構(gòu)建dna文庫(kù)的試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種構(gòu)建DNA文庫(kù)的試劑盒 和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)在通用的小片段DNA文庫(kù)構(gòu)建方法主要是采用肥B的建庫(kù)試劑盒，如NEBN設(shè)t? 叫tra?或者DNA Library Pr邱Kit for Illumina等，運(yùn)些試劑盒基本上適用于所有的小 片段（180bp~5(K)bp)文庫(kù)的構(gòu)建，包括不同物種、不同質(zhì)量或者不同的片段類型的樣本。且 所構(gòu)建的文庫(kù)廣泛應(yīng)用于從頭測(cè)序(denovo sequencing)或重測(cè)序(resequencing)等。
[0003] 上述試劑盒構(gòu)建文庫(kù)的主要流程如下：SI:對(duì)基因組進(jìn)行片段化;S2:片段化DNA的 末端不是平末端，因此要對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)平(20°C30min)，補(bǔ)平后進(jìn)行加 A(65°C30min); S3:采用 TA連接的方式加上一段固定的序列即U字型接頭(20°C15min)，加入U(xiǎn)SER酶將U字型接頭打 開(kāi)(37°C 15min); S4:用AMPure XP磁珠進(jìn)行片段選擇，獲得所需的加完接頭的目的片段;S5: 目的片段進(jìn)行PCR富集，PCR循環(huán)數(shù)可W根據(jù)模板量進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般6-15個(gè)循環(huán);S6:最后用 AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物后即可出庫(kù)。
[0004] 但是，現(xiàn)有的NEB建庫(kù)試劑盒在構(gòu)建文庫(kù)時(shí)存在下幾個(gè)方面的缺點(diǎn)：（1)建庫(kù)成本 較高:成品試劑盒價(jià)格一般比較貴，單次單一樣本的建庫(kù)成本在200元W上；（2)擴(kuò)增效率比 較低:尤其是樣本量比較低的樣本，無(wú)法進(jìn)行成功出庫(kù)；（3)純化步驟易出錯(cuò):NEB的建庫(kù)流 程在進(jìn)行片段選擇的時(shí)候通常經(jīng)過(guò)2步磁珠純化(分別去大片段和去小片段的方式），第1步 純化是留上清溶液去掉吸附在磁珠上的大片段，第2步是去上清去掉小片段，2步磁珠純化 的不同操作容易混淆；（4)磁珠純化的選擇性較差:磁珠選擇的片段較寬，過(guò)寬的片段中會(huì) 有較大的片段，較大的片段在后續(xù)的PCR和簇生成的過(guò)程中處于劣勢(shì)地位，最后可能導(dǎo)致數(shù) 據(jù)產(chǎn)出不足；（5)實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)繁瑣:肥的式劑盒中的接頭是U型接頭，在加完接頭后會(huì)增加 一步添加 US邸酶將U型接頭變?yōu)閅型接頭的過(guò)程才可進(jìn)行后續(xù)的PCR富集，實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)繁 瑣。
[000引因此，即使現(xiàn)有的試劑盒在構(gòu)建文庫(kù)方面有諸多優(yōu)勢(shì)，但仍具有上述諸多缺陷，因 而仍舊難W滿足市場(chǎng)上對(duì)DNA文庫(kù)構(gòu)建多樣化的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種構(gòu)建DNA文庫(kù)的試劑盒和方法，W解決現(xiàn)有技術(shù) 中的試劑盒擴(kuò)增效率較低的問(wèn)題。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種構(gòu)建DNA文庫(kù)的試劑盒， 該試劑盒包括:酶試劑，酶試劑包括第一酶混液、T4 DNA連接酶W及第二酶混液，第一酶混 液由T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段^及巧曰9酶混合而成；第二酶混液為2X KAPA化Fi化*5*3的預(yù)混液；緩沖液，緩沖液包括第一酶混液所對(duì)應(yīng)的第一緩沖液和T4 DNA連接酶所對(duì)應(yīng)的第二緩沖液，第一緩沖液由IOX T4 DNA連接酶緩沖液、dNTP混合液W及 ATP混合而成;第二緩沖液由ATP、化is-HCl、MgCl2、陽(yáng)G8000、Tween20W及二硫蘇糖醇混合 而成；W及接頭組合，接頭組合包括接頭序列組和標(biāo)簽序列組。
[000引進(jìn)一步地，第一酶混液中，T4多聚核酸激酶的工作濃度為0.05~0.2UAiL，T4 DNA 聚合酶的工作濃度為0.02~0.04U/化，Klenow片段的工作濃度為0.0 l~0.0311/化，巧aq酶 的工作濃度為0.02~0.0411/化。
[0009] 進(jìn)一步地，第一緩沖液中，IOX T4 DNA連接酶緩沖液的工作濃度為0.8X~2X，dNTP 混合液的工作濃度0.3~0.6mM; ATP的工作濃度為1.5~2.2mM。
[0010] 進(jìn)一步地，第二緩沖液中，ATP的工作濃度為1.5~3mM，Tris-HCl的工作濃度為 0.04~0.08M，MgCl2的工作濃度為0.01~0.03M，PEG8000的工作濃度為5%~10wt%，Tween 20的工作濃度為Iv%~4v%，二硫蘇糖醇的工作濃度為0.0 Ol~0.003M。
[0011] 進(jìn)一步地，T4 DNA連接酶的工作濃度為200~SOOUAiL ;2X KAPA HiFi HotStart預(yù) 混液的工作濃度為IX。
[0012] 進(jìn)一步地，接頭組合形成Y型接頭;優(yōu)選接頭序列組由第一接頭序列和第二接頭序 列按照等摩爾比混合而成，標(biāo)簽序列組由標(biāo)簽序列與通用引物按照等摩爾比混合而成。
[0013] 進(jìn)一步地，第一接頭序列為SEQ ID N0:1所示的
,第二接頭序列為：SEQ ID N0:2所示的 N0:1和沈QIDN0:2中的N為A、T、C或G中的 任何一種;標(biāo)簽序列包括SEQ ID NO:3所示的第一標(biāo)簽序列、SEQ ID NO:4所示的第二標(biāo)簽 序、SEQ ID N0:5所示的第S標(biāo)簽序列、SEQ ID N0:6所示的第四標(biāo)簽序列、SEQ ID N0:7所 示的第五標(biāo)簽序列、SEQ ID NO:8所示的第六標(biāo)簽序列、SEQ ID NO:9所示的第屯標(biāo)簽序列、 SEQ ID NO: 10所示的第八標(biāo)簽序列、SEQ ID NO: 11所示的第九標(biāo)簽序列W及SEQ ID NO: 12 所示的第十標(biāo)簽序列;通用引物為SEQ ID N0:13所示的序列。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種上述任一種試劑盒構(gòu)建 DNA文庫(kù)的方法，該方法包括:對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行片段化，得到DNA片段;利用第一酶混 液和第一緩沖液對(duì)DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)及加 A，得到修復(fù)片段;利用T4 DNA連接酶、第二緩 沖液W及接頭引物組對(duì)修復(fù)片段進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭片段;利用第二酶混液和標(biāo)簽 序列組對(duì)帶接頭片段進(jìn)行PCR富集，得到DNA文庫(kù)。
[0015] 進(jìn)一步地，在得到帶接頭片段的步驟后，W及在對(duì)帶接頭片段進(jìn)行PCR富集之前， 方法還包括對(duì)帶接頭片段進(jìn)行純化的步驟。
[0016] 進(jìn)一步地，純化的步驟包括依次進(jìn)行磁珠純化和電泳純化的步驟。
[0017] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)選擇市售的T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow 片段并混合成第一酶混液，然后與市售的IOX T4 DNA連接酶緩沖液、dNTP混合液W及ATP混 合而成的第一緩沖液配合使用，不僅同樣能夠?qū)崿F(xiàn)片段化DNA的末端修復(fù)和加 A，而且降低 構(gòu)建成本。而采用市售的T4 DNA連接酶及由上述試劑組成的第二緩沖液對(duì)修復(fù)后的DNAW 及接頭進(jìn)行接頭連接，能夠提高接頭連接效率。最后，利用2X KAPA化Fi化tStad預(yù)混液 對(duì)連上接頭的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增富集，擴(kuò)增效率高。因而，采用本發(fā)明的上述試劑盒，不僅能夠 降低文庫(kù)構(gòu)建成本，而且能提高擴(kuò)增效率。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0019] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中DNA文庫(kù)構(gòu)建流程圖；
[0020] 圖2示出了本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中所構(gòu)建的DNA文庫(kù)的檢測(cè)結(jié)果圖；W及
[0021] 圖3示出了本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中所構(gòu)建的另一 DNA文庫(kù)的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可W相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0023] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述的各種市售試劑不包括現(xiàn)有市場(chǎng)上用于文庫(kù)構(gòu)建的整 套試劑盒或者試劑盒中的某種單一試劑，而是指W單獨(dú)形式售賣的試劑。
[0024] 本發(fā)明中，M為摩爾濃度mol/L的簡(jiǎn)寫，mM為摩爾濃度mmol/L的簡(jiǎn)寫，JiM為摩爾濃度 皿ol/L的簡(jiǎn)寫。
[002引 IOX T4 DNA連接酶緩沖液是700mm Tris-肥KP冊(cè).0)，IOOmm MgC12和50mm DTT; 其中，工作濃度IX的意思是：70mM Tris-肥1 (P冊(cè).0)，IOmM MgCl巧化mMDTT;0.5X的工作濃 度的意思是：35mM Tris-HCKP冊(cè).0)，5mM MgC12和2.5mM DTT。由于在進(jìn)行試劑配置時(shí)，用 的是商業(yè)化的IOX T4 DNA連接酶緩沖液，因此，在后面的用到的試劑中提及的就是IOX T4 DNA連接酶緩沖液。
[0026] 2X KAPA化Fi化預(yù)