硅藻工程藻株及其制備方法、應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物產(chǎn)油技術領域，尤其設及經(jīng)過改良娃藻產(chǎn)油遺傳特征的工程藻株 及其制備方法、應用。
【背景技術】
[0002] 地球上化石燃料的大規(guī)模持續(xù)消耗造成全球性能源短缺和油價飄升，根據(jù)有關專 家估計，本世紀末地球上的石油資源將枯竭，特別是中國的石油資源25年內會開采殆盡； 同時化石燃料的使用釋放了大量的二氧化碳等有害氣體，加速了全球變暖和空氣污染，我 國在2012年底開始一直到目前的大面積霧靈天氣也給我們敲響了大氣環(huán)境危機的警鐘。 因此，低污染的可再生新能源形式的開發(fā)和利用迫在眉睫。生物柴油作為一種優(yōu)質的液體 燃料替代品越來越受到青睞。生物柴油是W動物脂肪、植物油、微藻和微生物油脂或廢棄油 中的甘油Ξ醋與甲醇或乙醇進行轉醋反應而獲得的，其物理和化學性質與柴油非常相近， 并具有閃點高、硫污染物少等優(yōu)點。
[0003] 生產(chǎn)生物柴油的原料往往根據(jù)各地區(qū)可W得到的原料種類不同而不同。實際產(chǎn)油 效率和技術不同。有人根據(jù)現(xiàn)有技術所能夠產(chǎn)出的原料效率計算，微藻的產(chǎn)油效率遠遠超 過其它高等植物和油料作物，因此被認為是制備生物柴油最有應用潛力的原料。微藻生產(chǎn) 周期短，能夠W工廠化方式培養(yǎng)、收集、提油；但是生產(chǎn)成本需要進一步降低，借助遺傳改造 的方法進一步提高微藻的產(chǎn)油量是途徑之一。W往對于微藻產(chǎn)油率進行基因改造的思路主 要有兩種：一種是試圖表達產(chǎn)油途徑中某個基因，但至今沒有真正成功的報道；另一種是 阻斷或削弱其他碳膽藏物的合成，提高油含量，運種方式一般會導致生長速率下降。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于解決現(xiàn)有技術中一些具有商業(yè)價值的微藻產(chǎn)油量需要進一 步提高、對產(chǎn)油途徑的某些基因過表達或其他代謝途徑基因進行重組，雖提高產(chǎn)油量卻抑 制其生長的問題，提供了通過二徑酸脫水酶基因過量表達提高微藻油脂產(chǎn)量的同時又不降 低其生長速率的藻株。 陽0化]本發(fā)明中提供的娃藻工程藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平高于其相對應 的野生型藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平。
[0006]在一個具體的實施方式中，所述工程藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平為 其相對應的野生型藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平的2倍W上，優(yōu)選為2-50倍， 更加優(yōu)選為5-20倍。藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平的高低與藻株的產(chǎn)油量成正 相關，也就是說，藻株中二徑酸脫水酶基因的mRNA水平的含量相對高的話，該藻株的產(chǎn)油 量也相對高；藻株中二徑酸脫水酶基因的mRNA水平的含量相對低的話，該藻株的產(chǎn)油量也 相對低。通過分子生物學的方法來提高藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平，其相對應 的產(chǎn)油量也相應的提高。
[0007]在一個具體的實施方式中，所述工程藻株的生長速率大于或等于其相對應的野生 型藻株的生長速率。因為油的總得率決定于含油量和生物量的乘積，所w較高的生長速率 對于生產(chǎn)是很重要的。而且產(chǎn)油藻株生長慢的話，容易被其他生物污染，從運方面來講，產(chǎn) 油藻株生長的慢對生產(chǎn)生物油也是不利的，因此有必要克服運一弊端。
[0008] 在一個具體的實施方式中，所述工程藻株中含有通過基因重組方式而獲得的二徑 酸脫水酶基因的表達盒，且所述二徑酸脫水酶基因的表達盒中包括依次序的啟動子序列、 所述二徑酸脫水酶基因的序列和終止子序列。
[0009] 在一個具體的實施方式中，所述二徑酸脫水酶的基因選自于其翻譯成氨基酸后的 序列與如沈QIDN0:15(來源于Ξ角褐指藻（Phaeodact}dumt;rico;rnutum)CCAP1055/l) 翻譯成氨基酸后的序列的一致性在60%W上，且具有二徑酸脫水酶活性的序列。
[0010] 在一個具體的實施方式中，所述二徑酸脫水酶的基因所使用的啟動子選自能夠在 娃藻中啟動所述二徑酸脫水酶的基因轉錄的啟動子，例如選自來源于娃藻的fcpA啟動子 或fc地啟動子；和/或其所使用的終止子選自能夠在娃藻中終止所述二徑酸脫水酶的基因 轉錄的終止子，例如選自來源于娃藻的fcpC終止子或fcpA終止子。
[0011] 在一個具體的實施方式中，所述二徑酸脫水酶基因的表達盒中還包括與所述二徑 酸脫水酶基因的表達方向相同的標記基因的序列，且所述標記基因的序列位于所述啟動子 序列和所述二徑酸脫水酶基因的序列之間，或位于所述二徑酸脫水酶基因的序列和終止子 序列之間；或所述工程藻株含有通過基因重組方式獲得的標記基因的表達盒，且所述標記 基因的表達盒中包括依次的啟動子序列、所述標記基因的序列和終止子序列。
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所述標記基因選自博來霉素的抗性基因、新霉素憐酸 轉移酶基因、諾斯霉素抗性基因和巧光蛋白標記基因中的一種。
[0013] 在一個具體的實施方式中，所述標記基因的表達盒的所述啟動子序列選自來源于 娃藻的啟動子序列，例如fcpA啟動子序列或fc地啟動子序列，且與所述二徑酸脫水酶基因 的表達盒的所述啟動子序列不同；
[0014] 和/或所述標記基因的表達盒的所述終止子序列選自來源于娃藻的終止子序列， 例如fcpC終止子序列或fcpA終止子序列，且與所述二徑酸脫水酶基因的表達盒的所述終 止子序列不同。
[0015]在一個具體地實施方式中，所述野生型娃藻選自褐指藻（Phaeodactylum)、小環(huán)藻 (切clotella)、舟形藻（化vicula)、筒柱藻（切l(wèi)in化otheca)、海鏈藻（Thalassiosira)中 的一種。
[0016] 在一個優(yōu)選地實施方式中，所述野生型娃藻選Ξ角褐指藻（P.tricornutum)、隱秘 小環(huán)藻杞cryptica)、腐生舟形藻（N.sapro地ila)、梭形筒柱藻（C.fusiformis)、假微型 海鏈藻（T.pseudonana)中的一種。
[0017] 在一個具體的實施方式中，含有所述二徑酸脫水酶基因的表達盒和所述標記基因 的表達盒的所述工程藻株選自保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、的保藏編號為CCTCCNO: ]\12014341 的^角褐指藻：：口飾；\-11乂0-1飾。？皿5370-22(化日6〇(1日。17111111付;[。01']1111：111]1:: PfcpA-ilvD-TfcpcP皿5370-22)。所述的Ξ角褐指藻（P.tricornutum)CCTCCN0:M2014341 的 保藏地址為中國.武漢.武漢大學。郵編：430072,保藏日期為2014年7月16日。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種改良娃藻產(chǎn)油遺傳特征的工程藻株的制備方法，包括如下步 驟：
[0019] 1)依照啟動子、二徑酸脫水酶的基因、終止子的連接順序將此Ξ個元件克隆到基 因載體上，獲得二徑酸脫水酶基因的表達盒；
[0020] 2)將所述步驟1)獲得的二徑酸脫水酶基因的表達盒轉化到娃藻中，獲得重組子， 并對重組子進行DNA鑒定，獲得陽性的工程藻株；
[0021] 3)比較所述工程藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平與其相對應的野生型藻 株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平，W及任選的比較所述工程藻株與其相對應的野生 型藻株的生長速率；
[0022] 4)比較所述工程藻株與其相對應的野生型藻株的產(chǎn)油量。
[0023] 其中，所述二徑酸脫水酶基因的表達盒可W克隆到適宜的質粒載體上。所述二徑 酸脫水酶基因的mRNA水平高于其相對應的野生型藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水 平，則所述工程藻株的油產(chǎn)量高于其相對應的野生型藻株的產(chǎn)油量。或者所述二徑酸脫水 酶基因的mRNA水平高于其相對應的野生型藻株中的二徑酸脫水酶基因的mRNA水平，且述 工程藻株的生長速率高于其相對應的野生型藻株的生長速率，則所述工程藻株的油產(chǎn)量高 于其相對應的野生型藻株的產(chǎn)油量。
[0024] 在一個具體的實施方式中，所述制備方法中的所述二徑酸脫水酶的基因選自于其 翻譯成氨基酸后的序列與如SEQIDN0:15(來源于Ξ角褐指藻CCAP1055/1)翻譯成氨基酸 后的序列的一致性在60 %W上，且具有二徑酸脫水酶活性的序列。
[0025] 在一個具體的實施方式中，所述制備方法中的所述二徑