[0043] 圖3是實(shí)施例4的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0044] 圖4是實(shí)施例4的生物信息學(xué)測(cè)序深度分析結(jié)果；
[0045] 圖5是對(duì)比實(shí)施例1的巢式PCR分析圖；
[0046] 圖6是對(duì)比實(shí)施例1的Sanger測(cè)序圖譜結(jié)果；
[0047] 圖7是對(duì)比實(shí)施例2的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0048] 圖8是對(duì)比實(shí)施例2的生物信息學(xué)測(cè)序深度分析結(jié)果；
[0049] 圖9是對(duì)比實(shí)施例2的生物信息學(xué)測(cè)序深度對(duì)比分析結(jié)果；
[0050] 圖10是對(duì)比實(shí)施例2對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多樣性分析結(jié)果；
[0051 ] 圖11是對(duì)比實(shí)施例3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0052] 圖12是效果實(shí)施例的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054] 本發(fā)明實(shí)施例中無(wú)特別說(shuō)明外，所用試劑及耗材均為市售商品。
[0055] 一輪 PCR
[0056] 實(shí)施例1
[0057] -種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)的方法，一輪PCR包括以下步驟：
[0058] 1、設(shè)計(jì)并合成如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示的引物；
[0059] 2、擴(kuò)增HBV RT DNA片段（HBV552~HBV992)，包含了 10個(gè)耐藥突變位點(diǎn)
[0060] 配置PCR體系如下（DNA模板為從HBV患者200ul血清中提取的DNA，提取試劑盒 使用 qiagen 的 blood mini kit)：
[0061]
[0062] 將配置的體系按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：
[0065] PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物富集片段的大小，選取 441bp的目的片段進(jìn)行切膠回收，純化至34 μ L，其中，純化步驟為：
[0066] 1)向凝膠中加入3倍體積的Buffer QG (常規(guī)DNA回收緩沖液）；
[0067] 2) 50°C孵化 lOmin，溶膠；
[0068] 3)過(guò)柱，13000rmp，離心 lmin ;
[0069] 4)加入 500ul Buffer QG，反應(yīng) lmin，13000rmp，離心 lmin ;
[0070] 5)加入 750ul Buffer PE，靜置 2min，13000rmp，離心 lmin ;
[0071] 6)倒去濾液，13000rmp，空甩 lmin ;
[0072] 7)換新的1. 5ml離心管，瞭干，8min ;
[0073] 8)加入 Elute 40ul ;
[0074] 將8)的水甩下來(lái)再加進(jìn)去洗一次，得PCR產(chǎn)物。
[0075] 實(shí)施例2
[0076] -種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)的方法，一輪PCR的步驟包括：除 PCR程序與實(shí)施例1不同外，其他步驟均與實(shí)施例1相同，其中，本實(shí)施例2的PCR程序如 下：
[0078] 實(shí)施例1和實(shí)施例2使用了相同的引物對(duì)。
[0079] PCR產(chǎn)物純化后，取等體積的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示。在圖1中，A-1是實(shí) 施例1的PCR產(chǎn)物純化后的結(jié)果，A-2是實(shí)施例2的PCR產(chǎn)物純化后的結(jié)果。由圖1可知， 從特異性和產(chǎn)物量來(lái)看，A-1的效果優(yōu)于A-2。
[0080] 實(shí)施例3
[0081 ] -種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)的方法，一輪PCR的步驟包括：除 PCR引物對(duì)與實(shí)施例1不同外，其他步驟（即一輪PCR反應(yīng)體系和程序等條件）均與實(shí)施例 1相同，其中，本實(shí)施例3的PCR引物對(duì)如下SEQUENCEN0. 3和SEQUENCE N0. 4所示：
[0082] SEQUENCE NO. 3 ：CHTGTTGCTGTACAAAACCT
[0083] SEQUENCE NO. 4 ：GCAGGATAWCCACATTG
[0084] PCR產(chǎn)物純化后，取等體積的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示。在圖2中，1-1是實(shí) 施例1的PCR產(chǎn)物純化后的結(jié)果，1-2是實(shí)施例3的PCR產(chǎn)物純化后的結(jié)果。由圖1可知，從 特異性和產(chǎn)物量來(lái)看，1-1的濃度明顯高于1-2,所以后期繼續(xù)采用1-1引物進(jìn)行建庫(kù)（實(shí) 施例4)。
[0085] 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建
[0086] 實(shí)施例4
[0087] -種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)的方法，建庫(kù)的步驟包括：
[0088] 1、取實(shí)施例1純化后的PCR產(chǎn)物3'末端加 A尾，配置體系如下（其中，Klenow exo-購(gòu)自 NEB，貨號(hào)：M0212):
[0090] 將該體系置于37°C下30min。利用膠純化試劑盒純化加 A尾的PCR產(chǎn)物。
[0091] 2、測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建
[0092] 在DNA兩端加上測(cè)序用的接頭，配置下述體系（其中，Quick ligase購(gòu)自NEB， M2200L)：
[0094] 其中，Adaptor的序列如下所示：
[0095] 5 ' -/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTACACGA CGCTCTTCCGATOT-3'。
[0096] 隨后將該體系置于20°C下15min。然后加入3 yL的USER，37°C放置15min。最后 通過(guò)膠回收試劑盒純化連接產(chǎn)物。
[0097] 3、產(chǎn)物上加入測(cè)序用的標(biāo)簽序列，配置體系如下（具體步驟參照illumina高通量 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建說(shuō)明書(shū)）
[0099] 將配置的體系按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：
[0100]
[0101] PCR結(jié)束后，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物富集片段的大小，選取565bp 的目的片段進(jìn)行切膠回收，并純化至30 μ L。
[0102] 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖3所示。在圖3中，Τ1泳道可以明顯看到在500bp-600bp 之間有一條帶，為加上接頭的片段（564bp，箭頭所指處），與理論相符，即一輪PCR產(chǎn)物加接 頭后，長(zhǎng)度會(huì)漂移（shift)約124bp，即膠圖上的DNA條帶會(huì)增大約124bp。
[0103] 由圖3可知，本發(fā)明一輪PCR特異性非常高，PCR產(chǎn)物加堿基A，加接頭后，僅1個(gè) 條帶，非常容易分離。
[0104] 4、將步驟3獲得的純化產(chǎn)物直接用Miseq平臺(tái)測(cè)序進(jìn)行測(cè)序。
[0105] 測(cè)序結(jié)果是fastq格式的數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得氨基酸位點(diǎn)突變情況及 比例。測(cè)序深度見(jiàn)圖4。本實(shí)施例使用PE150試劑盒進(jìn)行測(cè)序，即片段兩端各測(cè)序150bp。 生物信息學(xué)分析測(cè)序深度如圖4所示，橫坐標(biāo)是HBV基因組上的堿基位置，縱坐標(biāo)是測(cè)序深 度。從理論上講HBV552~HBV992片段雙端測(cè)序后，其測(cè)序位置分別是HBV552~HBV701， HBV843~HBV992。由圖4可知，本實(shí)施例與實(shí)際測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明一輪PCR產(chǎn)物的均一 性很尚。
[0106] 對(duì)比實(shí)施例
[0107] 現(xiàn)有的常規(guī)的方法是將巢式PCR和Sanger測(cè)序結(jié)合起來(lái)，為增加本發(fā)明說(shuō)服力， 進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提供的技術(shù)方案的有益效果，本發(fā)明還提供了對(duì)比實(shí)施例1-3。
[0108] 對(duì)比實(shí)施例1
[0109] 對(duì)比實(shí)施例1先采用巢式PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，然后采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)PCR產(chǎn) 物，步驟包括：
[0110] 1、巢式PCR引物
[0111] 內(nèi)側(cè)引物對(duì)：為實(shí)施例1的引物對(duì)（如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示）
[0112] 外側(cè)引物對(duì)：如 SEQUENCE NO. 5 和 SEQUENCE NO. 6 所示；
[0113] SEQUENCE NO. 5(5 ' -3 '）TCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ;
[0114] SEQUENCE NO. 6(5 ' -3 '）CTGCAGCAAAGCCCAAAAGA。
[0115] 進(jìn)行2輪的巢式PCR，二對(duì)引物的靶向位點(diǎn)以及2輪PCR產(chǎn)物分別如圖5A和圖5B 所示，圖5中，poll5和poll6即外側(cè)引物對(duì)，RT-F和RT-R即內(nèi)側(cè)引物對(duì)。
[0116] 2、巢式PCR程序
[0117] 反復(fù)摸索巢式PCR的最優(yōu)條件如下：
[0118] 第一輪PCR體系及程序：
[0119]
[0120] 第二輪PCR體系及程序：
[0122] 膠回收PCR產(chǎn)物。
[0123] 3、測(cè)序
[0124] 將步驟2純化后的PCR產(chǎn)物直接送Sanger測(cè)序。
[0125] Sanger測(cè)序圖譜（部分）如下，通過(guò)峰的面積來(lái)計(jì)算突變率。
[0126] 結(jié)果對(duì)比如下（其中，左欄sanger測(cè)序?yàn)閷?duì)比實(shí)施例1的結(jié)果，左欄Miseq測(cè)序 為實(shí)施例4的測(cè)序結(jié)果