與辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因qcmv-2-1連鎖的分子標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，設(shè)及與辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因qcmv-2-l連鎖的 分子標記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜花葉病毒（化州mber mosaic virus, CMV)為雀麥花葉病毒科度romoviridae) 黃瓜花葉病毒屬（化cumovirus)的典型成員，可引起辣椒嚴重的系統(tǒng)癥狀，導(dǎo)致葉片黃化、 扭曲變形、嚴重花葉，損害果實的商品性狀。黃瓜花葉病毒病一般能導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)20%~ 30 %，嚴重時可達50 %~60 %，個別地區(qū)甚至絕收，是辣椒最嚴重的病害之一。我國辣椒生 產(chǎn)中CMV檢出率最高，是辣椒抗病育種的主攻目標。
[0003] 傳統(tǒng)育種方法中，選育抗病材料是通過接種鑒定，根據(jù)植株的表型進行篩選。該種 方法因為接種不充分或發(fā)病條件不適宜而影響選擇效率，難W準確、快速的篩選出具有抗 病基因的個體植株。此外辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因大部分來自野生辣椒，抗病基因常與 不良性狀基因緊密連鎖。利用傳統(tǒng)育種方法打破不良連鎖所需群體大、周期長、效率低，而 分子標記輔助選擇（Mole州IarMarker-assistedSelection,MA巧育種可有效的克服傳統(tǒng) 育種的缺陷，加速育種進程。
[0004] 插入/缺失多態(tài)性（insertion/deletion,InDel)是由于等位基因位點處的DNA 序列在不同個體間發(fā)生了核巧酸片段的插入/缺失而產(chǎn)生的長度多態(tài)性變異。根據(jù)目標位 點兩側(cè)的序列設(shè)計特異引物進行PCR擴增，擴增片段的長度多態(tài)性即是InDel標記。在整 個基因組中，Indel標記的多態(tài)性頻率僅次于SNP標記，遠高于SSR標記。InDel標記多態(tài) 性可通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)和瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙締酷胺凝膠電泳等簡單 的步驟達到基因分型的目的。InDel標記為共顯性標記，具有較好的穩(wěn)定性和較為豐富的 多態(tài)性，廣泛應(yīng)用于高分辨率圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析、基因定位和目標性狀分子標記篩選等領(lǐng) 域。本發(fā)明采用QTkSeq方法和Indel標記技術(shù)，篩選與黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l 緊密連鎖的標記，W實現(xiàn)黃瓜花葉病毒病抗性的分子標記輔助育種，加速我國辣椒抗黃瓜 花葉病毒病新品種的選育進程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種與辣椒抗黃瓜花葉病毒病基 因qcmv-2-l連鎖的分子標記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供與辣椒黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l連鎖的分子 標記的引物對。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供該分子標記及其引物對的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] -種與辣椒黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l連鎖的分子標記，通過引物對 InDel-2-134F/InDe^2-134R擴增辣椒基因組DM,獲得的230bp的擴增片段為所述的與辣 椒黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l連鎖的分子標記；其中，InDel-2-134F序列如SEQID NO. 1 所示，InDel-2-134R序列如沈QIDNO. 2 所示。
[0010] 與辣椒黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l連鎖的分子標記的引物對 InDe^2-134F/InDel-2-l：MR，InDe^2-134F序列如沈QIDNO. 1 所示，InDel-2-134R序列 如沈QIDNO. 2所示。
[0011] 辣椒黃瓜花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l的分子標記方法，用本發(fā)明所述的引物 對InDe^2-134F/lnDel-2-134RPCR擴增待檢辣椒基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果擴增 出23化P的擴增片段，則標志著待檢辣椒中存在辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因qcmv-2-l，待 檢辣椒為黃瓜花葉病毒病抗病植株。
[0012] 本發(fā)明所述的分子標記在鑒定辣椒種質(zhì)資源中黃瓜花葉病毒病抗性基因 qcmv-2-l中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所述的分子標記在篩選抗黃瓜花葉病毒病的辣椒中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所述的分子標記在培育抗黃瓜花葉病毒病辣椒的分子育種中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述的引物對InDe^2-134F/lnDel-2-134R在鑒定辣椒種質(zhì)資源中黃瓜 花葉病毒病抗性基因qcmv-2-l中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所述的引物對InDe^2-134F/lnDel-2-134R在篩選抗黃瓜花葉病毒病辣 椒中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明所述的引物對InDe^2-134F/lnDel-2-134R在培育抗黃瓜花葉病毒病辣 椒的分子育種中的應(yīng)用。
[001引一種篩選抗黃瓜花葉病毒病辣椒的方法，用所述的引物對InDe^2-134F/InDel-2-134RPCR擴增待檢辣椒基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果能夠擴增出23化P的擴 增片段，則標志著待檢辣椒為存在辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因qcmv-2-l的辣椒植株。
[0019] 有益效果：
[0020] 黃瓜花葉病毒病是我國辣椒檢出率最高的病毒病之一，是我國辣椒抗病育種的 主攻目標。
[002。本文發(fā)明利用Indel標記和QTkSeq法篩選得到的與qcmv-2-l抗性基因連鎖的Indel分子標記及對應(yīng)的引物，標記帶型簡單，可直接用于標記輔助選擇。
[0022] 該標記是一個基于PCR技術(shù)的共顯性標記，與RFLPXAPS等標記相比，可顯著降低 成本，節(jié)省勞力。該標記應(yīng)用于苗期選擇，不僅可W減少工作量，而且能夠避免因接種不充 分難W篩選出具有抗病基因的個體植株，從而加速育種進程。
【附圖說明】
[0023] 圖1InDel標記InDe^2-134在親本間和抗感池間的擴增情況
[0024] M:100bpMarker1 ;P1 :抗病親本PBC688 ;P2 :感病親本G29 ;1-5 :F2 抗病單株； 6-10 :F2感病單株
[00巧]圖2InDel標記InDe^2-134在Fz群體中的驗證
[0026] M:IOObpmarker; 1-10 &代抗病單株；11-20:F2代感病單株
[0027] 圖3 Indel標記在23份F2抗感單株中的驗證
[0028] M:100bpmarker;l-20:20 份F2抗病單株；21-23:3份F2感病單株
【具體實施方式】
[0029] 實施例1
[0030] 1.供試材料
[0031] 應(yīng)用抗病自交系PBC688為母本（利用QTkSeq技術(shù)定位辣椒抗黃瓜花葉病毒病 基因，園藝學報，2015,doi:10. 16420/j.issn. 0513-353X)，感病系G29為父本配制雜交組 合（利用的'L-Seq技術(shù)定位辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因，園藝學報，2015,doi:10. 16420/ j.issn. 0513-353X)，得到Fi后，再次自交得到F2分離群體，利用苗期人工摩擦接種黃瓜花 葉病毒化y株系接種鑒定（辣椒抗黃瓜花葉病毒病研究進展。華北農(nóng)學報，2014,29(增 刊）：77-84)。
[0032] 具體做法是：挑選飽滿的種子播種于營養(yǎng)鉢中，每鉢1粒種子，待4葉1屯、時，進行 人工摩擦接種。接種4周后調(diào)查群體發(fā)病情況，病情調(diào)查分級為0級-無任何癥狀；1級-屯、 葉明脈或接種葉急性小枯斑；3級-系統(tǒng)花葉或莖上產(chǎn)生壞死斑點；5級-系統(tǒng)重花葉、崎 形或莖上產(chǎn)生壞死條斑；7級-多數(shù)葉片崎形、藤葉、植株矮化或莖、枝和葉脈系統(tǒng)壞死；9 級-植株嚴重矮化，停止生長或嚴重系統(tǒng)壞死，至全株死亡（見參考文獻：中國作物及其野 生近緣植物：蔬菜作物卷[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008:719-720)。
[003引 2.基因組DNA的提取
[0034] 辣椒葉片放入1. 5ml離屯、管中，液氮速凍研磨至粉末，立即加入700y1預(yù)