r>[0031] 3、對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，具體操作步驟如下：
[0032] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0033] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0034] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min ;
[0035] 4)樣品電泳，吸取7uL PCR產(chǎn)物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性4min30s后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4°C，35W，電泳6-7h ;
[0036] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0037] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0038] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0039] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0040] 下面結(jié)合實(shí)例對發(fā)明做進(jìn)一步說明：
[0041] 利用Betal085E2F/Betal085E2R引物對不同揚(yáng)子鱷個(gè)體MHC基因進(jìn)行擴(kuò)增：
[0042] 1. DNA提取：從-20 °C冰箱中取出加有EDTA抗凝的揚(yáng)子鱷血液樣品，解凍，取 20 μ L于1. 5mL離心管中，消化過夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液樣品中的基因組DNA。用 分光光度計(jì)檢測提取所得DNA溶液的濃度，用1 %瓊脂糖凝膠電泳配合DL2000DNA marker 檢測提取所得DNA片段的長度范圍及質(zhì)量，取些許DNA原液稀釋至濃度約為200ng/ μ L的 稀釋液，-20°C條件下保存。
[0043] 2. PCR擴(kuò)增：以合格的DNA稀釋液為模板，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的Betal085E2F/ Betal085E2R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10 yL :揚(yáng)子鱷基因組DNA稀釋液0. 8 yL， 上下游引物各〇·2 μ L，超純水4.4 μ L，2 XUltraTaq Master Mix 4.4 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 °C預(yù)變性5分鐘，95 °C變性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共34個(gè)循環(huán)，最后72 °C 延伸10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳配合DL2000DNA marker檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果顯 示，該對引物均能在揚(yáng)子鱷DNA樣品中順利擴(kuò)增得到明亮的單一條帶，展現(xiàn)了穩(wěn)定的位點(diǎn) 特異擴(kuò)增能力。
[0044] 3.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分型，步驟如下：
[0045] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0046] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0047] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，在35W功率下預(yù)電泳 20min ；
[0048] 4)樣品電泳，吸取7uL PCR產(chǎn)物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性4min30s后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4°C，35W，電泳6h30min ;
[0049] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0050] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0051] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0052] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0053] 4.讀取的SSCP分型結(jié)果如圖2顯示，揚(yáng)子鱷MHC基因在Betal085E2F/ Betal085E2R擴(kuò)增位點(diǎn)上顯示出三種不同的帶型，根據(jù)帶型可分為AA型，BB型以及AB型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一對用于揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的II類MHC基因的單位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物，引物的 名稱及具體序列下： 上游引物：Betal085E2F:CTCTGCCCAGTAGGAGCCGTGC; 下游引物：Betal085E2R:AACAAAGACCCCAGGAATCCAG。2. -種揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的II類MHC基因的分型方法，其特征在于采用權(quán)利要求 1所述PCR引物對，進(jìn)行PCR反應(yīng)，每對引物均在10μLPCR體系中進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增，然后 將擴(kuò)增產(chǎn)物分別利用SSCP進(jìn)行基因分型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的10μLPCR體系為：揚(yáng)子鱷個(gè)體基因 組0嫩0.8 4 1^，上下游引物各0.2 4 1^，超純水4.4 4 1^，2\1]1七抑丁&9]\&18七6『]\^叉4.4 4 1^。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分 鐘，95 °C變性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共34個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、銀染后以 及顯色后應(yīng)分別使用雙蒸水洗膠4次，以獲得清晰的SSCP條帶。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型的方法是： 1) 用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝板，將 間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上； 2) 制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板間，確 認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置； 3) 待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用裝滿 0. 5XTBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min; 4) 樣品電泳，吸取7uLPCR產(chǎn)物，加入4uL2Xloadingbuffer，快速離心混合，95°C變 性4min30s后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4°C，35W，電泳6-7h; 5) 將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒入 500mL雙蒸水洗膠4次； 6) 加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速洗膠 4次； 7) 加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入500mL固 定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次； 8) 讀取條帶，確定基因型。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一對用于擴(kuò)增揚(yáng)子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物基因的單位點(diǎn)特異性引物及分型方法，引物的具體序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.2所示。本發(fā)明的擴(kuò)增引物，在揚(yáng)子鱷種群內(nèi)具有穩(wěn)定的單位點(diǎn)特異擴(kuò)增能力，其擴(kuò)增得到產(chǎn)物可以通過后續(xù)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(single？strand？conformation？polymorphism,SSCP)實(shí)驗(yàn)對不同的個(gè)體進(jìn)行基因分型，實(shí)現(xiàn)對種群中揚(yáng)子鱷個(gè)體Ⅱ類MHC基因多態(tài)性的評估，檢測其抵抗細(xì)菌性疾病的潛力，為揚(yáng)子鱷保護(hù)工作中的新種群奠基者選擇、野化放歸個(gè)體選擇以及人工配對等工作提供重要參考。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105316409
【申請?zhí)枴緾N201510738232
【發(fā)明人】方盛國, 萬秋紅, 翟騰
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月3日