一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法，該方法通過利用特定的功能菌群將培養(yǎng)液或廢水中含有的乳酸生物合成己酸，所述方法以乳酸為電子供體生產(chǎn)己酸較以乙醇為電子供體生產(chǎn)己酸效率提高效率20％以上，且本發(fā)明所述己酸功能菌對代謝產(chǎn)物(己酸)的毒性耐受濃度較已報道的產(chǎn)己酸菌提高2倍以上，具有轉(zhuǎn)化效率高、抗逆性強的特點。以乳酸這種易得的非燃料物質(zhì)轉(zhuǎn)化為己酸，轉(zhuǎn)化效率高，具有工業(yè)實用性。
【專利說明】一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境生物工程與發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生產(chǎn)己酸的方法，特別是通過微生物催化乳酸合成己酸的方法。
技術(shù)背景
[0002]己酸匕-⑶即此仏)為含有六個碳原子的中鏈脂肪酸((^-00?)，疏水性強，能量密度高，是一種重要的化工原料，可直接用于動物飼料、綠色抗菌劑和緩蝕劑生產(chǎn)。其酯類產(chǎn)品廣泛應用于食品香料、樹脂、橡膠、制藥等工業(yè)。此外，己酸是生物燃料的合成前體，可以通過有機化學的方法間接轉(zhuǎn)化為生物柴油或噴氣燃料。
[0003]已酸的生產(chǎn)方法可分為化學合成、天然產(chǎn)物(如椰子油等)提取和微生物催化三種。己酸的商業(yè)化生產(chǎn)主要是基于石油為原料的化學合成。受石油資源日益短缺和環(huán)保要求不斷提高的影響，這一方法將遇到挑戰(zhàn)；此外，隨著己酸及其衍生物應用領(lǐng)域的擴大，石油來源的己酸產(chǎn)品的應用受到了越來越多的限制，特別是在食品和醫(yī)藥等健康領(lǐng)域。天然產(chǎn)物提取的己酸更加健康和安全，但是卻受到原料、地域等諸多因素的限制，因而難以推廣。相比于前兩種方法，微生物催化合成己酸，采用的是安全的可再生資源作為原料，其產(chǎn)品也不存在應用領(lǐng)域的限制，生產(chǎn)過程也不受原料來源等地域限制，因而具有更好的價值和可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)化潛力。
[0004]微生物催化產(chǎn)己酸是一個碳鏈延長過程，即微生物通過13氧化的逆反應途徑對短鏈脂肪酸進行碳鏈延長，合成中鏈脂肪酸(仏一(^)。自然界中只有極少數(shù)微生物具有碳鏈延長功能，主要為梭菌屬和真桿菌屬)的一些種。研究最多和最為深入的是克氏梭菌“八^一!'丨)，該菌通過乙醇氧化和逆13氧化途徑的結(jié)合，以乙醇為電子供體，乙酸為電子受體合成己酸(1116 8711^6818 0？011&II(1 08^010 ^01(18 ？1~0111311(1 ^061:10 ^01(1 67 01081^1(1111111
？1~00耐1 ^08(1 801 口 3八.1945060 ；31 (12): 373 - 381.)。其代謝過程可概括為三個偶聯(lián)反應，乙醇氧化為乙酸，乙酸與乙醇結(jié)合形成丁酸，最后丁酸與乙醇結(jié)合形成己酸。雖然微生物催化生產(chǎn)己酸是一種清潔能源技術(shù)，但是卻存在兩個重要的限制因素:
[0005]1、底物單一化，選擇性差?，F(xiàn)在已報道的最為合適的底物(電子供體)是乙醇，在合成過程中需要外加乙醇，因而適用范圍有限，并且增加了合成成本。氫氣理論上也可以作為電子供體，但是由于氫氣的安全性以及低溶解度不利于己酸合成，并且氫氣本身價格較高，所以此類研究甚少；雖然也有少數(shù)的細菌，如618(161111181和(:108廿丨也皿鄧.83-1，可以通過葡萄糖或者半乳糖醇的發(fā)酵合成己酸，但是由于細菌發(fā)酵產(chǎn)物復雜以及代謝途徑未知而不具備工業(yè)化應用的前景(16111161 &10611
6.011811^1^8^1^6 811817515 0？盡!'0界七匕 3,11(1 乂〇1&七 1163,01(1 ^1*0(1110^1011 67
七 116 811861*01310 1*1111111181 1380^61*111111 16^85^) 11861*8 615(161111 丁81.八口口1 1101*013101
010^60111101.2013, 97: 4075 - 4081^00111(1111&^01111^50011
1)111&8701111^-1110？ 116X811010 3,01(1 ^1*0111 1)-^8180^1^01 67 & 116 界 1丫1801^1:6(1 01081:1-1(1111111 鄧.83-1 八卯 1 1101~013101 0101:60111101.2010, 88: 1161 - 1167) 0
[0006]2、終產(chǎn)物的抑制效應使己酸濃度的提高存在困難。由于己酸對微生物具有較大的毒性，濃度較高時會抑制微生物的生長和活性。尤其是當環(huán)境邱接近或者低于己酸的解離常數(shù)(1)1(3 = 4.8)時，溶液中未解離己酸及其生物毒性會大幅提高。由于己酸的抑制作用，在合成過程中己酸濃度達到一定水平(已報道的最高濃度為12.6^/1)就難以繼續(xù)提高。這就增加了后期的提取成本，不利于微生物催化合成己酸技術(shù)的工業(yè)化應用。
[0007]3、厭氧產(chǎn)甲烷會造成底物分流和降低氫分壓，使產(chǎn)己酸效率下降。加入抑制劑可抑制甲烷產(chǎn)生，但價格昂貴，不適于工業(yè)化應用。
[0008]乳酸是淀粉質(zhì)發(fā)酵的主要產(chǎn)品之一。目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工業(yè)技術(shù)已比較成熟，已實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化乳酸生產(chǎn)。今后更為廉價的植物纖維水解物等有可能作為生產(chǎn)乳酸的新原料，有望使其生物成本進一步降低。研究顯示微生物可催化乳酸合成丁酸￡, ￡11:6111811 嫩.811(1 狀!'118111137 11861'& 618(161111 1111(161- 1381x11 811(1 81:68(178^^^60011(111:10118.1101-0)3101 2012，78:8564-8570 ；1111102-丁8腦70 I？； 1&1-00116 8,￡, 61: &1.1(11161:101110(1611111? 0？ 1^01:81:6 111:111281:1011 811 (1)31^6 ￠1^0(11101:1011 1^7 垃 67 1111111^11 0010111013801:61-181 8^60168.110^013101 2011，76:615-624)，表明乳酸可為碳鏈延長提供電子供體。但是，還未見利用乳酸合成己酸的相關(guān)文獻和專利報道。
[0009]基于化學合成法原料的日益稀缺和產(chǎn)品限制，以及生物來源的己酸所具有的優(yōu)勢，有必要發(fā)展利用可再生能源生產(chǎn)己酸的方法，來補充或替代現(xiàn)有化學合成方法。此外，本發(fā)明的微生物法還可利用發(fā)酵廢水中的廢棄有機酸(如乳酸、乙酸和丁酸)生產(chǎn)己酸，從而實現(xiàn)廢水的資源化，具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?br>

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種微生物催化乳酸合成己酸的方法。本發(fā)明所涉及的方法是以乳酸為電子供體，通過己酸功能菌群在厭氧條件下，乙酸或者丁酸為電子受體，通過碳鏈延長合成己酸。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
[0012]一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0013]步驟一、將己酸功能菌群接種到含有液體培養(yǎng)基的厭氧發(fā)酵瓶中，25-351厭氧培養(yǎng)3-5(1，得到006。。為3-5的菌懸液；
[0014]步驟二、將上述菌懸液轉(zhuǎn)入含乳酸的培養(yǎng)液或廢水的厭氧反應器中，保持反應器溫度在25-351，使菌體吸附到固定化膜填料中，直至反應器中菌懸液006。。值不再下降；
[0015]步驟三、向步驟二的厭氧反應器中加入約15% -25%的含乳酸的培養(yǎng)液或廢水，25-351厭氧培養(yǎng)，通過版10?和此1控制反應器邱在5.5-5.8 ；乳酸耗盡后，再以約15% -25%的新鮮培養(yǎng)液/廢水替換，采用批次添加方式重復以上操作，直至己酸濃度?15呂凡；
[0016]步驟四、待己酸濃度?158凡穩(wěn)定5-7(1后，改為連續(xù)方式泵入培養(yǎng)液或廢水，維持乳酸濃度在3-208/1，通過連續(xù)發(fā)酵的方式，將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，得到含己酸的發(fā)酵液；
[0017]步驟五、提取發(fā)酵液中的己酸；
[0018]上述步驟一至四中所述的培養(yǎng)基為:5.0-25^乳酸，18酪蛋白胨，0.25-知酵母粉，0.4砂通⑶3,0.1邑半胱氨酸，0.045^2^04,0.045^^04,0.09^01,0.009^50,7^0,
0.009^ 08012？ 0.1呢刃天青，氯化血紅素，1呢生物素，1呢維生素812，3呢對氨基苯甲酸，5呢葉酸和15呢維生素86，10001111蒸懼水；
[0019]所述己酸功能菌群包括如下三個優(yōu)勢種群IV，其豐度為40-55% ；01081^1(1111111 其豐度為 15-40% ；以及其豐度為 8-20%。
[0020]所述己酸功能菌群包括如下二個優(yōu)勢種群IV，其豐度為55-65% ；01081:1-1(1111111 8611811 81:1~101:035~45%
[0021]優(yōu)選地，所述己酸功能菌群包括豐度為65%的(:108廿1(1111111 IV和豐度為35%的01081:1-1(1111111 8611811 81:11(31:0。
[0022]具體地，01081:1-1(1111111IV 種群可以為 01081^1(1111111 16^1:11111 或 01081^1(11111118^)01-0 81)11861-01(16 8 8611811 81:1~101:0 |中群可以為 01081^1(1111111
1311010 81:1-1(11111111010 81:1-1(1111111 垃 1117乂61~1，010 81:1-1(1111111
81301*0861168，其中每個種群的微生物可是所述的一種微生物或幾種微生物的任一比例組成。
[0023]上述步驟二中的厭氧反應器為上流式厭氧反應器。
[0024]除非另有說明，本發(fā)明中的“ ％ ”均為重量百分比。
[0025]本發(fā)明的有益效果在于:
[0026]1、本方法以乳酸電子供體生產(chǎn)己酸，增加了生物法發(fā)酵生產(chǎn)己酸的底物選擇性；
[0027]2、通過生物發(fā)酵獲得乳酸的方法和工藝比較成熟，以乳酸這種易得的非燃料物質(zhì)轉(zhuǎn)化為己酸，有望替代現(xiàn)有的化學合成方法。
[0028]3、通過本方法既可以乳酸為原料直接生產(chǎn)食品級的己酸及其衍生酯類(如己酸乙酯)，作為食品添加劑，也可以用于廢水資源化處理生產(chǎn)己酸，作為進一步合成生物柴油前體原料。
[0029]4、以乳酸為底物的微生物菌群對己酸的耐受濃度(25.68/1)比已報道的以克氏梭菌為主的微生物菌群的耐受濃度(12.68/1)提高了 2倍以上。
[0030]5、控制邱5.5-5.8，己酸功能菌活性不受影響，而反應過程中甲烷氣體濃度始終低于1 %，因此可以不添加甲烷抑制劑，可降低運行成本，同時避免甲烷菌與己酸菌競爭有機底物，提高底物利用率。
[0031]本方法適用范圍廣泛，除了可以直接用乳酸合成食品及醫(yī)用級己酸外，還能利用含乳酸的發(fā)酵工業(yè)廢水、廢棄物合成己酸；此外，利用本方法還可以對其他發(fā)酵工業(yè)廢水中含有的乙酸和丁酸進行碳鏈延長(補充乳酸)生成己酸。因此，通過本方法可實現(xiàn)廢水、廢棄物的資源化利用。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0032]圖1:本發(fā)明微生物催化乳酸合成己酸的工藝流程圖。
[0033]附圖標記:1、儲液罐，2、上流式厭氧反應器，3、菌液分離罐，4、酸液罐取劑儲罐，6、膜填料，7、活性碳填料，8、萃取裝置，9、反萃取裝置，10、反萃取劑接收罐。

【具體實施方式】
[0034]下面通過實施例對本發(fā)明進行闡述。
[0035]實施例1己酸功能菌群的培養(yǎng)
[0036]將培養(yǎng)基煮沸后分裝在2501111的厭氧瓶中，通入氮氣直至培養(yǎng)基顏色由藍變淡紅色直無色，12高溫滅菌150111，冷卻。按5%比例接種己酸菌群。25-351厭氧培養(yǎng)3-5(1，菌體密度00600達到3-5菌懸液，備用。
[0037]培養(yǎng)基成分如下:1.08乳酸，酪蛋白胨，0.酵母粉，0.5^01,0.48 髓⑶3，0.18 半胱氨酸，0.045邑舊？04，0.045^ 狃2？04，0.098 就1，0.009^1妨047?。?0，0.009^ 08012? 0.1呢刃天青，1呢氯化血紅素，1呢生物素，1呢維生素812，3呢對氨基苯甲酸，5呢葉酸和15呢維生素86，1001111蒸懼水。
[0038]己酸功能菌群包括豐度為65% 的 01081^1(1111111 81)01-081)11861-01(168,豐度為 35%
0105^1*1(1111111 七
[0039]實施例2微生物批次發(fā)酵乳酸生產(chǎn)己酸
[0040]將含508/1乳酸的培養(yǎng)液裝入發(fā)酵罐，1211滅菌冷卻后通過氮氣，使培養(yǎng)基氧化還原電位降到-50！^以下，接入5-8%種子菌液，再次通過氮氣使培養(yǎng)基氧化還原電位降到-50^以下，控制溫度25-35。。，邱5.5-5.8.，100轉(zhuǎn)/111111攪拌培養(yǎng)10-12(1，己酸濃度達208/1以上。該己酸發(fā)酵液經(jīng)蒸餾、精餾等常規(guī)提取工藝獲得高純度食品級己酸。
[0041]實施例3微生物連續(xù)發(fā)酵乳酸或含乳酸廢水生產(chǎn)己酸及其在線分離與提純
[0042]1、微生物的固定化
[0043]將種子液轉(zhuǎn)入含乳酸培養(yǎng)液的上流式厭氧反應器(附圖1)中，通入氮氣/ 二氧化碳(9:1)混合氣體，保持反應器溫度在25-351，使菌體吸附到固定化膜填料，直至反應器中菌懸液濃度不再下降；
[0044]2、利用乳酸廢水連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)己酸
[0045](1)向反應器中泵入含108/1的乳酸(或含乳酸廢水)，控制冊1:5(1,25-351厭氧培養(yǎng)，邱:5.5-5.8，維持進水負荷28乳酸/1.山運行10(1 ；
[0046](2)控制冊！':2.5(1，其他條件不變，進水負荷為知乳酸/1.山運行10(1 ；
[0047](3)控制勝:1.5(1，其他條件不變，進水負荷為6.78乳酸/1.山運行10(1 ；
[0048](4)正式運行，控制:1(1，維持乳酸負荷為10.0^/1.山通過連續(xù)發(fā)酵的方式，將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，得到含己酸的發(fā)酵液。反應器連續(xù)運行15(1后，生產(chǎn)效率達5.(1).
[0049]3、己酸的在線分離
[0050]含己酸的發(fā)酵液經(jīng)菌液分離裝置進行菌液分離，菌體經(jīng)管路回到發(fā)酵罐中，含己酸的液體由中空纖維膜的中空內(nèi)管進入萃取裝置進行萃取。萃取劑為含10% ^181111116336的油醇，萃取后液體經(jīng)管路回到發(fā)酵罐。
[0051]4、己酸的提取
[0052]含己酸的萃取劑從萃取裝置中經(jīng)由另一中空纖維膜空管進行反萃取，以5^氫氧化鈉由中空纖維膜外側(cè)進入并按相反方向流動，使己酸從萃取劑中進入氫氧化鈉溶液中。萃取劑回到上一中空纖維膜裝置繼續(xù)萃取，含己酸的氫氧化鈉溶液進入反萃取劑接收罐，當罐中己酸濃度接收飽和時，將液體導入鹽析罐，在鹽析罐中加入鹽酸進行鹽析，上層析出的即為己酸。
[0053]實施例4利用乳酸合成己酸的轉(zhuǎn)化效率
[0054]在實施例3所述反應器及微生物穩(wěn)定條件下，以乳酸為唯一的碳源和電子供體，采用間歇補料進樣，控制溫度301，邱:5.5-5.8，乳酸負荷為3.78/1/山運行15天，計算乳酸轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明，己酸積累濃度為20.68/1，乳酸的轉(zhuǎn)化率為93.1%，己酸是主要的產(chǎn)物，占90.4%。
[0055]本發(fā)明的一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法已經(jīng)通過具體的實例進行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本
【發(fā)明內(nèi)容】
，適當改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種通過微生物催化乳酸合成己酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟一、將己酸功能菌群接種到含有液體培養(yǎng)基的厭氧發(fā)酵瓶中，25-35°C厭氧培養(yǎng)3-5d，得到OD6tltl為3-5的菌懸液； 步驟二、將上述菌懸液轉(zhuǎn)入含乳酸的培養(yǎng)液或廢水的厭氧反應器中，保持反應器溫度在25-35°C，使菌體吸附到固定化膜填料中，直至反應器中菌懸液OD6tltl值不再下降； 步驟三、向步驟二的厭氧反應器中加入15% -25%的含乳酸的培養(yǎng)液或廢水，25-35°C厭氧培養(yǎng)，通過NaOH和HCl控制反應器pH在5.5-5.8 ;乳酸耗盡后，再以15% -25%的新鮮培養(yǎng)液/廢水替換，采用批次添加方式重復以上操作，直至己酸濃度>15g/L ； 步驟四、待己酸濃度>15g/L穩(wěn)定5-7d后，改為連續(xù)方式泵入培養(yǎng)液或廢水，維持乳酸濃度在3-20g/L，通過連續(xù)發(fā)酵的方式，將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸，得到含己酸的發(fā)酵液； 步驟五、提取發(fā)酵液中的己酸； 上述步驟一至四中所述的培養(yǎng)基為:5.0-25g乳酸，Ig酪蛋白胨，0.25-4g酵母粉，0.4gNaHC03，0.1g 半胱氨酸，0.045gK2HP04，0.045gKH2P04，0.09gNaCl，0.009gMgS047H20，0.009g CaCl2,0.1mg刃天青，Img氯化血紅素，Img生物素，Img維生素B12, 3mg對氨基苯甲酸,5mg葉酸和15mg維生素B6, 100ml蒸懼水； 所述己酸功能菌群包括如下二個優(yōu)勢種群=Clostridium IV，其豐度為55-65 % ；Clostridium 其豐度為 35-45%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，ClostridiumIV種群為Clostridium Ieptum 或 Clostridium sporosphaeroides ；Clostridium sensustricto 種群為 Clostridium butyricum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridiumkluyveri, Clostridium sporogenes ;其中每個種群的微生物是所述的一種微生物或幾種微生物的任一比例組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述己酸功能菌群包括豐度為65%的Clostridium IV 種群，豐度為 35% 的 Clostridium sensu stricto 種群。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟二中的厭氧反應器為上流式厭氧反應器。
【文檔編號】C12R1/145GK104357496SQ201410593446
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】陶勇, 朱曉宇, 何曉紅, 李大平 申請人:中國科學院成都生物研究所