一種抗菌肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種抗菌膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來由于傳統(tǒng)抗生素的濫用導(dǎo)致越來越嚴(yán)重的病原微生物的耐藥性問題，給人 類的健康帶來巨大威脅，迫切需要開發(fā)新的抗菌藥物。為了解決運個問題，抗菌膚受到了越 來越多的關(guān)注?？咕w是生物體在抵御外來病原微生物入侵時產(chǎn)生的一種有活性的多膚物 質(zhì)，是生物體先天性免疫應(yīng)答的重要組成部分。一般由20-60個氨基酸組成，分子量40kDa 左右。至今為止，已經(jīng)在動物，植物，微生物和人的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了超過1500種抗菌膚，抗菌膚 具有分子量低，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點。
[0003] 然而，天然的抗菌膚部分存在免疫原性、抗菌活性低，穩(wěn)定性差，細(xì)胞毒性強(qiáng)，溶血 率高等問題，限制了其作為抗菌藥物的推廣應(yīng)用。因此，尋找抗菌活性強(qiáng)、安全性高、穩(wěn)定性 好的抗菌膚是實現(xiàn)抗菌膚部分替代抗生素的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗菌膚，其分子量小，穩(wěn)定性好，細(xì)胞毒性小，溶血活性 低，抗菌活性強(qiáng)。 陽〇化]本發(fā)明的另一目的是提供上述抗菌膚的應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的抗菌膚，該抗菌膚具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列：AsnTrpPheAlaIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIleLysLysLysLys。
[0007] 所述抗菌膚的分子量為2181. 63D，等電點為9. 87。
[0008] 上述抗菌膚在制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物中 的應(yīng)用。
[0009] 上述抗菌膚在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的抗菌膚不但對大腸桿菌、枯草桿菌和表皮葡萄球菌等革蘭氏陰性菌和陽 性菌都有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和細(xì)胞毒性，穩(wěn)定性好，抗菌活性強(qiáng)， 具有高效廣譜抑菌作用，可作為抗生素替代品使用。
【附圖說明】 W11] 圖1為抗菌膚AP16-A的質(zhì)譜圖；
[0012] 圖2為抗菌膚AP16-A和蜂毒膚對大腸桿菌的抑菌曲線圖；
[0013] 圖3為抗菌膚AP16-A和蜂毒膚對枯草桿菌的抑菌曲線圖；
[0014] 圖4為抗菌膚AP16-A和蜂毒膚對表皮葡萄球菌的抑菌曲線圖；
[0015] 圖5為抗菌膚AP16-A和蜂毒膚的溶血活性測定結(jié)果圖；
[0016] 圖6為抗菌膚AP16-A和蜂毒膚的MT法細(xì)胞毒性測定結(jié)果圖； 陽017] 圖7為抗菌膚AP16-A的小鼠急性毒性試驗測定結(jié)果圖； 陽01引圖8為抗菌膚AP16-A的小鼠急性毒性試驗體重變化圖；
[0019] 圖9為抗菌膚AP16-A37°C熱處理后的HPLC圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 陽02UHIV-I的胞外近膜區(qū)域（Ac-665WASLWNWNITNWLWYIK683-NHz)具有膜活化的特性并 且此區(qū)域包含HIV-I的廣譜中和抗體4E10和2巧表位。根據(jù)抗菌膚的作用機(jī)理和氨基酸 組成的特點，本發(fā)明在4E10表位的基礎(chǔ)上在其C-末端添加一個含=個賴氨酸的水溶性尾 己，W增加多膚的正電性和水溶性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的多膚改造。本實施方式中共 有屯個抗菌膚，其一級機(jī)構(gòu)和分子量如表1所示，其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如表2所示。
[0022] 表1抗菌膚的一級結(jié)構(gòu)和分子量
[0024] 表2抗菌膚一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列
[0027] 本實施例中設(shè)及的抗菌膚均委托杭州中膚有限公司合成，設(shè)及的大腸桿菌購自 Takara,枯草桿菌和表皮葡萄球菌購自ATCC(美國模式菌種收集中屯、），設(shè)及到其他化學(xué)試 劑及藥品均通過商業(yè)途徑獲得。
[00測 （1)多膚AP16及其衍生物的抗菌實驗
[0029] A.最小殺菌濃度（MBC)的測定
[0030] 分別將革蘭氏陰性菌株大腸桿菌巧.coli D冊a)、革蘭氏陽性菌株枯草桿菌 度.subtilisATCC6633)和表皮葡萄球菌僅epidermidisATCC12228)培養(yǎng)至對數(shù)生長 期，500化pm離屯、10分鐘后用憐酸鐘緩沖液重懸，再次離屯、，500化pm離屯、10分鐘，用憐酸 鐘緩沖液重懸，將菌株稀釋至1X1〇6-2Xl〇6CRJ/ml，待用。在96孔板內(nèi)，分別將多膚P16 及其衍生物用憐酸鐘緩沖液按1:2逐級稀釋，濃度為256yg/ml-1yg/ml，每孔100y1，再 每孔加入100y1稀釋好的W上=種菌株之一，空白孔內(nèi)加入100y1的憐酸鐘緩沖液和 IOOiil已準(zhǔn)備好的菌株，同時每個多膚濃度做兩個復(fù)孔，37°C靜止培養(yǎng)化。將每孔內(nèi)的液 體吹勻，同一多膚濃度的兩個孔內(nèi)的液體加入到一個新的EP管內(nèi)，混勻后取出100y1涂平 板，37°C倒置過液培養(yǎng)。第二天查菌斑數(shù)并記錄，完全沒有菌斑的平板對應(yīng)的最小多膚濃度 為最小殺菌濃度。
[0031] 表3中用最小殺菌濃度值（MBC)表征抗菌膚的抑菌能力，MBC值愈小則說明抑菌能 力愈強(qiáng)。由表3可W看出，AP16-A的抑菌活性最好，最小殺菌濃度在2-16yg/ml之間。后 續(xù)研究選取AP16-A作為主要的研究對象，將多膚AP16-A經(jīng)過電噴霧質(zhì)譜法分析，在質(zhì)譜圖 (圖1)中顯示的分子量2181. 63D與理論分子量2181.抓基本一致，多膚AP16-A的等電點 為9. 87,多膚AP16-A的純度大于98 %。
[0032] 表3多膚AP16及其衍生物的最小殺菌濃度
[0034]B.抑菌活性的測定 W35] 將革蘭氏陰性菌株大腸桿菌化COliD冊a)、革蘭氏陽性菌株枯草桿菌 度.subtilisATCC6633)和表皮葡萄球菌僅epidermidisATCC12228)培養(yǎng)至對數(shù)生長 期，500化pm離屯、10分鐘后用憐酸鐘緩沖液重懸，再次離屯、，500化pm離屯、10分鐘，用憐酸 鐘緩沖液重懸，將菌株稀釋至1X1〇6-2Xl〇6CFU/ml，待用。在96孔板內(nèi)，將多膚AP16-A用憐 酸鐘緩沖液按1:2逐級稀釋，濃度為256yg/ml-1yg/ml，每孔100y1，再每孔加入100y1 稀釋好的^上立種菌株之一，空白孔內(nèi)加入IOOy1的憐酸鐘緩沖液和IOOy1的已準(zhǔn)備好 的菌株，同時每個多膚濃度做兩個復(fù)孔，37°C靜止培養(yǎng)化。將每孔內(nèi)的液體吹勻，同一多膚 濃度的兩個孔內(nèi)的液體加入到一個新的EP管內(nèi)，混勻后取出100y1到裝有900y1液體LB 培養(yǎng)基的EP管內(nèi)，按1:10逐級稀釋至1:103,每個稀釋度各取出100y1涂平板，37°C倒置 過液培養(yǎng)。第二天查菌斑數(shù)并記錄，每個平板上的菌斑數(shù)乘W10再乘W稀釋倍數(shù)為抗菌膚 作用后每毫升內(nèi)未被殺死的細(xì)菌數(shù)量。
[0036] 測定結(jié)果如圖2-4所示，多膚濃度為1/2最小殺菌濃度時，使得超過99 %的大腸桿 菌和表皮葡萄球死亡，超過99. 99 %的枯草桿菌死亡，在1/4最小殺菌濃度時，超過99 %的 枯草桿菌死亡。
[0037] 似細(xì)胞毒性研究
[0038] 抗菌膚的研究面臨的很重要的問題就是對宿主細(xì)胞的毒性，抗菌膚必須能夠區(qū) 分哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
[0039]A.溶血活性實驗
[0040] 新鮮的豚鼠紅細(xì)胞用生理鹽水洗2次，300化pm，離屯、30分鐘，4%重懸到生理鹽水 中。在96孔板內(nèi)按1:2將多膚AP16-A進(jìn)行逐級稀釋，蜂毒膚作為對照組。每孔lOOiil， 再每孔加入100y1豚鼠紅細(xì)胞，37°C培養(yǎng)比。3000巧m，離屯、30min，轉(zhuǎn)移150ul上清至新 的96孔板內(nèi)，450皿測OD值。用生理鹽水和1 %化itonX-IOO作為陰性和陽性對照，1 % TritonX-IOO能夠使豚鼠紅細(xì)胞全部溶血。溶血百分比計算如下： 陽〇川溶血百分比％=[(OD多膚-OD生理鹽水）/(OD Triton-OD生理鹽水）]X 100%
[0042] 檢測結(jié)果如圖5所示。
[0043] 蜂毒膚是由26個氨基酸殘基組成的多膚，分子量2840,其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列 沈Q NO:8為：Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Tyr Tyr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln〇
[0044] 同天然存在的抗菌膚蜂毒膚相比，在最小殺菌濃度時AP16-A幾乎沒有溶血活性， 然而蜂毒膚幾乎造成超過72%的豚鼠紅細(xì)胞溶血。 W45]B.MTT測定細(xì)胞毒性
[0046]hCMEC/D3細(xì)胞（IXIO4)接種于96孔板內(nèi)，每孔IOOii1，過夜培養(yǎng)至匯合率達(dá) 到80 %。多膚1:2逐級稀釋后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，每孔IOOii1，培養(yǎng)化，陰性對照孔內(nèi) 加入IOOyl的細(xì)胞和IOOyl的空的RPMI-1640培養(yǎng)基。5mg/ml的3-(4,5-二甲基嚷 挫-2)-2, 5-二苯基四氮挫漠鹽（MTT)溶液20y1加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，避光解育2小時。 棄去培養(yǎng)基，甲臘晶體用150y1二甲亞諷值MS0)溶液溶解，檢測490皿處光密度（OD)。測 定結(jié)果如圖6所示，同蜂毒膚相比較，AP16-A隨著濃度的增加沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。
[0047] C.小鼠體內(nèi)毒性檢測（極性毒性試驗）
[0048] 4-6周齡，18-20g的BALB/c雌鼠，隨機(jī)分組，每組六只，腹腔注射200mg和400mg 多膚AP16-A，空白對照組注射等體積的生理鹽水。記錄屯天內(nèi)的死亡率和體重變化。由圖 7可知，屯天內(nèi)沒有小鼠死亡，且由圖8可看出，同對照組相比，體重也沒有明顯的變化。 W例 做熱穩(wěn)定性檢測 陽化0] 用水將多膚溶解，分裝于不同的EP管中，放于37 °C，Oh,化，6h，12h，2地，2d，3d， 9d，15d分別收集樣品放于-80°C保存。將樣品進(jìn)行HPLC和抑菌試驗檢測。由表4可知，AP16-A經(jīng)過在37°C下15天的處理后沒有明顯的降解，抑菌濃度和未經(jīng)37°C處理的樣品一 致。由圖9所示，從HPLC的檢測結(jié)果可W看出經(jīng)過15d的37°C的處理，沒有明顯的雜峰出 現(xiàn)。 陽〇5U 表4抗菌膚AP16-A37°C下不同時間的熱穩(wěn)定性檢測
【主權(quán)項】
1. 一種抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列：AsnTrp PheAlalieThrAsnTrpLeuTrpTyrlieLysLysLysLys〇2. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的分子量為2181. 63D，等電點 為 9.87〇3. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽在制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣 譜抗菌藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗菌肽，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。該抗菌肽具有如SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列：Asn？Trp？Phe？Ala？Ile？Thr？Asn？Trp？Leu？Trp？Tyr？Ile？Lys？Lys？Lys？Lys。本發(fā)明的抗菌肽不但對大腸桿菌、枯草桿菌和表皮葡萄球菌等革蘭氏陰性菌和陽性菌都有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性和細(xì)胞毒性，穩(wěn)定性好，抗菌活性強(qiáng)，具有高效廣譜抑菌作用，可作為抗生素替代品使用。
【IPC分類】A61K38/10, C07K7/08, A61P31/04
【公開號】CN105294838
【申請?zhí)枴緾N201510608404
【發(fā)明人】單亞明, 賀曉秋
【申請人】徐州市瑪泰生物科技有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年9月22日