酸脫水酶的基因所使用的 啟動子選自能夠在娃藻中啟動所述二徑酸脫水酶的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，例如選自來源于娃 藻的fcpA啟動子或fc地啟動子；和/或其所使用的終止子選自能夠在娃藻中終止所述二 徑酸脫水酶的基因轉(zhuǎn)錄的終止子，例如選自來源于娃藻的fcpC終止子或fcpA終止子。 [00%] 在一個具體的實施方式中，所述制備方法中的所述步驟1)和2)之間還包括步驟 1)，將與所述二徑酸脫水酶基因的表達方向相同的標記基因的序列克隆到所述啟動子序列 和所述二徑酸脫水酶基因的序列之間的位置，或?qū)⑵淇寺〉剿龆剿崦撍富虻男蛄?和終止子序列之間的位置；或當(dāng)所述的二徑酸脫水酶基因的表達盒克隆在質(zhì)粒載體上時， 依照啟動子序列、標記基因的序列和終止子序列的連接順序?qū)⒋甩畟€元件克隆到所述的二 徑酸脫水酶基因的表達盒所在的質(zhì)粒載體上，獲得標記基因的表達盒；且所述標記基因的 表達盒與所述二徑酸脫水酶基因的表達盒相鄰。所述二徑酸脫水酶基因的表達盒的表達方 向與所述標記基因的表達盒的表達方向可W相同或不同。
[0027] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所述制備方法中的所述標記基因選自博來霉素的抗性 基因、新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶基因、諾斯霉素抗性基因和巧光蛋白標記基因中的一種。
[0028] 在一個具體的實施方式中，所述制備方法中的所述標記基因的表達盒的所述啟動 子序列選自來源于娃藻的啟動子序列，例如fcpA啟動子序列或fc地啟動子序列，且與所述 二徑酸脫水酶基因的表達盒的所述啟動子序列不同；和/或所述標記基因的表達盒的所述 終止子序列選自來源于娃藻的終止子序列，例如fcpC終止子序列或fcpA終止子序列，且與 所述二徑酸脫水酶基因的表達盒的所述終止子序列不同。
[0029] 在一個具體地實施方式中，所述制備方法中的所述野生型娃藻選自褐指藻指藻 任11日6〇(1日(315^111111)、小環(huán)藻（切(31〇1611日）、舟形藻（化￥；[州1日）、筒柱藻（切1;[]1化〇1:116。日）、海 鏈藻（Thalassiosira)中的一種。
[0030] 在一個優(yōu)選地實施方式中，所述制備方法中的所述野生型娃藻選Ξ角褐指藻 (Ρ.tricornutum)、隱秘小環(huán)藻（C.cryptica)、腐生舟形藻（Ν.sapro地ila)、梭形筒柱藻 (C.fusiformis)、假微型海鏈藻（T.pseudonana)中的一種。
[0031]另外，本發(fā)明還提供了所述工程藻株或所述方法在娃藻產(chǎn)油中的應(yīng)用。
[0032] 進一步地，本發(fā)明提供了所述工程藻株或所述方法在娃藻產(chǎn)甘油Ξ醋中的應(yīng)用。 其中，所述甘油Ξ醋是生產(chǎn)生物柴油的主要原料。
[0033] 有益效果和顯著優(yōu)點：
[0034] 按照本發(fā)明，可W針對性的利用二徑酸脫水酶基因，在過量表達二徑酸脫水酶基 因的含油娃藻Ξ角褐指藻的工程藻株中，不僅含油量提高了，而且生長速率比野生型沒有 下降，往往還略有提升。得到的優(yōu)良高產(chǎn)油的工程藻株，為生物柴油的生產(chǎn)降低了成本，提 高了市場競爭力。
[0035] 通過采取W上方法，得到的高產(chǎn)油株甘油Ξ醋含量最高的一株比野生型藻株高 5.39%。根據(jù)文獻中報道，生長速率為10gm2di、含油量（甘油Ξ醋）為30%的藻株，每公 頃年產(chǎn)生物柴油大約為1200化，因而每增加1 %的含油量，每年每公頃就要多產(chǎn)出40化的 生物柴油。W現(xiàn)有的生物柴油價格6.0元/L為標準，該工程藻株每年每公頃會增加大約 1.3萬元的產(chǎn)值。
【附圖說明】
[0036] 圖1是構(gòu)建的P皿5370的質(zhì)粒圖譜，其中，ori為P皿5370在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù) 制區(qū)，Am護為氨節(jié)霉素抗性基因，PhpA為fcpA的啟動子，ilvD為二徑酸脫水酶基因，Thpc為 fcpC的終止子，Pftpe為fc地的啟動子，shble為博來霉素抗性基因，ThpA為fcpA的終止 子。
[0037] 圖2是針對博來霉素狂eocin)抗性重組子的PfcpA-ilvD片段的PCR檢測圖[W fcpA-2F(沈QIDN0:5)和ilvD-2-R(SEQID^進為引物]，其中，圖中的Μ為1.0化 DM分子量標準；序號1-39為篩選的抗性重組子；wt為工程藻株的相對應(yīng)的野生型藻株 CCAP1055/1;從檢測圖可W看出，序號為 1、2、9、16、17、20、21、22、24、25、27、33、35、36和39 的抗性重組子的PCR片段的大小為2. 5化，為其所對應(yīng)的藻株為陽性的工程藻株。 W38] 圖3是隨機挑選的代號分別為P皿5370-1、P皿5370-16、P皿5370-17、P皿5370-21和抑B5370-22的5個工程藻株的二徑酸脫水酶基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR[W ilvD-qRT-F(SEQIDNO:11)和ilvD-qRT-R(SEQIDNO:12)為引物]檢測結(jié)果；wt為工 程藻株的相對應(yīng)的野生型藻株Ξ角褐指藻CCAP1055/1;圖中顯示5個重組子均為二徑酸 脫水酶基因過表達工程藻株，且5個工程藻株的表達水平均高于其相對應(yīng)的野生型藻株 CCAP1055/1。其中P皿5370-1和P皿5370-17的二徑酸脫水酶基因轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)，且在5個 工程藻株中的轉(zhuǎn)錄水平相對最低，但與wt相比，P皿5370-1和P皿5370-17的二徑酸脫水酶 基因轉(zhuǎn)錄水平是wt的5倍W上，而轉(zhuǎn)錄水平最高的P皿5370-22是wt的19倍之多。
[0039]圖 4 是代號分別為P皿5370-1、P皿5370-16、P皿5370-17、P皿5370-21 和P皿5370-22的5個二徑酸脫水酶基因過表達工程藻株細胞中的總脂含量。從圖中可 W看出，5個工程藻株的總脂含量均高于wt，也就是說，均高于其對應(yīng)的野生型藻株 CCAP1055/1，其中，總脂含量最低的是藻株P(guān)皿5370-16,比wt的總脂含量提高了 0. 5% ;總 脂含量最高的是藻株P(guān)皿5370-22,比wt的總脂含量提高了 18. 7%。
[0040] 圖 5 是代號分別為P皿5370-1、P皿5370-16、P皿5370-17、P皿5370-21 和 P皿5370-22的5個二徑酸脫水酶基因過表達的工程藻株細胞中的甘油Ξ醋含量;wt為所述 工程藻株相對應(yīng)的野生型藻株CCAP1055/1，圖中顯示所述工程藻株中的甘油Ξ醋含量均高 于wt，也就是說，均高于其對應(yīng)的野生型藻株CCAP1055/1，其中，甘油Ξ醋脂含量最低的是 藻株P(guān)皿5370-21，比wt的總脂含量提高了 12.6%;總脂含量最高的是藻株P(guān)皿5370-22,比 wt的總脂含量提局了 20. 4%。
[0041]圖6是代號分別為P皿5370-1、P皿5370-16、P皿5370-17、P皿5370-21 和 P皿5370-22的5個二徑酸脫水酶基因過表達工程藻株與其相對應(yīng)的野生型藻株 CCAP1055/1的生長曲線的比較；圖中顯示兩株工程藻株與其相對應(yīng)的野生型藻株 CCAP1055/1生長速率相當(dāng)，另外3株工程藻株略高于相對應(yīng)的野生型藻株CCAP1055/1。
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體的實施例及附圖對本發(fā)明做詳細說明。 陽043] 實施例1 W44] 構(gòu)建過量表達二徑酸脫水酶基因（ilvD)的質(zhì)粒 W45] 構(gòu)建質(zhì)粒所用限制性內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和T4DNA連接酶均為大 連寶生物有限公司（Takara)產(chǎn)品。
[0046]WilvD-l-F(SEQIDNO:1)和ilvD-2-R(SEQIDNO:2)為引物，娃藻研究的模式 種Ξ角褐指藻（P.tricornutumCCAP1055/1)(英國藻類和原生動物培養(yǎng)中屯、CCAP1055/1) 基因組為模板，PCR擴增出2. 3化的ilvD片段，克隆到PMD18-T中，得到質(zhì)粒抑B5342。PstI 和EcoRV酶切抑B2983 (劉飛飛等，水生生物學(xué)報，2013, 37:799-802)，利用T4DNA聚合酶 補平[補平反應(yīng)體系為：18. 5μ1的DNA限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系中直接加入1μ1的2. 5mM dNTPs和 0. 5μ1 的T4DNA聚合酶巧u/μL，Takara)，16°C，反應(yīng) 30min，70°C滅活lOmin。] 回收400bp的fcpA啟動子片段（也可W通過角褐