波長570納米的吸光度；
f. 記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線；
g. 以阿霉素的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50%抑制率時候的藥品濃度， 就是IC50 (抑制率=1-加藥組0D值/對照組0D值)。
注意事項
a. 選擇適當?shù)眉毎臃N濃度；
b. 避免血清干擾 一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液；
c. 設空白對照與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后 比色以空白調(diào)零；
d. 保持MTT實驗吸光度值最后要在0-0. 7之間這一線性關系范圍。
(2) 相對細胞生長速度檢測
a. 將肝癌細胞按1000個/100微升/孔接種到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小時，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置換帶有0、 5、 10、 15、 20、 30納摩阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，設置三復孔；
c. 利用細胞計數(shù)器每天計數(shù)細胞的總數(shù)；
d. 計算處理組對未處理組的細胞數(shù)的百分比。比較實驗組和對照組的差別。
(3) 細胞克隆形成檢測
a. 將1.2X低熔點瓊脂糖與2X細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0. 6%的底層瓊脂，6孔 板中每個孔1.2ml溫室凝固；
b. 取對數(shù)期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細胞濃度為10000個/ml;
c. 將0.6%低熔點瓊脂糖與2X細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂， 按100/lml上層瓊脂和lOOjil單細胞懸液/孔(1000個/孔)，混勻，室溫凝固；
d. 置于37。C, 5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 — 3周；
e. 計數(shù)含50個細胞以上的克隆，計算細胞克隆形成率。
六、實驗材料和儀器
1、 各種實驗室常規(guī)儀器；
2、 細胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific, Inc.,美國)；
3、 超凈工作臺(Forma Scientific, Inc.,美國);
4、 分光光度計(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美國)；
5、 Zl-顆粒計數(shù)器(BECKMAN COULTER,美國)；
6、 倒置顯微鏡(尼康，日本)；
7、 PCR儀(Bio-Rad,美國)。
權利要求
1、一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，該方法是利用降低基因表達的RNA干擾文庫，對腫瘤細胞的藥物敏感基因表達進行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理條件下存活下來，并形成細胞克隆，通過基因克隆找到并篩選藥物敏感基因。
2、 所述的從存活下來的細胞內(nèi)提取基因組DNA， PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA 片段，用TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測序確定篩選 基因。
3、 根據(jù)權利要求2所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，其特征 在于在篩選基因后進一步分析對藥物敏感性的影響，它們是a. 利用RNA干擾降低基因表達作Loss-of function分析；b. 利用過表達作Gain-of-function分析；c. 利用生化實驗分析篩選基因影響藥物敏感性的機制。
4、 根據(jù)權利要求2所述的利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，其特征 在于在篩選基因后，分析它們在腫瘤中對藥物敏感性的影響等狀況，它們是a. 檢測篩選基因是否在腫瘤中過表達；b. 檢測篩選基因是否在腫瘤中低表達；c. 檢測篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。
全文摘要
一種利用RNA干擾文庫篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，該方法是利用降低基因表達的RNA干擾文庫，對腫瘤細胞的藥物敏感基因表達進行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理條件下存活下來，并形成細胞克隆，通過基因克隆找到并篩選藥物敏感基因；本發(fā)明從存活下來的細胞內(nèi)提取基因組DNA，PCR擴增從RNA干擾文庫中插入的DNA片段，用TA克隆法克隆PCR擴增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測序確定篩選基因；本發(fā)明率先進行了肝癌細胞的藥物敏感基因篩選，世界上首次確定了一批真正的藥物敏感基因，并用于(1)指導腫瘤化療的藥物選擇當針對某一藥物的敏感基因表達正常時，推薦選用該藥物；當針對某一藥物的敏感基因降低表達或發(fā)生突變時，避免選用該藥物，(2)開發(fā)應用此類基因作為腫瘤的生物標志，在診斷之前，用于風險評估和發(fā)病普查；在診斷時，用于腫瘤的分類和定級；在診斷之后，用于評估治療效果和檢測復發(fā)。
文檔編號C12Q1/68GK101429544SQ20081016340
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者黃行許 申請人:黃行許