一種用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的 多膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前對(duì)于腸致病性大腸桿菌的治療均采用廣譜抗生素治療，無(wú)特異性針對(duì)該類細(xì) 菌的抑制劑。采用抗生素治療，容易產(chǎn)生耐藥性，使耐藥變異菌在人體內(nèi)聚集，給W后的感 染治療帶來(lái)困難。
[0003] 腸致病性大腸埃希菌（enteropathogenicE.coli，E陽(yáng)C)是引起全球嬰幼兒腹 瀉和成人散發(fā)性腹瀉的重要病原菌之一，目前研究表明EPEC主要通過(guò)黏附和脫落損傷 (attachingandeffacingin化；ry，A/Einjury,即A/E損傷）導(dǎo)致腸粘膜損傷。腸致病 性大腸埃希菌EPEC感染的特點(diǎn)是病原菌能本能性粘附到宿主細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞微絨毛，并 在粘附細(xì)菌下誘導(dǎo)由細(xì)胞支架蛋白形成杯樣基底膜，運(yùn)種現(xiàn)象稱之為"粘附與脫落損傷"。 EPEC的粘附與脫落效應(yīng)特征是依賴Es地、EspD和EspA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成了對(duì)宿主細(xì)胞的緊密 粘附，并在粘附細(xì)胞下清除細(xì)胞微絨毛，積累纖維肌動(dòng)蛋白。Es地蛋白可與EspD蛋白相互 作用而插入宿主細(xì)胞膜形成微孔，使得EPEC毒力因子可通過(guò)細(xì)胞膜上形成的微孔直接進(jìn) 入宿主細(xì)胞，入侵的毒力因子促使細(xì)菌粘附與抹平效應(yīng)的形成。Es地缺失的突變EPEC不能 介導(dǎo)臨近粘附細(xì)胞微絨毛的延伸，也不能阻止巨隧細(xì)胞的吞隧作用。由于Es地蛋白是腸致 病性大腸桿菌致病的關(guān)鍵蛋白，若能找到能抑制EPEC的致病作用的物質(zhì)，將為EPEC治療尋 找新的策略，為未來(lái)預(yù)防和治療EPEC做出重大貢獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)W上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的多 膚，證實(shí)能抑制EPEC的致病作用，可祀向性阻斷EPEC的致病性，為研發(fā)預(yù)防和治療EPEC的 藥物奠定了基礎(chǔ)。 陽(yáng)0化]對(duì)此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 一種用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的多膚，其由SEQIDNO:1、SEQIDNO: 2,沈QIDNO:3或沈QIDNO:4的氨基酸序列組成。
[0007] 本發(fā)明還提供了編碼如上所述多膚的核酸分子。
[0008] 本發(fā)明還提供了含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0009] 本發(fā)明還提供了 一種包含如上所述多膚的組合物。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述多膚的組合物還包含殺細(xì)菌劑。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述多膚的組合物還包含為實(shí)現(xiàn)殺細(xì)菌之外的功能與作用而添加 的非多膚的成分。
[0012] 本發(fā)明還提供了如上所述的多膚、如上所述的核酸分子或如上所述的組合物在制 備藥物中的用途，用于殺滅或抑制腸致病性大腸埃希菌。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0014] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案，所述用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的多膚與EspB 蛋白的親和力高于對(duì)照蛋白，且體外研究顯示，用于預(yù)防和治療腸致病大腸桿菌感染的多 膚能夠抑制EPEC與肥P-2細(xì)胞的粘附，阻斷Es地的功能，從而減少EPEC對(duì)上皮細(xì)胞的吸 附，為EPEC治療提供了新的方向，為研發(fā)預(yù)防和治療EPEC的藥物奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)01引 圖1為本發(fā)明采用WesternBlot方法檢測(cè)Es地蛋白表達(dá)圖。圖中，A為構(gòu)建的 祀T2化-Es地表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸埃希菌后的表達(dá)情況圖，鼠抗人6-組氨酸單克隆抗體為 主要抗體，1為Es地表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌裂解產(chǎn)物，2為培養(yǎng)上清表達(dá)重組Es地蛋白，1及 2分別顯示了Es地表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌裂解產(chǎn)物及培養(yǎng)上清表達(dá)重組Es地蛋白情況。B 為純化的Es地蛋白表達(dá)圖。
[0016] 圖2為本發(fā)明12種篩選出來(lái)的陽(yáng)性隧菌體及VCSM13對(duì)照與Es地及6-組氨酸短 膚親和力大小用化ISA方法的鑒定圖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次W上，取其均數(shù)作為最終分析數(shù) 據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 1.體外表達(dá)Es地蛋白；
[0019] 從E2348/69 (0127 :冊(cè)）菌株擴(kuò)增Es地片段，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子學(xué)方法將此基因片段 插入祀T2化表達(dá)載體BamHI和EcoRI位點(diǎn)，從而構(gòu)建一個(gè)含有6個(gè)化is)組氨酸殘端的 祀T2化-Es地表達(dá)載體。通過(guò)向培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)祀T2化-Es地表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的重 組大腸埃希菌表達(dá)Es地蛋白。加入ImM的IPTG后離屯、收集細(xì)胞，應(yīng)用Qiagen公司A緩沖 液懸浮細(xì)胞，所述A緩沖液為A緩沖液生產(chǎn)的20mM化is, 500ml化Cl,pH9。聲波裂解法 裂解細(xì)胞后將細(xì)胞懸液進(jìn)行離屯、，收集上清用于Ni2+-交換膜（Qiagen公司）過(guò)濾。含有 His標(biāo)記的Es地蛋白被洗脫液（Qiagen公司）洗脫下來(lái)，應(yīng)用鼠抗化S單克隆抗體Western blot方法分析收集蛋白?；痑壯ord方法度io-Rad，化;rcules，CA，USA)定量收集溶液中重 組化S-Es地蛋白濃度，之后儲(chǔ)藏在-70°C的冰箱中。
[0020] 2.Es地特異性結(jié)合蛋白的篩選
[0021] 應(yīng)用 12-mer隨機(jī)庫(kù)（New化glandBioL油S，Ipswich,MA，USA)采用隧菌體M13 上-篩選出Es地特異性結(jié)合蛋白。將150yL混有10yg/mLEs地蛋白及0.IM碳酸氨鋼 的溶液加入無(wú)菌聚苯乙締有蓋培養(yǎng)皿中，反復(fù)震蕩直至培養(yǎng)皿表面完全濕潤(rùn)。包被有Es地 蛋白的培養(yǎng)皿用小牛蛋白血清去阻斷后用0. 05%PBST緩沖液洗涂。取10yL用PBST稀釋 的原液加入培養(yǎng)基，常溫下解育化。包被的培養(yǎng)皿用用0. 05%PBST洗涂后，剩下的粘附隧 菌體被洗脫下來(lái)用于擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)S輪擴(kuò)增后，洗脫液在邸2738培養(yǎng)基中得到擴(kuò)增，用聚乙 二醇沉淀純化并按照試劑使用說(shuō)明書(shū)定量。
[0022] 3.ELISA法篩選陽(yáng)性隧菌體 陽(yáng)02引用Es地蛋白及對(duì)照6-組氨酸膚隔夜包被96孔板，阻斷緩沖液阻斷，每孔加入l〇Mp化的隧菌體克隆或?qū)φ諛颖?，常溫下解育Ih;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的M13,常溫下 解育Ih;加入50yL/孔的聯(lián)苯胺；20min后加入50yL/孔的2MH2SO4終止反應(yīng)；檢測(cè)樣本 在450皿波長(zhǎng)處的吸光度（A)值。如果樣本的A值高于對(duì)照隧菌體及膚2倍W上，考慮目 標(biāo)蛋白與Es地蛋白有較局的萊和力。
[0024] 4.DNA測(cè)序及膚鏈合成
[00巧]根據(jù)化W!EnglandBioL油S，Ipswich,MA，USA試劑操作說(shuō)明書(shū)12-me;r隨機(jī)庫(kù)擴(kuò)增 陽(yáng)性隧菌體中DNA片段，并送sanger測(cè)序；之后應(yīng)用BioEdit序列比對(duì)編輯軟件分析DNA 序列。目標(biāo)膚鏈由Sigma-Al化ich公司合成，其純度大于98%。6個(gè)組氨酸的C短添加到 Gly-Gly-Gly-Ser空間結(jié)構(gòu)上作為陰性對(duì)照。 陽(yáng)0%] 5.細(xì)胞活性試驗(yàn)
[0027] 肥P-2細(xì)胞W2Xl(f/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板，過(guò)夜貼壁后換成含1%小牛 血清的DM