一種基于下一代測序技術(shù)檢測hbv耐藥突變位點的引物、方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因組學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及一種基于下一代測序技術(shù) 檢測HBV耐藥突變位點的引物、方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] HBV基因組在復(fù)制過程中，在經(jīng)過RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中，因 RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄 酶缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，使病毒基因的復(fù)制過程中極易發(fā)生核苷酸的錯配，因此，HBV是一 種變異性極高的病毒。在機(jī)體自身、藥物和病毒的多重作用下，HBV DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活 性區(qū)（RT區(qū)）會發(fā)生多種耐藥突變。耐藥突變不僅會降低抗病毒治療的效果，還會使乙型 肝炎進(jìn)一步進(jìn)展、惡化。HBV基因變異及其導(dǎo)致的藥物靶位氨基酸的替代是導(dǎo)致病毒耐藥的 基礎(chǔ)，所以對HBV耐藥突變位點的檢測極具臨床意義。
[0003] 目前HBV耐藥突變位點的檢測方法主要有PCR-測序法（sanger測序法）、 real-time PCR法、Pyrosequencing焦磷酸測序技術(shù)、基因芯片法、PCR-限制性片段長度多 態(tài)性分析法（RFLP)等。其中，PCR-測序法可以同時檢測多個耐藥位點的突變及未知突變， 假陽性率低，是臨床上應(yīng)用的主要方法，但其靈敏度低（變異菌株超過HBV準(zhǔn)種池20% )， 難以檢測各突變位點發(fā)生變異率，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。real-time PCR法雖然靈敏度高， 但只能檢測已知、單一位點的變異。RFMP和基因芯片法，價格昂貴、操作繁瑣、數(shù)據(jù)分析工作 量大、存在堿基錯配等缺點，較適合研究目的，不太適合臨床應(yīng)用。Pyrosequencing焦磷酸 測序技術(shù)可以全面快速檢測突變位點，且準(zhǔn)確靈敏。
[0004] 劉玲等在《中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志》，2013年第23卷第3期，報道了一種巢式PCR聯(lián) 合焦磷酸測序檢測乙肝病毒耐藥基因的方法。針對HBV P基因 RT區(qū)的8個耐藥位點，在其 上下游分別設(shè)計兩對特異性引物，構(gòu)建巢式PCR擴(kuò)增體系，結(jié)合焦磷酸測序8個耐藥位點的 檢測。
[0005] 然而，在運(yùn)用巢式PCR的過程中，需要設(shè)計2對引物，進(jìn)行2輪PCR，以提高擴(kuò)增特 異性。發(fā)明人在實踐中發(fā)現(xiàn)，很多巢式PCR產(chǎn)物加 Adaptor后，片段長度差異不明顯，且數(shù) 目多，在瓊脂糖凝膠電泳中很難分離，嚴(yán)重影響下一代測序在HBV耐藥突變位點檢測中的 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點 的引物、方法及應(yīng)用。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點的引 物，包括引物對，所述引物對為如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示的核苷酸序列，或 為如SEQUENCE N0. 3和SEQUENCE N0. 4所示的核苷酸序列。
[0008] 具體地，
[0009] SEQUENCE NO. 1(5, -3,）：TGTWTCCCTCHTGTTGCTGT ;
[0010] SEQUENCE NO. 2(5, -3,）：TGRCAKACYTTCCAATCAATAG ;
[0011] SEQUENCE NO. 3 ：CHTGTTGCTGTACAAAACCT ；
[0012] SEQUENCE NO. 4 ：GCAGGATAWCCACATTG〇
[0013] 如本發(fā)明所述地，堿基"1、!1、1?、1(、￥"為本領(lǐng)域常規(guī)含義，其中，1 = 4/1'，!1 = 4/(：/ T，R = A/G，K = G/T，Y = C/T〇
[0014] 本發(fā)明提供的引物對用于擴(kuò)增HBV RT片段（HBV552~HBV992)，覆蓋了 10個耐藥 突變位點。其中，SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示引物對的具體信息如下表1所示：
[0015] 表1用于HBV基因型突變的引物序列
[0017] 優(yōu)選地，所述HBV耐藥突變位點為乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位點中的至少一種。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 HBV 耐藥突變位點為 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一種。
[0019] 第二方面，本發(fā)明提供了一種基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點的方 法，包括以下步驟：
[0020] 1)取待測樣品，配置PCR體系進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增；其中，PCR體系中的引物對為如 SEQUENCE NO. 1 和 SEQUENCE N0. 2 所示的核苷酸序列，或為如 SEQUENCE N0. 3 和 SEQUENCE NO. 4所示的核苷酸序列；
[0021 ] 2)純化一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行測序，檢測文庫中的HBV耐藥突變位點。
[0022] 優(yōu)選地，所述HBV耐藥突變位點為乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位點中的至少一種。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 HBV 耐藥突變位點為 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一種。
[0024] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述待測樣品為抽提得到的HBV DNA。
[0025] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述引物對為如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE NO. 2所示的核苷酸 序列，或者是如SEQUENCE NO. 3和SEQUENCE NO. 4所示的核苷酸序列。
[0026] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，一輪PCR擴(kuò)增時，SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2的 使用濃度分別為〇. 25 μ Μ和0. 25 μ Μ。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，一輪PCR為溫度梯度PCR，溫度梯度優(yōu)選-1°C /cycle，共 lOcycles。退火溫度最高優(yōu)選為65°C。
[0028] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述一輪PCR的程序設(shè)置如下：
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中，采用如下任一一種方法進(jìn)行測序：
[0031] (2-a)取純化后的一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建下一代測序文庫；并采用下一代測序技 術(shù)檢測文庫中的HBV耐藥突變位點；或
[0032] (2-b)直接取純化后的一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序。
[0033] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（2-a)中，取純化后的一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建下一代測序 文庫的步驟為：對純化后PCR產(chǎn)物分別添加堿基A、二代測序公司接頭序列、二代測序公司 標(biāo)簽序列，獲得所述的下一代測序文庫。
[0034] 優(yōu)選地，所述步驟（2-a)中，所述的下一代測序技術(shù)采用Illumina測序平臺，特別 適用于Miseq測序或Hiseq測序平臺。
[0035] 第三方面，本發(fā)明提供一種基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點的試劑 盒，包括如下引物對，所述的引物對為如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示的核苷酸序 列，或為如SEQUENCE N0. 3和SEQUENCE N0. 4所示的核苷酸序列。
[0036] 優(yōu)選地，所述HBV耐藥突變位點為乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位點中的至少一種。
[0037] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 HBV 耐藥突變位點為 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一種。
[0038] 第四方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥 突變位點的引物、如第二方面所述的基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點的方法或 如第三方面所述的基于下一代測序技術(shù)檢測HBV耐藥突變位點的試劑盒在檢測HBV耐藥突 變位點中的應(yīng)用。
[0039] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案中，特別針對下一代測序平臺設(shè)計的引物對只需要1輪 PCR，具有較高的穩(wěn)定性、特異性和靈敏度；在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，PCR產(chǎn)物加 Adaptor后，片段長度差異明顯，僅2個條帶，在瓊脂糖凝膠電泳中非常容易區(qū)分（片段長度 為441bp，加接頭后為565bp)。
[0040] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案適合采用下一代測序平臺進(jìn)行HBV耐藥突變位點的檢測， 尤其適合Illumina測序平臺，特別適用于Miseq測序或Hiseq測序平臺。
【附圖說明】
[0041 ] 圖1是實施例2的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0042] 圖2是實施例3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；