揚子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的ⅱ類mhc基因的特異性引物及分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一對用于擴增揚子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的II類主要組織相容性復(fù)合物 (major histocompatibility complex, MHC)基因序列的單位點特異性引物及分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 揚子鱷（Alligator sinensis，F(xiàn)auvel)屬于爬行綱，鱷目，鼉科，短吻鱷亞科，鼉 屬，是一種古老的動物，起源于二億三千萬年前的三疊紀(jì)，被稱為爬行動物中的"活化石"， 為我國特有珍稀瀕危動物、國家一級重點保護(hù)動物（1972)，在《瀕危動植物國際貿(mào)易公約》 (CITES)中被列入附錄I，同時被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN)歸為極度瀕危物種，是現(xiàn)存鱷 類中受到威脅最大、最為瀕危的物種之一。目前野生揚子鱷的數(shù)量僅約100條。
[0003] 約2. 3億年前，揚子鱷的祖先與地球曾經(jīng)的霸主恐龍生活在同樣的環(huán)境中。然而， 強大的恐龍在6500萬年前神秘消失，鱷魚卻奇跡般生存了下來，并繁衍至今。作為一種古 老的爬行動物，揚子鱷無論是形態(tài)還是行為上都保留著爬行類祖先的許多特征，是古生物 學(xué)、物種演化過程研究中不可或缺的一個物種。
[0004] 主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex, MHC)為存在于脊 椎動物染色體特定區(qū)域的一組連鎖基因群，在脊椎動物免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用，其編碼 的免疫細(xì)胞表面受體種類豐富，是免疫系統(tǒng)中呈遞抗原和調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中的 重要作用因子。根據(jù)所呈遞抗原類型的不同，MHC可以分為兩大類：I類和II類，其中II類 MHC基因所編碼蛋白的抗原結(jié)合區(qū)主要識別并結(jié)合外源性抗原（如細(xì)菌）的多肽，并將其呈 遞給CD4+T細(xì)胞，并啟動后續(xù)的免疫反應(yīng)。因此，II類MHC的抗原結(jié)合區(qū)（外顯子2)普遍具 有高度多態(tài)性，II類MHC抗原結(jié)合區(qū)多態(tài)性高的個體能夠更好的抵抗細(xì)菌性疾病。保護(hù)工 作者在進(jìn)行新建種群選擇奠基者與野外放歸選擇適應(yīng)性能力強的個體等工作時，可以根據(jù) MHC基因的多態(tài)性高低進(jìn)行科學(xué)地選擇，在圈養(yǎng)種群進(jìn)行人工配對時，亦可以選擇具有不同 等位基因的個體配成一對從而提高子代的多態(tài)性，增強子代對細(xì)菌性疾病的抵抗力。
[0005] 在已有的揚子鱷MHC文獻(xiàn)中，均是利用通用引物進(jìn)行MHC基因的位點交叉擴增，其 結(jié)果只能用于簡單的進(jìn)化分析。本發(fā)明涉及的II類MHC引物均經(jīng)過大量實驗重復(fù)驗證，不 僅能在揚子鱷種群中順利擴增，展現(xiàn)出穩(wěn)定的單位點特異性擴增能力，還能通過后續(xù)的單 鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)對揚子鱷II類MHC基因進(jìn)行基因分型，有效幫助我們評估種群中II類 MHC多態(tài)性，這對揚子鱷保護(hù)工作無疑帶來了極大的便利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一對用于擴增揚子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的II類MHC基因序列的 引物及其分型方法。
[0007] -對用于擴增揚子鱷II類MHC基因的單位點特異性引物，引物具體序列為：
[0008] Betal〇85E2F :CTCTGCCCAGTAGGAGCCGTGC(如 SEQ ID NO: 1 所示）；
[0009] Betal085E2R :AACAAAGACCCCAGGAATCCAG(如 SEQ ID NO:2 所示）。
[0010] 本發(fā)明還公開了一種揚子鱷抗細(xì)菌潛力檢測的II類MHC基因的分型方法，即采用 上述引物，用10 μ LPCR體系在特定擴增條件下進(jìn)行目標(biāo)片段擴增，然后將擴增產(chǎn)物分別利 用SSCP進(jìn)行基因分型。
[0011] 所述的lOyLPCR體系為：揚子鱷基因組DNAO. 8yL，上下游引物各0. 2yL，超純水 4. 4 μ L, 2XUltraTaq Master Mix 4. 4yL〇
[0012] 所述擴增引物的PCR反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，63°C退火30 秒，72°C延伸30秒，共34個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0013] PCR結(jié)束后，均使用1 %的瓊脂糖凝膠加 DL2000marker對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測， 合格的產(chǎn)物存放于4°C冰箱。
[0014] 所述引物的擴增片段長度為364bp。
[0015] 所述對揚子鱷II類MHC序列特定位點利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)基因分型的方 法是：
[0016] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0017] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0018] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min ;
[0019] 4)樣品電泳，吸取7uL PCR產(chǎn)物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性4min30s后迅速置于冰上，并用槍及時加入點樣孔內(nèi)，4°C，35W，電泳6-7h ;
[0020] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0021] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0022] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0023] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0024] 采用上述技術(shù)方案，可以有效擴增得到揚子鱷MHC基因座位，而且不會交叉擴增 不同座位的等位基因或者產(chǎn)生無效等位基因。同時能對揚子鱷不同群體、同一群體內(nèi)不 同個體進(jìn)行MHC基因分型，其擴增得到產(chǎn)物可以通過后續(xù)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測（single strand conformation polymorphism, SSCP)實驗對不同的個體進(jìn)行基因分型，實現(xiàn)對種群 中揚子鱷個體II類MHC基因多態(tài)性的評估，檢測其抵抗細(xì)菌性疾病的潛力，為揚子鱷保護(hù) 工作中的新種群奠基者選擇、野化放歸個體選擇以及人工配對等工作提供重要參考。另外， 采用本技術(shù)方案，在涉及樣本數(shù)較多的情況下，能迅速、高效地對不同個體II類MHC等位基 因進(jìn)行SSCP分型，然后再對其中帶型不同個體的基因進(jìn)行測序，既避免了大規(guī)模測序所帶 來的浪費，也能縮短實驗周期。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明引物Betal085E2F/Betal085E2R對七個不同揚子鱷個體進(jìn)行PCR擴 增的電泳檢測結(jié)果。參照分子量標(biāo)注依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0026] 圖2是對十二個不同揚子鱷個體MHC基因的Betal085E2F/Betal085E2R擴增位點 PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分型后所得電泳結(jié)果。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明的一對用于擴增揚子鱷II類主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex, MHC)基因序列的引物，其基礎(chǔ)為前期通過BAC測序所獲得 的MHC基因片段，根據(jù)MHC基因內(nèi)含子有較大差異性的特點，使用Primer Premier 5設(shè)計 位點特異性引物。在過程中曾設(shè)計出多對引物，經(jīng)實驗結(jié)果表明本發(fā)明的引物為最優(yōu)。
[0028] 應(yīng)用本發(fā)明引物擴增揚子鱷MHC基因并進(jìn)行分析的具體方法如下：
[0029] 1、通過酚-氯仿抽提法提取待測揚子鱷血液樣品的DNA，作為模板；
[0030] 2、將提取合格的DNA進(jìn)行PCR擴增，lOyLPCR反應(yīng)體系為：揚子鱷血液基因組 0嫩0.8 4 1^，上下游引物各0.2 4 1^，超純水4.4 4 1^，2\1]1七抑丁&9]\&18七6『]\^叉4.4 4 1^。？0? 反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性5分鐘，95 °C變性30秒，63 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，34個循 環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，產(chǎn)物4°C保存?zhèn)溆谩?b