用于從植物分離dna的非破壞性方法
【專利說明】用于從植物分離DNA的非破壞性方法
[0001]本申請是申請日為2007年2月14日、發(fā)明名稱為“用于從植物分離DNA的非破壞性方法”的中國發(fā)明專利申請N0.200780005500.2的分案申請。
發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明涉及一種用于從植物分離DNA的非破壞性方法以及該方法在植物或植物種群的遺傳分析中的應用。
[0003]發(fā)明背景
[0004]植物培育依賴于存在于具體作物物種生殖質中的遺傳變異的有效開發(fā)，所述遺傳變異決定了植物在特定環(huán)境的表型。然而傳統(tǒng)上，通過在表型水平觀察到的所期望的性狀組合的挑選來實現，漸增地，可以通過基于在遺傳上與促成特異性狀表達的基因的等位基因型緊密連鎖的分子標記的挑選來進行。
[0005]基于分子標記的性狀挑選不依賴于植物的發(fā)育階段，不依賴于環(huán)境，這顯著提高了挑選過程。包括由多個基因控制的復雜性狀在內的可以利用分子標記挑選的性狀的數目大大增加，并且可以想象這一發(fā)展以漸增的速度持續(xù)。
[0006]植物培育領域中的另一個趨勢起因于反向遺傳學。反向遺傳學涉及到一種方法，其中基因被分離，且基因的功能通過修飾它們的一級結構或表達來確定。隨著目前在基因功能方面認識的增加，尤其是在模式系統(tǒng)中例如擬南芥(Arabidopsis tholiana)，反向遺傳學方法現在在作物系統(tǒng)中增加了效力。
[0007]為了確定候選基因的等位基因變異性，過量的DNA診斷工具是可用的并為本領域技術人員所知。大量包含天然的或誘導的等位基因變異的植物種群需要在感興趣的位點對DNA多態(tài)性進行篩選，以獲得飽和的等位基因變異的采集。因而，可以通過關聯分析評價如此發(fā)現的基因的等位基團型對植物表型的貢獻。
[0008]篩選培育的或突變的種群的成本大部分由在研究過程中種植和采樣種群的個體植物以及從這些樣本中制備DNA所需的勞力所決定。在研究過程中，如果一個種群作為代表存在于種群的個體植物中的遺傳變異的種子樣本是可獲得的，大量的勞力用于逐株收獲種子作為家系中的相關個體。而且，這任務需要對產生的每一個額外種群進行重復，并時所述種群在特定遺傳位點對等位基因變異進行評價。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明的目的是提供一種用于從植物中分離DNA的有效的方法。本發(fā)明進一步的目的是提供一種有效的DNA分離方法，所述方法允許針對在特定遺傳位點存在的等位基因變異進行植物種群的篩選，其需要人工解剖組織樣本或需要收獲來自被過量研究的種群的每個個體植物的種子。
[0011]根據本發(fā)明，發(fā)現這樣的方法可以基于根部釋放的分泌液的使用，優(yōu)選地從很幼小的植物如幼苗的根部或從萌芽的種子暴露出的根部或生長在組織培養(yǎng)基里的植物的不定根，以從中分離DNA。更具體地，該方法利用從根尖分離的所謂的根邊緣細胞作為DNA的主要來源。根邊緣細胞是大部分植物物種圍繞根頂端的活細胞。當生長在土壤里以及生長在液體或者固體培養(yǎng)基時，植物自然地從根部分離根邊緣細胞。因此，本發(fā)明的方法被認為是非破壞性的。細胞已經以自然的方式從植物上分離，可以通過溫和的攪動和去除圍繞根部且包含根邊緣細胞的培養(yǎng)基(通常是液體)而收獲。生長的根部持續(xù)產生根邊緣細胞，在稍后的時期可以再一次收獲根邊緣細胞。
[0012]因此本發(fā)明涉及一種用于從植物分離DNA的方法，包含:
[0013]a)從生長的根部收集根邊緣細胞；和
[0014]b)從根邊緣細胞提取DNA。
[0015]原則上，DNA可以從所有的根邊緣細胞獲得。但是，很實用的是收集源自萌芽種子部分的根部的根邊緣細胞。種子能夠在液體培養(yǎng)基如水中被浸漬，此后種子萌芽。因此能夠在植物發(fā)育的很早的階段，即種子發(fā)育期間，分析植物。沒有必要等到葉子在植物上長出來。但是，該方法也可以在源自幼苗根部的根邊緣細胞上進行。
[0016]進一步發(fā)現生長在組織培養(yǎng)基中的植物材料上的不定根產生根邊緣細胞。根據本發(fā)明，這些根邊緣細胞也可以用于從中分離DNA。
[0017]本領域技術人員所知的各種用于提取DNA的方法是可利用的，例如CTAB (Doyle JJand Doyle JL (1990) Focus 12, 13-15), KingFisher96? (Thermo Labsystems)等等。
[0018]如此獲得的DNA可以是細胞核和細胞質來源的，并且可以用不同的核酸分析技術分析。這些核酸分析技術為本領域技術人員所熟知，包括但不僅限于聚合酶鏈式反應(PCR)，Sanger測序法，mini測序法，pyro測序法，GS20測序法，擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)，限制片段長度多態(tài)性(RFLP)，隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)，Invader (侵染探針法)，寡核苷酸連接測定法(0LA)，單特征多態(tài)性(SFP)。
[0019]本發(fā)明進一步涉及新穎的非破壞性DNA分離方法在高效篩選大量植物種群在特定基因座的遺傳變異中的應用。該遺傳變異可以是自然的或人工誘導的。
[0020]因此從植物分離DNA的方法提供了一個獲得可以用于檢測由化學的或物理的誘變產生的植物種群中的特異基因的遺傳變異的DNA的有效工具?？蛇x擇地，所述遺傳變異可以存在于自然種群中。
[0021]本發(fā)明的方法的使用消除了建立衍生于發(fā)生突變的Ml植物的M2家系的需要。大量的M2種群可以被替代使用，使得可以用更加有效和靈活的方式分析M2種群的特異基因不同等位基團型的存在。
[0022]本發(fā)明的用于從植物分離DNA的方法也適合于在植物種群的遺傳分型中使用，這對商業(yè)種子批次的質量控制目的以評價遺傳純度和同一性是有用的。
[0023]該DNA分離方法可進一步用于存在于遺傳上截然不同的植物的種群中植物的鑒定，該鑒定基于檢測多態(tài)分子標記的等位基團型，其中所述多態(tài)分子標記與決定某一個表型性狀表達的基因的等位基團型是連鎖的。
[0024]發(fā)明詳述
[0025]大范圍測序的成就提供了模式植物物種如擬南芥和作物物種如水稻的完整基因組序列。而且，對來自大范圍作物物種如番茄，萵苣，黃瓜，蕓苔，甜瓜，玉米等的不同組織樣本來源的大量的cDNA片段或ESTs已進行了測序。目前的挑戰(zhàn)是闡明單獨的基因的功能，其表達的調節(jié)及其遺傳交互作用。為了解決這個挑戰(zhàn)，處理每個單獨基因的大量的等位基因變異是重要的。這將為一個基因產物在細胞的，器官的或更高級別的水平發(fā)揮哪種生化作用和基因產物如何相互作用提供線索。
[0026]為了在植物培育中開發(fā)基因功能的信息，獲得一個非常有效的，經濟效益的反向遺傳學技術是令人想要的。反向遺傳學涉及一種方法，在所述方法中，以基因序列信息開始，針對該基因序列產生等位基因的或表達的變異體，隨后對該突變體進行功能上分析。這個術語是相對于將表型變異作為起始材料以鑒定潛在的基因的等位基因型的正向遺傳學的。
[0027]為了在植物培育中應用反向遺傳學，基因功能的知識是先決條件。當前，擬南芥是最廣泛研究的涉及基因功能的植物系統(tǒng)，來自擬南芥研究的結果在這方面提供了豐富的信息來源。
[0028]基于氨基酸序列水平的同源性，可以預測一個作物物種的同源蛋白的功能，盡管最終需要直接的實驗證據以證實該基因的功能。因此，基于模式物種的基因的同源性而鑒定的作物物種的基因可以被認為是特異功能的候選基因。物種間的具有類似或相同功能的基因可以，但不必要，展現高水平的同源性，并且存在于一個具體模式系統(tǒng)的基因功能可能只是部分與存在于一個給定的作物物種的基因功能一致。
[0029]可以通過反向遺傳學開發(fā)的等位基因變異性既自然地在適應的種群中出現又可以通過用化學的或物理的突變劑，分別例如甲基磺酸乙酯(ems)或X射線，的隨機突變獲得。通過用這些突變劑處理植物的器官，細胞，花粉或種子，將會在基因組DNA的隨機位置引入可能導致基因功能改變的修飾。在基因功能方面迅速增加的知識，許多植物物種的基因組和cDNA序列的廣泛可獲得性和承載自然的和誘導的遺傳變異的種群的可獲得性的條件下，反向遺傳學作為一種在模式或作物物種中確定基因功能的研究工具具有漸增的重大意義。另外，反向遺傳學可以被認為是植物改良的有力的技術，用其可以有效鑒定已知的功能上與特異性狀有關的基因的等位基因變異。
[0030]為了在一個作物物種中進行反向遺傳學，除一個靶基因之外，明顯地需要包含給定作物物種的遺傳位點的遺傳變異體的植物種群。在這些種群里，遺傳變異可以是自然發(fā)生或可以是由突變劑如ems誘導的。為了獲得帶有誘導突變的種群，可以在包含不同濃度的突變劑如ems的溶液中溫育例如種子。Ems首先烷基化DNA鏈的G殘基，在DNA復制期間導致其與T配對，而非與C配對。因此，GC堿基對以一定頻率變成AT堿基對，所述頻率由ems的有效劑量和植物的錯配修復系統(tǒng)的活性決定。
[0031]Ems的有效劑量依賴于所用的濃度，種子的大小