一種多標(biāo)簽抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫印跡領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種多標(biāo)簽抗原及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫印跡技術(shù)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的技術(shù)。對已知表 達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢 ，具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種 最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多膚分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢 測等，因此免疫印跡技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。
[0003] 在設(shè)計(jì)表達(dá)一種蛋白時(shí)，通常都會(huì)進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，即在蛋白質(zhì)序列的N端或 者C端加入常用的標(biāo)簽序列，如6地is、Flag、Myc等。在做免疫印跡檢測目的蛋白表達(dá)量時(shí) 通常只需檢測目的蛋白上加入的標(biāo)簽序列即可，即用6*化S、Flag、Myc等標(biāo)簽單抗與目的 蛋白抗原進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，檢測出的信號(hào)強(qiáng)弱即反應(yīng)出目的蛋白表達(dá)量的高低。在運(yùn)用 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，或者利用病毒侵染來表達(dá)某種目的蛋白時(shí)，往往會(huì)遇到 蛋白表達(dá)量很微量或者不表達(dá)的情況，此時(shí)采用免疫印跡技術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá)情況很 可能不會(huì)出現(xiàn)明顯的信號(hào)。在運(yùn)種情況下，需要判斷到底是目的蛋白真實(shí)的表達(dá)量很微量， 還是免疫印跡檢測的反應(yīng)體系出現(xiàn)問題導(dǎo)致沒有出現(xiàn)信號(hào)。因此在做免疫印跡檢測時(shí)通常 都需要設(shè)置陰性對照和陽性對照，在出現(xiàn)上述情況時(shí)，若陽性對照工作正常出現(xiàn)明顯的反 應(yīng)信號(hào)，則說明待研究的目的蛋白表達(dá)量確定是微量表達(dá)或者不表達(dá)。
[0004] 常用的標(biāo)簽有GST標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、Str巧II標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、EGFP標(biāo)簽和His標(biāo)簽 等多種，在蛋白檢測中，不同的目標(biāo)蛋白根據(jù)其性質(zhì)往往會(huì)選擇不同的標(biāo)簽序列，現(xiàn)有技術(shù) 中多W單個(gè)標(biāo)簽作為陽性對照，運(yùn)樣當(dāng)待測的多種蛋白質(zhì)含有多個(gè)不同的標(biāo)簽序列時(shí)，貝U 需要多個(gè)相對應(yīng)的陽性對照，即費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也增加了檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開了一種多標(biāo)簽抗原，W滿足大多數(shù)免疫印 跡反應(yīng)設(shè)置陽性對照的需求。其技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明提供了一種多標(biāo)簽抗原，包括9種標(biāo)簽，分別為GST標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、T7標(biāo)簽、 V5標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、Str巧II標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、EGFP標(biāo)簽和His標(biāo)簽。
[0007] 優(yōu)選地，該9種標(biāo)簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-Str巧II-Flag-EGFP-His的順序依次 串聯(lián)。
[000引優(yōu)選地，9種標(biāo)簽的序列為SEQIDN0. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了該多標(biāo)簽抗原的制備方法，包括W下步驟：
[0010](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設(shè)置限 審IJ性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達(dá)載體，測序，得到包含該沈QIDN0. 1序 列的質(zhì)粒；
[0011] 化）、將步驟（a)中得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用儀柱純化 該蛋白。
[0012] 優(yōu)選地，步驟（a)中，設(shè)置在5'端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為化OI，設(shè)置在3'端的限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為化OI。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（a)中，蛋白表達(dá)載體為祀T28a。
[0014] 優(yōu)選地，步驟化）中，表達(dá)菌株為大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta值E3)。
[0015] 優(yōu)選地，該多標(biāo)簽抗原的制備方法包括W下步驟：
[0016](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設(shè)置限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)化OI和化OI，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達(dá)載體祀T28a，測序，得 到包含該SEQIDN0:1序列的質(zhì)粒祀T28a-MultiTag-G9;
[0017]化）、將步驟（a)中得到的質(zhì)粒祀T28a-MultiTag-G9轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株 Rosseta(DE3)，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用儀柱純化該蛋白。
[001引本發(fā)明還提供了一種多標(biāo)簽抗原的重組載體，即根據(jù)上述步驟（a)得到的pET28a-MultiTag-G90
[0019] 本發(fā)明還提供了上述多標(biāo)簽抗原在免疫印跡中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明公開的多標(biāo)簽抗原，能夠滿足大多數(shù)免疫印跡反應(yīng)設(shè)置陽性對照的需求。 其具有良好的兼容性和很強(qiáng)的免疫印跡反應(yīng)特異性，并大大節(jié)省了檢測成本。
[0021] W下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1示出了本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中制備的多標(biāo)簽抗原的免疫印記（Western blot)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]W下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。W下的實(shí)施例是對 本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 1、MultiTag-Gg人工基因合成
[00巧]MultiTag-Gg包含 9 種常用檢測標(biāo)簽，分別是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His標(biāo)簽。具體的DNA序列分別是：
[0026]GST標(biāo)簽
[0027]

[0043]His標(biāo)簽
[0044]catcatcatcatcatcat 18
[0045] 將上述9種標(biāo)簽DNA序列依次串聯(lián)在一起通過人工基因合成的方法構(gòu)建出 MultiTag-Gg完整序列，并在此DNA序列5'端加上化OI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)CCATGG，3'端 加上化OI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)CTCGAG，通過化OI和化OI雙酶切、割膠回收、T4連接酶連 接克隆至蛋白表達(dá)載體祀T28a。MultiTag-Gg完整編碼區(qū)為1566bp，共含有522個(gè)氨基酸， 表達(dá)蛋白的理論分子量為5991抓a.
[0046] 2、MultiTag-G9蛋白的表達(dá)與純化
[0047] 將測序正確的祀T28a-MultiTag-G9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株 Rosseta值E3)，挑取單菌落接種至50mlLB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯 霉素34ug/ml雙抗性篩選，37 °C，200巧m培養(yǎng)過夜。第二天按照2 :100比例轉(zhuǎn)接至250ml LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選，共轉(zhuǎn)接4瓶， 37°C，200rpm培養(yǎng)至菌液0D600檢測數(shù)值為0. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基-0 -D硫代半乳糖巧 使其終濃度為0. 1-0. 5mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，4°C700化pm離屯、收集菌體。將此菌體按照每克 加入40ml的比例懸浮于20mMTris.Cl,P冊.0,300mM化Cl,10%Glycerol裂解緩沖液，超 聲前加入終濃度ImM苯甲基橫酷氣，超聲波破碎儀進(jìn)行菌體破碎。超聲裂解條件為超聲3 秒間隔5秒，30%超聲功率，超聲15min。當(dāng)菌液變得清亮?xí)r離屯、收集上清液，取樣進(jìn)行聚丙 締酷胺凝膠電泳檢測，并采用儀柱純化MultiTag-Gg蛋白，具體純化操作步驟參照NiNTA Beads6FF說明書進(jìn)行，獲得純度約95%的MultiTag-Gg蛋白（得到的MultiTag-Gg蛋白 濃度為 350ug/ml)。
[004引3、MultiTag-Gg的免疫印跡應(yīng)用
[0049] 純化好的MultiTag-Gg進(jìn)行聚丙締酷胺凝膠電泳，按照每泳道上樣5ng MultiTag-G9蛋白進(jìn)行聚丙締酷胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗結(jié)合，二抗結(jié)合，曝光顯色進(jìn) 行Westernblot免疫印跡反應(yīng)。9種相對應(yīng)的商品化標(biāo)簽單抗均能與MultiTag-Gg蛋白進(jìn) 行靈敏而特異性的免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果如附圖1所示。
[0050] 本發(fā)明獲得的多標(biāo)簽抗原蛋白可作為免疫印跡反應(yīng)的陽性對照，具有良好的兼容 性和很強(qiáng)的免疫印跡反應(yīng)特異性。一種多標(biāo)簽抗原蛋白即可滿足大多數(shù)常用標(biāo)簽免疫印跡 反應(yīng)的陽性對照之需，兼容性強(qiáng)；其作為免疫印跡反應(yīng)的陽性對照靈敏度高，只需低至5ng 蛋白即有明顯的免疫印記（Westernblot)反應(yīng)信號(hào)；免疫印跡反應(yīng)只有單一目的條帶信 號(hào)出現(xiàn)，特異性強(qiáng)。
[0051] W上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng) 造性勞動(dòng)就可W根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可W得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多標(biāo)簽抗原，其特征在于，所述多標(biāo)簽抗原包括9種標(biāo)簽，分別為GST標(biāo)簽、HA 標(biāo)簽、T7標(biāo)簽、V5標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、Str印II標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、EGFP標(biāo)簽和His標(biāo)簽。2. 如權(quán)利要求1所述的多標(biāo)簽抗原，其特征在于，所述9種標(biāo)簽按照GST-HA-T7-V5-My c-Str印II-Flag-EGFP-His的順序依次串聯(lián)。3. 如權(quán)利要求2所述的多標(biāo)簽抗原，其特征在于，所述9種標(biāo)簽的序列為SEQIDNO. 1所 示的核苷酸序列。4. 如權(quán)利要求1所述的多標(biāo)簽抗原的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分別設(shè)置限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達(dá)載體，測序，得到包含所述SEQIDNO. 1 序列的質(zhì)粒； (b) 、將步驟（a)中得到的所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用鎳柱純化 所述蛋白。5. 如權(quán)利要求4所述的多標(biāo)簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中，設(shè)置在 所述5'端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為NcoI，設(shè)置在所述3'端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為XhoI。6. 如權(quán)利要求4所述的多標(biāo)簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中，所述蛋 白表達(dá)載體為pET28a。7. 如權(quán)利要求4所述的多標(biāo)簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（b)中，所述表 達(dá)菌株為大腸桿菌表達(dá)菌株R〇sseta(DE3)。8. 如權(quán)利要求1所述的多標(biāo)簽抗原的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分別設(shè)置限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI和XhoI，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達(dá)載體pET28a，測序，得 到包含所述SEQIDNO: 1序列的質(zhì)粒pET28a-MultiTag-G9 ; (b) 、將步驟（a)中得到的所述質(zhì)粒pET28a-MultiTag-G9轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株 Rosseta(DE3)，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用鎳柱純化所述蛋白。9. 一種多標(biāo)簽抗原的重組載體，其特征在于，所述重組載體為根據(jù)權(quán)利要求8所述的 步驟（a)得到的pET28a-MultiTag-G9。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多標(biāo)簽抗原在免疫印跡中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多標(biāo)簽抗原，該多標(biāo)簽抗原包括9種標(biāo)簽，分別為GST標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、T7標(biāo)簽、V5標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、StrepII標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、EGFP標(biāo)簽和His標(biāo)簽，這9種標(biāo)簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的順序依次串聯(lián)。本發(fā)明還公開了該多標(biāo)簽抗原的制備方法及其在免疫印跡中的應(yīng)用。本發(fā)明中公開的多標(biāo)簽抗原，可以滿足大多數(shù)免疫印跡反應(yīng)設(shè)置陽性對照的需求，具有良好的兼容性和很強(qiáng)的免疫印跡反應(yīng)特異性。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/70, G01N33/68, C12R1/19
【公開號(hào)】CN105296478
【申請?zhí)枴緾N201510821610
【發(fā)明人】曹平生
【申請人】翌圣生物科技（上海）有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月23日