一種產(chǎn)青蒿二烯的重組真核菌株及利用該重組真核菌株制備青蒿二烯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)青嵩二帰的重組真核菌株及利用 該重組真核菌株制備青嵩二帰的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然化合物主要從W下幾個(gè)途徑得到；（1)從植物中提取；(2)利用化學(xué)合成的方 法合成；（3)利用合成生物學(xué)手段合成。合成生物學(xué)是生產(chǎn)大規(guī)模且性能穩(wěn)定的天然化合 物的新學(xué)科，為直接從植物中提取和化學(xué)全合成的一個(gè)重要替代方式，送種方式主要是通 過(guò)基因工程手段將天然化合物合成途徑的相關(guān)酶基因?qū)氲浇湍浮⒋竽c桿菌或者植物等一 些常用的模式底盤(pán)細(xì)胞中，在底盤(pán)細(xì)胞中重新構(gòu)建可W生產(chǎn)天然化合物的途徑，進(jìn)而表達(dá) 天然化合物。
[0003] 青嵩素及其相關(guān)衍生物已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為目前世界上最有效的治療腦型 追疾和抗氯哇惡性追疾的藥物。青嵩二帰（Amorphadiene)是青嵩素的重要前體化合物之 一，其分子式為。5&4,是典型的倍半聰類(lèi)化合物。青嵩二帰經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)過(guò)氧化，可形成倍半聰 類(lèi)過(guò)氧化內(nèi)醋化合物青嵩素。合成生物學(xué)手段是獲得青嵩二帰的重要途徑之一。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)，青嵩植物中青嵩二帰的積累分兩個(gè)步驟；（1)生成法尼基焦磯 酸（farnesylpyrophosphate,FPF〇 ;(2)青嵩二帰合成酶（amo;rpha-4, 11-diene synthase,AD巧催化FPP經(jīng)過(guò)兩步環(huán)化反應(yīng)形成青嵩素的中間體紫穗槐-4, 11-二帰。其 中，F(xiàn)PP作為倍聰類(lèi)化合物的共同前體，它的合成主要通過(guò)兩條獨(dú)立的生物途徑：存在于真 核生物、古生菌和一些原核生物內(nèi)的甲居戊酸（Mevalonate，MVA)途徑W及細(xì)菌和光合真 核生物的 2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磯酸（2-methyl-D-e;ryt虹it〇]_-4-phosphate,MEF〇 途 徑。所W，送兩個(gè)途徑，W及途徑中關(guān)鍵的酶是利用合成生物學(xué)技術(shù)合成青嵩二帰的關(guān)鍵。
[0005]目前，用于青嵩二帰合成生物學(xué)研究的底盤(pán)細(xì)胞主要有大腸桿菌巧scherichia coli)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、植物細(xì)胞和其他微生物。其中，應(yīng)用最廣 泛的是大腸桿菌和釀酒酵母。大腸桿菌中存在唯一的聰類(lèi)合成途徑MEP途徑，而且已經(jīng)有 研究表明，MEP途徑在聰類(lèi)合成方面具有更大的潛力，適合合成聰類(lèi)化合物碳骨架，大腸桿 菌是較早被廣泛應(yīng)用于青嵩素半合成的微生物底盤(pán)細(xì)胞。2003年，Keasling課題組將重構(gòu) 的MVA途徑導(dǎo)入E.coli體內(nèi)，得到可W生產(chǎn)青嵩二帰的人工細(xì)胞。隨后，Keasling課題組 又經(jīng)過(guò)一系列底盤(pán)改造和發(fā)酵優(yōu)化，最終得到青嵩二帰產(chǎn)量為27. 4g/L的人工大腸桿菌細(xì) 胞。2014年，汪建峰等通過(guò)引入外源MEP途徑基因改造大腸桿菌底盤(pán)細(xì)胞，同時(shí)優(yōu)化發(fā)酵過(guò) 程，得到可W生產(chǎn)青嵩二帰6.Ig/L的人工大腸桿菌細(xì)胞。但是由于大腸桿菌體系缺少糖基 化和翻譯后修飾等功能，不利于青嵩二帰后續(xù)生產(chǎn)中的修飾，限定了其應(yīng)用。
[0006] 所W，更多研究者選擇生長(zhǎng)繁殖速度快，基因操作簡(jiǎn)單，可W進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn) 的酵母作為研究底盤(pán)。根據(jù)重組菌株的構(gòu)建方式，在利用酵母作為合成生物學(xué)中的底盤(pán)細(xì) 胞時(shí)，將外源基因?qū)氲妆P(pán)細(xì)胞后得到兩種重組工程菌；附加體型重組菌株和整合體型重 組菌株。針對(duì)表達(dá)青嵩二帰的重組菌株，2009年孔建強(qiáng)等在藥學(xué)學(xué)報(bào)《酵母工程菌制備紫 穗槐-4, 11-二帰的研究》中報(bào)道了附加體型酵母工程菌產(chǎn)青嵩二帰的產(chǎn)量要高于整合體型 酵母工程菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種產(chǎn)青嵩二帰的重組真核菌株及利用該重組真核 菌株制備青嵩二帰的方法。本發(fā)明提供的產(chǎn)青嵩二帰的重組真核菌株屬于整合型重組菌 株，該產(chǎn)青嵩二帰的重組真核菌株的青嵩二帰產(chǎn)量高，且其底盤(pán)細(xì)胞為真核菌，更有利于青 嵩二帰的后續(xù)生產(chǎn)。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0009]本發(fā)明提供了一種產(chǎn)青嵩二帰的重組真核菌株，在該真核菌株的基因組中整合表 達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因、表達(dá)FPP合酶的基因、和表達(dá)青嵩二帰合 酶的基因；
[0010] 該整合為整合在該真核菌株的基因組的多拷貝位點(diǎn)。
[0011] 在本發(fā)明中，所述表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因是指該 基因的表達(dá)產(chǎn)物具有3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的活性，其催化甲居戊酸 (]\16￥日1〇]1日16,]\^4)途徑中的中間產(chǎn)物歷6-〔〇4化7化〇巧1-11161:115^-邑1111日巧1-〔〇4)生成甲 居戊酸（mevalonate)。
[0012] 在本發(fā)明中，所述表達(dá)FPP合酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有FPP合酶的活 性，其催化IPP和DMAPP通過(guò)縮合形成GPP，GPP再與IPP縮合形成半聰類(lèi)物質(zhì)的共同前體 FPP。
[0013] 在本發(fā)明中，所述表達(dá)青嵩二帰合酶的基因是指該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有青嵩二帰 合酶的活性，其催化FPP經(jīng)過(guò)兩步環(huán)化反應(yīng)形成青嵩二帰。
[0014] 在本發(fā)明中，所述表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因、所述表達(dá)FPP 合酶的基因、所述表達(dá)青嵩二帰合酶的基因既可W是野生型的也可W是變異的，只要其表 達(dá)產(chǎn)物保留該酶的活性即可。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，該真核菌株為酵母菌。在本發(fā)明的一些實(shí) 施例中，該真核菌株為釀酒酵母。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，為釀酒酵母CEN.PK2-1C。
[0016] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，該多拷貝位點(diǎn)為Delta位點(diǎn)。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原 酶的基因、表達(dá)FPP合酶的基因和表達(dá)青嵩二帰合酶的基因中至少一種是外源基因。
[0018] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)青嵩二帰合酶的 基因?yàn)橥庠椿?，是參考GeneBank1化AF-138959報(bào)道的序列信息，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化獲得。 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，該表達(dá)青嵩二帰合酶的基因具有如SEQIDN0:1所示的核 巧酸序列，標(biāo)記為ADS基因。
[0019] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)截短的3-居 基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因來(lái)自于釀酒酵母基因組。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施 例中，該表達(dá)截短的3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因來(lái)自于釀酒酵母BY4741 基因組，標(biāo)記為tHMGR基因。
[0020] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)FPP合酶的 基因來(lái)自于釀酒酵母基因組。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，該表達(dá)FPP合酶的基因來(lái)自 于釀酒酵母BY4741基因組，標(biāo)記為ERG20基因。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原 酶的基因、表達(dá)FPP合酶的基因和表達(dá)青嵩二帰合酶的基因中至少一種W表達(dá)盒的形式整 合到真核菌株的基因組中。
[0022] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)3-居基-3-甲基 戊二醜輔酶A還原酶的基因W表達(dá)盒的形式整合到真核菌株的基因組中，并且該表達(dá)盒包 含啟動(dòng)子、表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還原酶的基因、終止子。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還 原酶的基因W表達(dá)盒的形式整合到真核菌株的基因組中時(shí)，其中的啟動(dòng)子為真菌菌株內(nèi)源 組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。更為優(yōu)選地，該啟動(dòng)子為T(mén)EFUTPI1或GPM1。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中， 具體為T(mén)EF1。
[0024] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)3-居基-3-甲 基戊二醜輔酶A還原酶的基因W表達(dá)盒的形式整合到真核菌株的基因組中時(shí)，其中的終止 子為T(mén)EFUTPI1或GPM1。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，具體為T(mén)EF1。
[00巧]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)FPP合酶的基因W表達(dá)盒的形式整合到該真核菌株的基因組中時(shí)，并且該表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)FPP合 酶的基因、終止子。
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)FPP合酶的基因W表達(dá)盒的形式 整合到所述真核菌株的基因組中時(shí)，其中的啟動(dòng)子為真核菌株內(nèi)源中強(qiáng)型啟動(dòng)子。更為優(yōu) 選地，該啟動(dòng)子為GPM1、TPI1、FBA1或GPD1。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，具體為GPM1。
[0027] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)FPP合酶的基 因W表達(dá)盒的形式整合到所述真核菌株的基因組中時(shí)，其中的終止子為T(mén)PI1、TEF1、GPM1、 FBA1或GPD1。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，具體為T(mén)PI1。
[0028] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)青嵩二帰合酶的 基因W表達(dá)盒的形式整合到真核菌株的基因組中，且該表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、表達(dá)青嵩二帰 的基因、終止子。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)青嵩二帰合酶的基因W表達(dá)盒的 形式整合到真核菌株的基因組中時(shí)，其中的啟動(dòng)子為真核菌株內(nèi)源性啟動(dòng)子。更為優(yōu)選地， 該啟動(dòng)子為EN02、PGK1、TEF2或PDC1。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，具體為PDC1。
[0030] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)青嵩二帰合酶的基因W表達(dá)盒的 形式整合到真核菌株的基因組中時(shí)，其中的終止子為真核菌株內(nèi)源性終止子。更為優(yōu)選地， 該類(lèi)型的終止子為GPM1、EN02、TPI1、TEF1、FBA1或GPD1。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，具體 為GPM1。
[0031] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，當(dāng)表達(dá)3-居基-3-甲基戊二醜輔酶A還 原酶的基因表達(dá)盒、表達(dá)FPP合酶活性的基因表達(dá)盒和表達(dá)青嵩二帰合酶的基因表達(dá)盒W 基因功能模塊的形式整合到所述多拷貝位點(diǎn)。
[0032] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中，表達(dá)3-居基-3-甲基 戊二醜輔酶A還原酶的基因表達(dá)盒、表達(dá)FPP合酶活性的基因表達(dá)盒和表達(dá)青嵩二帰合酶 的基因表達(dá)盒W基因功能模塊的形式整合到所述多拷貝位點(diǎn)時(shí)，表達(dá)3-居基-3-甲基戊二 醜輔酶A還原酶的基因表達(dá)盒、表達(dá)FPP合酶活性的基因表達(dá)盒和表達(dá)青嵩二帰合酶的基 因表達(dá)盒在基因功能模塊中的排列順序不固定。各個(gè)基因表達(dá)盒之間可W通過(guò)一段短的核 巧酸序列連接，例如終止子，也可W直接相連。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重 組真核菌株中，Η個(gè)基因表達(dá)盒在基因功能模塊中的排列順序?yàn)椋槐磉_(dá)3-居基-3-甲基戊 二醜輔酶A還原酶的基因表達(dá)盒、表達(dá)FPP合酶活性的基因表達(dá)盒、表達(dá)青嵩二帰合酶的基 因表達(dá)盒的前后順序排列。
[0033] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組真核菌株中的整合到多拷貝位點(diǎn)的上述基因功能模 塊中還可W包括篩選標(biāo)記基因，W便于重組菌株的篩選，篩選標(biāo)記可W為L(zhǎng)ue、化S、Trp或 化a。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的重組真核菌株中的基因功能模塊中的篩選標(biāo) 記為URA3基因。