專利名稱：一種真核重組質(zhì)粒及其在提高番茄果實(shí)色素積累中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種真核重組質(zhì)粒及其在調(diào)控番茄果實(shí) 色素積累中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄紅素是重要的抗氧化劑之一，具有清除活性氧自由基、促進(jìn)細(xì)胞間隙連接通 訊、防癌抗癌等多種生理功能。目前已對(duì)番茄紅素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的遺傳操作進(jìn)行 了廣泛的嘗試，主要局限在于加強(qiáng)或阻斷某一關(guān)鍵基因的表達(dá)會(huì)引起許多負(fù)面效應(yīng)，目標(biāo) 產(chǎn)物的積累也達(dá)不到預(yù)期的效果。例如，在提高番茄紅素積累量的轉(zhuǎn)基因研究中，將微生 物中一個(gè)編碼八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase)的crtl基因轉(zhuǎn)入番茄基 因組中，該酶能將八氫番茄紅素(phytoene)轉(zhuǎn)變?yōu)榉鸭t素，結(jié)果表明果實(shí)中類胡蘿卜 素(carotenoids)總含量并未增加，其中β -胡蘿卜素(β-carotene)增加三倍而番茄紅
(Romer S et al. ,2000), Elevationof the provitamin A content of transgenic tomato plants. Nat Biotechnol, 18 :666-669) 而利用反義 RNA 技術(shù)下調(diào)番 茄紅素β -環(huán)化酶(lycopene β -cyclase)基因的表達(dá)，以阻止番茄紅素轉(zhuǎn)變成β -胡蘿 卜素，其研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的番茄紅素含量并未顯著增加(Rosati C et al. ,2000, Metabolic engineering of beta carotene and lycopene content in tomato fruit. Plant Journal, 24 :413-9)。近年來基因工程從對(duì)結(jié)構(gòu)基因的遺傳操作已拓展到對(duì)調(diào)節(jié)基因的遺傳操 作(Gantet P etal.，2002，Trends Pharmacol Sci，23 :563-9 ；Wagoner W et al.， 2003， Activation tagging in tomatoidentifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis, modification，and transport. PlantCel1,15 :1689-703)0 通過RNA干擾技術(shù)(RNAi)獲得目標(biāo)基因表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因植株，再觀察轉(zhuǎn)基因植 株的表現(xiàn)型來研究基因的功能，也就是功能基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的反向遺傳學(xué)方 法。如，利用CaMV35S啟動(dòng)子在番茄中過量表達(dá)燕麥的紅光和遠(yuǎn)紅光受體光敏素(PHYA) 可以引起番茄果實(shí)高色素表現(xiàn)型，葉片和果實(shí)顏色加深，但植株矮化(Boylan MT, Quail PH.，1989，Oat phytochrome is biologically active in transgenic tomatoes. Plant Cell，1 :765-73)。過量表達(dá)藍(lán)光受體隱花色素(CRY2)基因也可以提高果實(shí)中類黃酮 和番茄紅素的含量，葉片中葉綠素和花青素含量提高，植株矮化(Leonardo G，et al., 2005, Manipulation ofthe Blue Light Photoreceptor Cryptochrome 2 in Tomato Affects Vegetative Development, Flowering Time, and Fruit Antioxidant Content. Plant Physiology, 137 :199-208)。利用RNAi技術(shù)組成型地干涉光形態(tài)建成的正調(diào)控基 因LeHY5的表達(dá)，使番茄果實(shí)的類胡蘿卜素含量和葉片中的葉綠素的含量下降，而光形態(tài) 建成的負(fù)調(diào)控基因LeCOPlLIKE的RNAi轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的總含量明顯提高， 口十>tMiJ ii§fe。 (Liu YS, et al. ,2004, Manipulation of lightsignal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl AcadSciUSAaoi :9897-90 。番茄中存在一類單基因的高色素突變體hpl (high pigment-1)和 hp2(highpigment^，這類突變體的成熟果實(shí)積累的類胡蘿卜素總量可以達(dá)到野生型的三 倍，同時(shí)葉片和未成熟的綠果實(shí)中葉綠素的含量也比野生型的高，但這類突變體的幼苗對(duì) 光存在超敏反應(yīng)(hyper-responsiveness to light)下胚軸伸長(zhǎng)被抑制和花青素大量積 累。研究發(fā)現(xiàn)這類突變體可能影響光敏受體(phytochrome)和藍(lán)光受體(crytochrome)下 游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Songhu Wang, et al. , 2008, Altered plastid levels and potential for improved fruit nutrient content bydownregulation of the tomato DDBl-interacting protein CUL4, The Plant Journal，55，89-103)。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中雖然公開了一些用于調(diào)控番茄果實(shí)色素積累的基因，但通 過基因工程技術(shù)克隆和篩選出更多的調(diào)節(jié)基因，對(duì)提高番茄果實(shí)色素積累，培育品質(zhì)優(yōu)良 的番茄仍然有著重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新型的真核重組質(zhì)粒及其制備方法，本發(fā)明的目的 之二是將所述真核重組質(zhì)粒在調(diào)控番茄果實(shí)色素積累中應(yīng)用，以提高番茄果實(shí)色素的積 累，培育出品質(zhì)更好的番茄。本發(fā)明的技術(shù)方案如下根據(jù)GenBank上公布的EST序列(登錄號(hào)BG133728)序列設(shè)計(jì)5’ RACE和 3，RACE的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，TA克隆5，和3，擴(kuò)增片段，測(cè)序后與已知的EST (expressed sequencetag)序列拼接成一個(gè)1945bp的cDNA序列，分析得到一個(gè)1806bp的開發(fā)閱讀框， 命名為HP4(high-pigment4)基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。該基因編 碼一個(gè)具有WD結(jié)構(gòu)域的假定蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO 1所示核苷酸序列中的基因片 段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游783bp至1253bp的核苷酸序 列，所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因 片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒的制備方法，其步驟如下(1)在序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基 因片段是位于起始密碼子下游783bp至1253bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到 質(zhì)粒pSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中 間載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段 的部分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒及其制備方法中，所述真核表達(dá)載體為pHB、pM0N1772、 pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI121 中的一種。將上述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化番茄，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。實(shí)驗(yàn)表明所述轉(zhuǎn)基因番茄 植株的未成熟果實(shí)顏色明顯深于野生型番茄植株的未成熟果實(shí)；對(duì)于成熟番茄果實(shí)，轉(zhuǎn)基 因番茄的番茄紅素含量也較野生型番茄有明顯的提高(見圖6、圖7)。由此可見，本發(fā)明所 述真核重組質(zhì)粒能夠調(diào)控番茄果實(shí)色素的積累，可在提高番茄果實(shí)色素積累中應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明為提高番茄果實(shí)色素積累提供了一種新的真核重組質(zhì)粒，有利于番茄品 質(zhì)的改良。2、本發(fā)明所用的基因?yàn)榉驯旧碜杂械幕颍赞D(zhuǎn)基因番茄的安全性能高。3、本發(fā)明所述基因的克隆和番茄轉(zhuǎn)基因均為常規(guī)方法，所需材料易于獲取。


圖1是本發(fā)明所述HP4基因的RACE擴(kuò)增電泳圖，圖中，1泳道為5’ RACE的電泳結(jié) 果，2泳道為3，RACE的電泳結(jié)果，3泳道為Marker DL2000。圖2是本發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒(pBI_HP4RNAi)的一種示意圖，其中，sense為正 向基因片段，anti-sense為反向基因片段。圖3是根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其 中，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為番茄紅素的濃度。圖4是轉(zhuǎn)基因番茄植株中轉(zhuǎn)基因抗性篩選標(biāo)記卡那霉素抗性基因(NPTII)的PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，1泳道陰性對(duì)照，PCR模板為野生型番茄植株DNA ；2泳道陽(yáng)性對(duì)照， PCR模板為發(fā)明所述真核重組質(zhì)粒(pBI-HP4RNAi) ；3_7泳道PCR模板為候選的轉(zhuǎn)基因番 茄植株DNA。圖5是番茄植株的照片，其中，A為野生型番茄植株，B、C均為轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi番 茄植株。圖6是番茄果實(shí)的照片，其中，A、B為轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)，C、D為野生型番茄的果實(shí)。圖7是番茄果實(shí)中番茄紅素含量的示意圖，圖中，d為野生型番茄果實(shí)中番茄紅 素的含量，a為轉(zhuǎn)pBI-HP4RNAi基因番茄植株1號(hào)的番茄果實(shí)中番茄紅素的含量，b為轉(zhuǎn) pBI-HP4RNAi基因番茄植株2號(hào)的番茄果實(shí)中番茄紅素的含量，c為轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi基因番 茄植株3號(hào)的番茄果實(shí)中番茄紅素的含量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實(shí)施事例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條 件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按 照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 :HP4基因的克隆1、試劑限制性內(nèi)切酶HindIII，Xho I, Xba I, EcoR I，Sac I ；Taq DNA 聚合酶，T4DNA 連 接酶，Prim必tar熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶，pMD18_T克隆載體，大腸桿菌(E. coli) JM109菌 株等購(gòu)自大連寶生物工程公司；Trizol試劑購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司；RACE試劑盒 購(gòu)自Clontech公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR引物由上海英俊生 物公司合成；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2、大腸桿菌菌株和植物材料
大腸桿菌克隆菌株為E. coli JM109，購(gòu)自Clontech公司。番茄野生型種子為AC+， 可通過市場(chǎng)購(gòu)買。3、培養(yǎng)基和溶液LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH調(diào)pH至7. 0，高壓 滅菌。SOB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L， IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 調(diào) pH 至 7. 0，高壓滅菌。SOC 培養(yǎng)基S0B+20mM 葡萄糖。TB buffer (臨用前配置)=IMKCl 4mL, 0. 45MMnCl22. 4mL, 0. 50M CaCl2O. 6mL,0. 50M K-MES 0. 5mL, ddH20 12. 5mL(總體積 20mL)。IOOXMg2+ 溶液:20. 33g MgCl2. 6H20 和 24. 65g MgSO4. 7H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,過濾除菌。IM KCl 溶液7. 45g KCl 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 45M MnCl2 溶液8. 9g MnCl2. 4H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 50M CaCl2 溶液7. 35g CaCl2. 2H20 定容于 IOOmL H2O,高壓滅菌。0. 50M K-MES 溶液9. 76g MES 定容于 IOOmL H2O,用 KOH 調(diào) pH 至 6. 3，過濾除菌， 分裝成0. 5mL每管，-20°C儲(chǔ)存。DMSO 分裝 200 μ 1 新鮮 DMSO，_20°C儲(chǔ)存。4、實(shí)驗(yàn)方法4. 1質(zhì)粒微量提取1)將帶有克隆載體pMD18-T質(zhì)粒(購(gòu)自大連寶生物工程公司)的E. coli JM109 接種于裝有5ml LB培養(yǎng)液(含適量抗生素)的試管中，37°C搖床培養(yǎng)12 16hr，以擴(kuò)增質(zhì) 粒。2)取1. 5 5ml的菌液，于室溫下10，OOOxg離心lmin。倒凈培養(yǎng)基，往沉淀中加 入250 μ 1的solution I/RNaseA (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)混和液，漩渦振蕩使細(xì)胞完全重新懸浮。3)往重懸混和液中加入250 μ 1 solution II (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)，輕輕翻轉(zhuǎn)試管 4 6次混和溶液，以獲得一澄清的裂解液。4)往上述混和液中加入:350ul solution III (購(gòu)自O(shè)MEGA公司)，并溫和地上下 顛倒離心管數(shù)次，直至形成白色絮狀沉淀。于室溫下10，OOOxg離心lOmin。5)取一干凈的質(zhì)粒微量分離柱置于2ml收集試管上(已備)。小心將上清轉(zhuǎn)至 質(zhì)粒微量分離柱內(nèi)，確保轉(zhuǎn)至柱內(nèi)的上清中沒有細(xì)胞雜質(zhì)沉淀。于室溫下10，OOOxg離心 lmin，使裂解液完全流過柱子。6)棄去離心甩出液，加入500 μ 1的solution HB緩沖液(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)到柱 子上，室溫下10，OOOxg離心Imin洗滌柱子，確保除去殘余的蛋白質(zhì)以得到后面操作所需的
高質(zhì)量DNA。7)棄去收集液，加入700 μ 1用無水乙醇稀釋的wash buffer緩沖液洗滌柱子，室 溫10，OOOxg離心lmin,棄去洗滌液。
8)可選做步驟重復(fù)步驟7，用700 μ 1 wash buffer緩沖液再洗滌柱子一次。9)室溫下10，OOOxg離心空柱^iin以甩干柱子基質(zhì)。10)把柱子置于一干凈的1. 5ml離心管上，直接加入30 50 μ 1滅菌去離子水或 TE緩沖液液到柱子基質(zhì)上(所加的量取決于預(yù)期終產(chǎn)物濃度)，10，OOOxg離心Imin以洗脫 出 DNA04. 2DNA回收方案1)處理瓊脂糖凝膠-EB電泳混和物以分離DNA片段。任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都 可以使用。2)在紫外燈上小心的把所需的DNA片段切下來。這樣就能保證把含DNA的凝膠盡 量多的取出來。3)通過把凝膠薄片裝在1. 5ml小離心管中稱其重量的方法，近似地確定其體積。 例如其密度為lg/ml，于是凝膠的體積便可通過如下方法得到凝膠薄片的重量為0. 2g則 其體積為0. 2mL·加入體積為凝膠體積3 4倍的NJ緩沖液，把混和物置于55 65°C水 浴中溫浴7min，或至凝膠完全融化。4)把DNA-瓊脂糖溶液加到一個(gè)Mu-Pu DNA回收純化柱上，并把柱子裝在一個(gè)干凈 的2ml收集管內(nèi)，室溫下于10，OOOxg離心lmin，棄去液體。5)選做步驟用300 μ 1 NJ緩沖液來洗滌柱子，并在10，OOOxg下離心lmin。6)用750 μ 1無水乙醇稀釋的DNA洗滌緩沖液洗滌柱子。室溫下10，OOOxg離心 lmin。7)棄去流出液，重復(fù)第6步一次。8)棄去液體，把空柱10，OOOxg離心aiiin以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。9)把柱子裝在一個(gè)干凈的1. 5ml離心管上，室溫風(fēng)干5-lOmin，使乙醇揮發(fā)殆盡。10)加入30 50μ1 (具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度)的滅菌去離子水(或者 ΡΗ8. 0的TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，10，OOOxg離心Imin以洗脫DNA04. 3番茄葉片RNA的提取1)液氮迅速研磨野生型番茄的幼嫩葉片，按50-100mg組織/ml Trizol (購(gòu)自北京 天為時(shí)代科技有限公司)加入Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5min。2) 12，OOOrpm 離心 5min。3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置!Bmin。4) 4°C 12，OOOg 離心 15min。5)取上清，按0. 5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置lOmin。6) 4°C 12，OOOg 離心 lOmin，棄上清，RNA 沉于管底。7)按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。8) 4"C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清。9)室溫干燥5-lOmin (RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。)。10)用 50ul DEPC-H2O 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin。4. 4SMART RACE1)引物合成上海invitrogen生物技術(shù)有限公司合成0080]3’ RACE GSP 1 5' ATGGGATATGCGCCTCTTGGAAGCTGGG 3’ ；
0081]5' RACE GSP 1 5' TGAGTCCTTTGCATCCCATTCTGCTCGG3‘；
0082]M13F 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，
0083]M13R 5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3‘
0084]SMART 10XUPM
0085]long(0. 4uM) 5 ‘ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘
0086]short(2uM) 5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘。
0087]2)3，RACE
0088]第一鏈合成(3，-RACE-ReadycDNA)
0089](1)取 1μ g 總 RNA( < 3μ 1)加入 1. 5ml 離心管，然后加入 1μ 1 3，-RACE CDS primerA ；
0090](2)加入無RNA酶的無菌去離子水補(bǔ)充至5 μ 1，混勻；
0091](3)在72°C孵育aiiin ；于冰上冷卻2min，瞬時(shí)離心使混合物集中在離心管底部；
0092](4)加入以下組分
0093]5XFrist-Strand Buffer2μ 1
0094]DTT (20mM)1 μ 1
0095]dNTP Mixture(IOmM))1 μ 1
0096]MMLV Reverse Transcriptase 1 μ 1
0097]Total Volume10 μ 1
0098]將以上混合物輕輕混勻，瞬時(shí)離心后于42°C孵育1.5h，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μ 1 TE緩沖液，稀釋所得產(chǎn)物；于72°C孵育7min。
0099]3，-RACE
0100](1)混合下列試劑(總體系50 μ 1)
0101]PCR-Grade Water 34.5 μ 1
0102]10XPCR buffer 5μ 1
0103]dNTP Mix(IOmM)1 μ 1
0104]Taq Polymerase1 μ 1
0105]UPM(IOX)5μ 1
0106]3' RACE GSPl(IOyM) 1 μ 1
0107]3，-RACE-Ready cDNA 2. 5 μ 1
0108]PCR 反應(yīng)
0109]94°C變性 30min, 72°C延伸 3min, 5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s, 70°C延伸 30s, 72°C延伸 3min，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，68°C退火30s, 72°C延伸3min, 27個(gè)循環(huán)。
0110]產(chǎn)物取5μ1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果，用凝膠回 收試劑盒(Omega)回收目的條帶。
0111]3)5，RACE
0112]第一鏈合成(5，-RACE-ReadycDNA)
0113](1)取 1μ g 總 RNA( < 3μ 1)加入 1. 5ml 離心管，然后加入 1μ 1 5，-RACE CDS primerA，1 μ 1 SMARTII A Oligonucleotide ；0114](2)加入foiase-Free的無菌去離子水補(bǔ)充至5 μ 1，混勻；
0115](3)在72°C孵育aiiin ；于冰上冷卻2min，瞬時(shí)離心使混合物集中在離心管底部；
0116](4)加入以下組分
0117]5XFrist-Strand Buffer2μ 1
0118]DTT (20mM)1 μ 1
0119]dNTP Mixture(IOmM))1 μ 1
0120]MMLV Reverse Transcriptase 1 μ 1
0121]Total Volume10 μ 1
0122]將以上混合物輕輕混勻，瞬時(shí)離心后于42°C孵育1.5h，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μ 1 TE緩沖液，稀釋所得產(chǎn)物；于72°C孵育7min。
0123]5，-RACE
0124](1)混合下列試劑(總體系50 μ 1)
0125]PCR-Grade Water34. 5 μ 10126]10XPCR buffer5 μ 10127]dNTP Mix(IOmM)1 μ 10128]Taq Polymerase1 μ 10129]UPM(IOX)5 μ 10130]5' RACE GSPl(IOyM)1 μ 10131]5’ -RACE-Ready cDNA2. 5μ 1
0132]PCR 反應(yīng)
0133]94°C預(yù)變性 30min, 72°C延伸 3min, 5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s, 70°C退火 30s，72°C延 伸3min, 5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，68°C退火30s, 72°C延伸3min, 27個(gè)循環(huán)。
:0134]產(chǎn)物取5μ 1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果，用凝膠回 收試劑盒(Omega)回收擴(kuò)增的基因片段。0135]4. 5目的DNA片段與克隆載體pMD18_T的連接
0136]目的DNA片段與克隆載體pMDIS-T按摩爾分子數(shù)比3/1連接，反應(yīng)體系如下
0137]IOXligase Buffer1 μ 1
0138]pMD18-T(50y g/μ 1)1 μ 1
0139]目的 DNA 片段( 150 μ g/μ 1)1μ 1
0140]T4Ligase(350U/y 1)1 μ 1
0141]ddH206 μ 1
0142]16°C連接12小時(shí)。
0143]4. 6大腸桿菌轉(zhuǎn)化
0144]1)感受態(tài)細(xì)胞的制備
0145]a)接種大腸桿菌單菌落于2mL SOB培養(yǎng)液中，37°C過夜培養(yǎng)；
0146]b)轉(zhuǎn)接0. 5mL過夜培養(yǎng)物至50mL SOB培養(yǎng)液中，18 °C劇烈震蕩18 24h至 A600 ^ 0. 55 ；
0147]c)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰浴IOmin, 4°C 4，OOOrpm離心IOmin ；
0148]d)去上清，加16mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞(注意輕輕旋轉(zhuǎn)，不要用振蕩器或吹吸混勻)，冰浴 IOmin, 4°C 4，OOOrpm 離心 IOmin ；e)去上清，加4mL預(yù)冷的TB緩沖液懸浮細(xì)胞，加入280 μ 1的DMS0，輕緩混勻，冰 浴 IOmin ；f)分裝于預(yù)冷得1. 5mLEP管中，液氮凍存。2)轉(zhuǎn)化a)從液氮中取出感受態(tài)細(xì)胞冰浴解凍；b)將10 μ 1連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30min ；c)42°C熱沖擊 90s，立即冰浴 l_2min ；d)加 0. 8mL 的 S0C,混勻，37°C溫和搖床 Ih0e)室溫13，OOOrpm離心lmin，倒掉一部分上清液，留約200 μ 1的上清液，用槍頭 將上清液與細(xì)胞混勻，涂布LB+amp (50 μ g/ml)平板，37°C培養(yǎng)過夜。4. 7細(xì)胞快速裂解法鑒定重組質(zhì)粒1)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于500 μ 1含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至 A600 為 0.6 0.8。2)取200 μ 1菌液至0. 5ml EP管中，13，OOOrpm離心lmin，去上清，留約20 μ 1上清。3)力口 20 μ 1 2 X 快速裂解液
，劇烈振蕩。4) 13，OOOrpm 離心 15min。
5)取5μ1上清直接電泳t.與對(duì)照比，電泳帶滯后的即可能是重組質(zhì)粒。
4. 8菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒
經(jīng)過快速裂解法鑒定的重組質(zhì)粒再做菌落PCR以確定插入片段是目標(biāo)片段，反應(yīng)體系如下
10XPCR Buffer2μ 1
Mg2+(1. 5mM)1. 2μ 1
dNTP Mixture(各 2. 5mM)0. 6μ 1
菌液1 μ 1
M13F0. 4μ 1
M13R0. 4μ 1
(MH2O12. 4μ 1
TaqDNA聚合酶1 μ 1
反應(yīng)條件:94°C 5min (預(yù)變性)；94°C 40s (變性)，56°C 30s (復(fù)性)，72°C 2min (延
伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72°C 5min (終延伸)。對(duì)菌落PCR確定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和拼接，所得序列為 序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。實(shí)施例2 真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能驗(yàn)證1、材料1.1實(shí)驗(yàn)材料番茄野生型種子為AC+，可通過市場(chǎng)購(gòu)買。
1.1.1主要試劑1)菌株大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a，購(gòu)自天為時(shí)代公司。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，購(gòu)自天為時(shí)代公司。2)質(zhì)粒pMD18-T 載體衍生自 pUC18，2. 692Kb，Ampr，為克隆 PCR 產(chǎn)物(ΤΑ Cloning)的專 用載體，插入位點(diǎn)為EcoRV的酶切位點(diǎn)，購(gòu)自TaKaRa。質(zhì)粒pSKint (以下簡(jiǎn)寫pSK) :Amp抗性，具有兩處多克隆位點(diǎn)。植物真核表達(dá)載體pBI121 含有選擇標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因及 β-葡萄糖苷酸酶(⑶S)基因。3)植物激素吲哚乙酸andoleacetic Acid, IAA)；激動(dòng)素(Kinetin，Kt) ；6_ 芐氨基嘌呤 (6-Benzylaminopurine, 6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone, ACE) ；2，4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4~D)。4)抗生素羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin)
5)植物DNA提取緩沖液IOOmmol/L Tris .Cl(pH8. 0)，50mmol/L EDTA(pH8. 0)，500mmol/L NaCl,10mmol/L α-巰基乙醇，10%或20% SDS。6)培養(yǎng)基與溶液酵母提取物lg/L，胰蛋白胨 5g/L，蔗糖 5g/L，MgSO4. 7H20 0. 5g/L。用 NaOH 調(diào) pH 至7.0，高壓滅菌。番茄轉(zhuǎn)化過程中所用培養(yǎng)基如下(表1)表1番茄組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基
培養(yǎng)基組成
基本培養(yǎng)基MS(IL)大量元素(20x): CaCl2 330mg； KNO3 1900mg； MgS04.7H20
370mg； NH4NO3 1650mg； KH2PO4 170 mg 鐵鹽(200x): FeS04.7H20 27.85mg； Na2-EDTA37.25mg； 有機(jī)成分(1000X):肌醇 IOOmg；煙酸(Nicotinic Acid ) 0.5mg；鹽酸吡多醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg；甘氨酸(Glycine) 2.0mg；鹽酸硫銨 0.4mg ；葉酸(FolioAcid) 25mg,生物素(Biotin ) 2mg (有機(jī)成分均過濾除菌) 微量元素(IOOOOx): KI 8.3mg； H3BO3 62mg； Na2MoO4^H2O 2.5mg； MnS04.4H20 223mg； ZnSO4.7H20 86mg； CuSO4.5H20 0.25mg； CoCl2.6H20 0.25mg 預(yù)培養(yǎng)基P MS+lmg/L 6-BA+0.04mg/L IAA pH 6.0
誘導(dǎo)培養(yǎng)基In 5ml AB鹽+2ml MES緩沖液+2ml磷酸鈉鹽緩沖液+91ml 1%葡
萄糖(100ml) pH 6.0 共培養(yǎng)基Co MS + 0.2 mg/L KH2P04 + 0.1 mg/L Kinetin + 0.2 mg/L 2,4-D +
15 mg/L 乙酰丁香酮 pH: 6.0 再生培養(yǎng)基2Z MS+500mg/L羧卞青霉素鈉+50mg/L硫酸卡那霉素+2mg/L
6-BA+0.2mg/L IAA pH 6.0
生根培養(yǎng)基R MS + 500 mg/L羧卞青霉素鈉+ 2 mg/L IAA pH 6.0注植物激素及抗生素均待培養(yǎng)基冷卻到40-50°C時(shí)加入。2、方法2. 1真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建2. 1. 1基因片段的獲得根據(jù)SEQ ID NO=I所示核苷酸序列起始密碼子下游783bp至1253bp的基因片段 設(shè)計(jì)構(gòu)建真核重組質(zhì)粒的引物如下LEHP4-F1 5' CTCGAGTCTAGATGTTGCTGATAATTTTGGATA 3‘LEHP4-R1 5' AAGCTTCAGCTCCATCATAGTTTTCACT 3‘LEHP4-F2 5' GAGCTCTGTTGCTGATAATTTTGGATA 3‘LEHP4-R2 5' GAATTCCAGCTCCATCATAGTTTTCACT 3‘以LEHP4-F1和LEHP4-R1為正向擴(kuò)增引物，以LEHP4-F2和LEHP4-R2為反向擴(kuò)增 引物，按下面的PCR反應(yīng)體系以及以下程序進(jìn)行擴(kuò)增預(yù)變性94°C 5min，變性94°C 30s，退 火溫度55°C 30s延伸72°C 40s。IOXPCRBuffer2μ 1Mg2+(1. 5mM)1. 2μ 1dNTP Mixture (各 2. 5mM) 0. 6 μ 1菌液Ιμ LEHP4-F10. 4 μ 1LEHP4-R10. 4 μ 1ddH2012. 4μ 1TaqDNA 聚合酶 Ιμ 2.1.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過與DNAmarker的比對(duì)來判斷PCR產(chǎn)物的大小2. 1. 3PCR產(chǎn)物膠回收純化DNA片段的回收純化參照Omega公司的凝膠回收試劑盒提取說明書，具體步驟如 下1)用瓊脂糖凝膠電泳目的片段，在長(zhǎng)波紫外燈下切取目的片段放入預(yù)先稱重的 1.5mL的EP管中，稱量膠的重量。按重量比1 3的比例加入溶膠/結(jié)合液DB。2)65°C水浴lOmin，膠完全融化即可，其間可震蕩助融2_3次，待融化之后置室溫 加入150 μ L異丙醇，充分混勻。3)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中，12，OOOrpm離心lmin，棄廢液。4)加入 700 μ L 漂洗液 WB, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄廢液。5)加入 500 μ L 漂洗液 WB, 12，OOOrpm 離心 lmin,棄廢液。6) 12，OOOrpm 離心 3min，棄廢液。7)向離心柱中間白膜中滴入50 μ L EB(65°C預(yù)熱)室溫放置aiiin。8) 12，OOOrpm離心2min，產(chǎn)物置于_20°C條件下保存。2. 1. 4目的基因片段與克隆載體pMDIS-T的連接(操作步驟見實(shí)施例1的4.5)2. 1. 5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(操作步驟見實(shí)施例1的4. 6)2. 1. 6菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒(操作步驟見實(shí)施例1的4. 8)對(duì)菌落PCR確定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果與基因片段進(jìn)行比對(duì)，確定所 擴(kuò)增片段為目的基因片段。2. 1. 7正向基因片段與PSK中間載體的連接將測(cè)序正確的正向基因片段和PSK中間載體，以)(ho I、Hind III進(jìn)行雙酶切后， 反應(yīng)體系如下IOXM buffer 5. O μ LXho Il.OyLHindIIIl.OyL質(zhì)粒15 μ LddH2028. Ομ L37度反應(yīng)3小時(shí)后，跑凝膠電泳回收正向基因片段和PSK載體，具體步驟見本實(shí)施 例中的2. 1. 3。正向基因片段與PSK中間載體的連接反應(yīng)體系OO μ 1)PSK7 μ 1正向基因片段10 μ 1Τ4 連接酶1 μ 110 X Τ4連接緩沖液 2 μ 1_Total20 μ 1混勻，16 °C溫育12小時(shí)。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1)將連接產(chǎn)物加入至50 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。2)42°C加熱30s后，再在冰中放置lmin。3)加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min。4)在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)。5)挑選白色單菌落，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆。2. 1. 8反向基因片段與已連有正向基因片段的PSK中間載體的連接將測(cè)序正確的反向基因片段和PSK中間載體，以Mc I、EcoR I進(jìn)行雙酶切后，反 應(yīng)體系如下IOXM buffer 5. 0 μ LSac Il.OyLEcoR Il.OyL質(zhì)粒15 μ LddH2028. 0 μ L37度反應(yīng)3小時(shí)后，跑凝膠電泳回收反向基因片段和PSK載體，具體步驟見實(shí)例2 的 2. 1.3。反向基因片段與PSK中間載體的連接反應(yīng)體系OO μ 1)PSK7 μ 1反向基因片段10 μ 1Τ4 連接酶1 μ 110 X Τ4連接緩沖液 2 μ 1_Total20 μ 1混勻，16°C溫育12小時(shí)。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1)將連接產(chǎn)物加入至50 μ 1 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min?！?2°C加熱30s后，再在冰中放置lmin。3)加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min。4)在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)。5)挑選白色單菌落，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆。2. 1. 9真核重組質(zhì)粒的獲得將含有正向基因片段和反向基因片段的PSK中間載體用)(ba I和Mc I酶切，同 時(shí)將pBI121真核載體用)(ba I和Mc I酶切，切除載體中⑶S基因，回收切除⑶S基因的 大片段載體部分。酶切反應(yīng)的反應(yīng)體系如下IOXM buffer5. 0 μ LXba Il.OyLSac Il.OyL質(zhì)粒15 μ LddH2028.0 μ L 37度反應(yīng)3小時(shí)后，跑凝膠電泳回收含有正向和反向基因片段的部段以及，回收的具體步驟見實(shí)例2的2. 1. 3。正向和反向基因片段的部段與pBI121載體的連接反應(yīng)體系QO μ 1)PBI7 μ 1正向和反向基因片段 10 μ 1Τ4 連接酶1 μ 110 X Τ4連接緩沖液2 μ 1_Total20 μ 1混勻，16 °C溫育12小時(shí)。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1)將連接產(chǎn)物加入至50 μ 1 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。2)42°C加熱30s后，再在冰中放置lmin。3)加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min。4)在含有硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)。5)挑選白色單菌落，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆。通過以上操作，獲得真核重組質(zhì)粒，命名為pBI_HP4RNAi (如圖2所示)。2. 2農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1)挑取農(nóng)桿菌單菌落于2ml的YEB液體培養(yǎng)基(含Rif50 μ g/ml)中，28°C振蕩培 養(yǎng)過夜；2)取過夜培養(yǎng)液500 μ 1轉(zhuǎn)接于50ml YEB (含Rif50 μ g/ml)液體培養(yǎng)基中，28°C 振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5 ；3) 40C 5000rpm離心5min收集菌體，加IOml 0. 15M的NaCl溶液懸浮菌體，冰浴 IOmin ；4) 40C 5000rpm離心5min收集菌體，用Iml預(yù)冷的20mM CaCl2溶液懸浮菌體，冰 浴 IOmin ；5)制備好的細(xì)胞立即使用，或分裝成200 μ 1/管，液氮中速凍lmin，置_70°C保存2. 3農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化1)取200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍；2)加1 μ g構(gòu)建好的pBI-HP4RNAi真核重組質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴30min ；3)液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培養(yǎng)基，28°C慢速振蕩培養(yǎng) 4h ； 4)將培養(yǎng)物涂布于含50 μ g/ml硫酸卡拉霉素和50 μ g/ml利福平的YEB平板上， 培養(yǎng)約48h。2. 4農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆的鑒定挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于含50 μ g/ml Kan和50 μ g/ml Rif的YEB液體 培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。2. 5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄將構(gòu)建好的真核重組質(zhì)粒pBI_HP4RNAi轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中備用。
用10%次氯酸鈉浸泡番茄種子lOmin，再用無菌水清洗4 5次，用無菌濾紙吸干 種子表面水分后于1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25°C，暗培養(yǎng)4d左右，露白后轉(zhuǎn)置于光照下，光照 15001x，16h/d，在其第一片真葉長(zhǎng)出前取下子葉，置于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d。轉(zhuǎn)化法采用葉盤 法。將帶有目的基因的農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)，5000r/min, 5min,室溫下離心，去除上清液，用 誘導(dǎo)培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌稀釋至OD = 0. 1，將預(yù)培養(yǎng)2d的子葉浸入其中10 15min，倒掉菌液 將子葉置于無菌濾紙上，吸干多余菌液后轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d。然后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基上 繼代篩選培養(yǎng)，每3周換一次培養(yǎng)基，待不定芽長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上 生根。等根發(fā)育好后，移出，溫室盆栽。在轉(zhuǎn)基因植株在生根培養(yǎng)基上生根的同時(shí)，培育一 些野生型番茄植株，作為轉(zhuǎn)基因番茄植株的對(duì)照。2. 6轉(zhuǎn)基因植株的鑒定2. 6. 1轉(zhuǎn)基因番茄的基因組DNA的提取(1)取IOOmg新鮮的轉(zhuǎn)基因番茄葉片，在添加液氮狀況下研成細(xì)粉，分裝于 1. 5mL印pendorf管中，每管加入500μ L 65 °C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液(IOOmmol/L Tris-Hcl pH8. 0, 20mmol/LEDTApH 8· 0，1. 4mol/LNaCl，40mmol/L2_ 巰基乙醇，2% CTAB)混 勻。(2) 65°C水浴保溫60min，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿。(3)5000g離心lOmin，取上清液，加入等體積的異丙醇，室溫放置15min，沉淀DNA。(4) 12000g離心lOmin，棄上清留沉淀，用70%乙醇至少洗兩遍，吹干沉淀。(5)將沉淀溶于 200 μ L TE 中，加入 RNase A (10mg/mL)，37°C保溫 30min，加入等體 積的酚/氯仿，混勻。(6) 12000g離心lOmin，取上清，加入1/10體積3mol/LNaAc和2. 5倍體積的無水 乙醇，室溫放置IOmin。(7) 12000g離心lOmin，棄上清，用70%乙醇沖洗后吹干沉淀，溶于20 μ L滅菌雙蒸 水中。2. 6. 2野生型番茄的基因組DNA的提取操作步驟同2. 6. 12. 6. 3轉(zhuǎn)基因番茄基因組DNA的PCR檢測(cè)為了確定重組質(zhì)粒的T-DNA區(qū)已經(jīng)整合到番茄基因組中，以野生型番茄和轉(zhuǎn)基因 番茄基因組DNA為模板，對(duì)番茄卡那霉素抗性標(biāo)記基因(NPTII)進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增?？敲?素抗性基因特異引物為NPTII-Fl和NPTII-R1。NPTII-Fl :5，-TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3，NPTII-Rl :5，-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增-MV 5min (預(yù)變性)；94°C 40s (變性)，60°C 40s (復(fù)性)， 72 0C Imin (延伸)，所述變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72°C 5min (終延伸)；電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。2. 7番茄果實(shí)番茄紅素的提取和測(cè)定番茄紅素的提取采用石油醚浸提法(番茄紅素見光易分解，提取時(shí)采用棕色瓶及 在暗室內(nèi)操作進(jìn)行避光)。取3株轉(zhuǎn)pBI-HP4RNAi基因番茄植株的成熟果實(shí)，分別搗碎成泥 狀，取5g，加入25ml蒸餾水，混勻，再加入25ml石油醚，充分混合，靜置30min，分液，吸取上層，加入25ml石油醚，再分液，抽慮后取3ml在472nm下測(cè)其吸光值(A)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公 式，求出番茄紅素的含量。2. 8番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品l.Omg，用1.0ml 二氯甲烷充分溶解后，以石油醚定容至 50ml，然后迅速將上述番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度，在472nm處測(cè)其吸光值，并以吸光 值(A472)對(duì)番茄紅素濃度作圖，得到番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線(圖3)。3、結(jié)果3. 1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定通過對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄基因組DNA進(jìn)行PCR分析可知，轉(zhuǎn)基因番茄植株的DNA經(jīng)PCR擴(kuò) 增得到與預(yù)期大小一致的857bp的條帶，而非轉(zhuǎn)基因番茄則無目標(biāo)條帶出現(xiàn)，如圖4所示。 說明真核重組質(zhì)粒已經(jīng)整合到番茄植株的基因組DNA中。3. 2轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi番茄的結(jié)果及分析3. 2. 1轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi基因影響植物的形態(tài)轉(zhuǎn)基因的番茄植株與同一時(shí)期的野生型番茄植株相比明顯出現(xiàn)矮化，如圖5所3. 2. 2轉(zhuǎn)基因番茄植株的葉片及果實(shí)色素加深實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的番茄植株果實(shí)的綠肩顏色比野生型番茄植株果實(shí)更綠 (見圖6中的A、C)。由于番茄紅素主要在果實(shí)的質(zhì)體和葉綠體中合成，故在果實(shí)成熟后，番 茄紅素含量也明顯增加(見圖6中的B、D)。3. 2. 3轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)番茄紅素含量的變化利用分光光度計(jì)法對(duì)三株不同的轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi基因的番茄植株和野生型番茄 植株的番茄果實(shí)的番茄紅素含量進(jìn)行測(cè)定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出番茄紅素的含量，結(jié) 果如圖7所示。從圖7可以看出，轉(zhuǎn)pBI-HP4RNAi基因的番茄植株a比野生型的高出23%， 轉(zhuǎn)pBI-HP4RNAi基因的番茄植株b比野生型的高出16%，轉(zhuǎn)pBI_HP4RNAi基因的番茄植株 c比野生型的高出30%。測(cè)定結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)pBI-HP4RNAi基因的番茄果實(shí)中，番茄紅素的 含量明顯增加，因而說明本發(fā)明所述真核重組質(zhì)?？稍谔岣叻压麑?shí)色素積累中應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種真核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的基因 片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游783bp至1253bp的核苷酸 序列，所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基 因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核重組質(zhì)粒，其特征在于所述真核表達(dá)載體為PHB、 pM0N1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI121 中的一種。
3.一種真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于步驟如下(1)在序列表中SEQID NO :1所示核苷酸序列中選擇一段基因片段，所選擇的基因片 段是位于起始密碼子下游783bp至1253bp的核苷酸序列，將所述基因片段正向插入到質(zhì)粒 PSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中間載 體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK中間載體上含有正向插入與反向插入的基因片段的部 分，然后連接到真核表達(dá)載體上，即獲真核重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于所述真核表達(dá)載體為 pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI 121 中的一種。
5.權(quán)利要求1或2所述真核重組質(zhì)粒在提高番茄果實(shí)色素積累中的應(yīng)用。
全文摘要
一種真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成，所述基因片段是位于起始密碼子下游783bp至1253bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表達(dá)載體，正向插入的基因片段與反向插入的基因片段之間存在有150bp的內(nèi)含子。制備方法如下(1)在序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列中選擇上述基因片段并將其正向插入到pSK載體上形成中間載體，再將該基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK載體；(2)利用限制性內(nèi)切酶切下pSK載體上含有所述基因片段的部段連接到真核表達(dá)載體上。實(shí)驗(yàn)表明，所述真核重組質(zhì)粒可在提高番茄果實(shí)色素積累中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102121028SQ20101059828
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者喬麥菊, 馮媛媛, 劉永勝, 劉繼愷, 唐曉鳳, 曹穎, 牛向麗, 高永峰 申請(qǐng)人:四川大學(xué)