一種滯留效應(yīng)增強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種滯留效應(yīng)增強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚是存在于蛋白簇基端的一段4個氨基酸長度左右的多膚序 列。它可W與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上的蛋白相互作用，使攜帶滯留信號膚的蛋白往返穿梭于內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)與高爾基體中W延長蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體中的滯留時間，達到被充分修飾或降解， 從而影響蛋白質(zhì)的正確折疊與分泌。早期研究認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的滯留信號膚長度是4個氨 基酸，在人體細胞內(nèi)是邸化（RayWiel, I., Alanen,比，Salo, K., Jurvansuu, J., Nguyen, V. D. , Latva-Ranta, M. , and Ruddock, L. "A molecular specificity code for the t虹ee mammalian邸化rec巧tors" ,乂仿心仿'〇7., 2007, 179:1193-1204)， 而在酵母細胞內(nèi)是皿化，目前發(fā)現(xiàn)的有較強滯留效應(yīng)的信號膚是FE皿化（化化am, H. R.， Hardwick, K. G., and Lewis, M. J. "Sorting of soluble ER proteins in yeast", 倒您0乂，1988，7:1757 - 1762)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞體內(nèi)存在不同的滯留信號膚，運會導(dǎo) 致帶有不同滯留信號膚的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的滯留效應(yīng)也不相同，從而直接影響到蛋白的修 飾及分泌功能。（Capitani,M.,and Sallese,M."Hie邸化receptor: new functions for an old protein",陽BSLett. , 2009, 583:3863 - 3871)。
[0003] 在細胞體內(nèi)直接研究相關(guān)的蛋白酶水解反應(yīng)，才能真實解析蛋白酶的生理活 性。然而細胞體內(nèi)低濃度的蛋白酶水解反應(yīng)所產(chǎn)生的計量信號十分微弱，一般的檢測系 統(tǒng)難W檢測，從而使分析細胞體內(nèi)的蛋白酶水解反應(yīng)面臨著計量信號放大的問題。運用 滯留信號膚來增加蛋白底物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留時間和濃度有W下優(yōu)勢：1、不裂解細胞并 且不改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白酶的濃度，從而使蛋白酶水解反應(yīng)處于完全生理狀態(tài)；2、增大底 物濃度可W更全面的解析濃度與活性較低的內(nèi)源蛋白酶反應(yīng)。在最近建立的酵母內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)滯留系統(tǒng)中[Yi,L.,Get)hard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L."EngineeringofTEVproteasevariantsbyyeastERsequestration screening(YESS)ofcombinatoriallibraries^,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 2013, 110(18) :7229-34],已有研究利用強滯留效應(yīng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚來延長蛋白底物 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留時間，W顯著增大底物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的濃度，使蛋白酶即使在低濃度和低 活性狀態(tài)下也可W產(chǎn)生強的水解反應(yīng)信號，從而便于檢測和分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種滯留效應(yīng)增強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚 突變體，將源于酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的滯留信號膚FE皿化進行點突變，得到突變體WE皿化。通過 建立Aga2-FLAG-ERS巧RS, ER sequestration si即al,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚）復(fù)合體，復(fù)合 體在酵母細胞內(nèi)表達展示在細胞表面后，利用FLAG標簽的巧光抗體(Anti-FLAG-APC)對 細胞進行巧光標記，再利用流式細胞儀檢測細胞表面展示的復(fù)合體，檢測的巧光信號通道 是APC。在同樣的電壓值和闊值的條件下，根據(jù)APC信號的強弱，可W判斷酵母細胞表面展 示Aga2-FLAG-ERS復(fù)合體的情況，進而可W推斷出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚的滯留效應(yīng)強弱，巧 光信號越弱，說明滯留信號膚的滯留作用越強。
[0005]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號膚的 Aga2-FLAG-ERS復(fù)合體的基因工程菌的方法，具體包括如下步驟： (1)采用PCR方法克隆得到含有不同滯留信號膚的Aga2-FLAG-ERS復(fù)合體的基因片段。
[0006] (2)將步驟（1)獲得的PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收后，用限制性內(nèi) 切酶PstI和EcoRI雙酶切，酶切體系為：Pst1,0. 5yl;EcoR1,0. 5yl;10X0 buffer，5yl;PCR回收產(chǎn)物，30yl，加d地2〇 至 50 ^1。37°C處理 6h后，用 1% 的 瓊脂糖凝膠回收，再與經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶PstI和EcoRI雙酶切后瓊脂糖凝膠回 收的載體祀SD[Yi,L.,Get)hard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L."EngineeringofTEVproteasevariantsbyyeastERsequestration screening(YESS)ofcombinatoriallibraries^,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 2013, 110 (18) :7229-34]，在16 °C酶連16h，酶連體系為：酶切片段，1.2yI;酶切載體， 0. 3yl;SolutionI燈akaRa公司），5yl;加d地2〇至10yl。酶連產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌化-GOLD(Invitrogen公司)感受態(tài)細胞中，每種滯留信號膚挑選四個轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序 驗證后得到含有不同滯留信號膚突變體的重組質(zhì)粒祀SD-Aga2-FLAG-ERS。
[0007] (3)將步驟（2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母邸YlOO得到基因工程菌：將構(gòu)建 好的重組質(zhì)粒祀SD-Aga2-FLAG-ERS，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母邸YlOO(間 化〇-)中，然后涂布于MD平板。所述MD培養(yǎng)基組成成分為6. 7g/LYNB，20g/L葡萄糖，0.Ig/L亮氨酸，15g/L瓊脂。
[0008] 本發(fā)明要解決的第=個技術(shù)問題是應(yīng)用流式細胞儀檢測不同滯留信號膚的滯留 效果，具體包括如下步驟： (1)將含有帶有不同滯留信號膚質(zhì)粒的釀酒酵母邸YlOO(間化D-)，接種 于YNB-CAA-Glucose培養(yǎng)基中（YNB-CAA-Glucose:20g/L葡萄糖，6.7g/LYNB, 5. 4g/L 胞2冊〇4, 8. 6g/L胞&?〇4*&0and5g/Lcasaminoacids,pH7. 4)，于 30 °C、225rpm培 養(yǎng) 12h。培養(yǎng)至 0成。。=2~3,換YNB-CAA-Galactose(YNB-CAA-Galactose:20g/L半乳糖， 6. 7g/LYNB, 5. 4g/L船2冊〇4, 8. 6g/L胞&口〇4*&0and5g/Lcasaminoacids,pH7. 4) 培養(yǎng)基誘導(dǎo)并使起始ODew=O. 5,于30 °C、225巧m培養(yǎng)，誘導(dǎo)化和化后取樣。
[0009] (2)每次取樣取IO6個細胞，先用溶液A(IXPBS，0. 5%BSA，ImM邸TA，pH7. 4)洗一 次，再用溶液B(1XPBS，0. 5%BSA，pH7. 4)洗一次。整個過程應(yīng)在冰上操作，轉(zhuǎn)速為3000巧m， 離屯、2min。最后用20y1溶液B和0. 3y1巧光抗體Anti-FLAG-APC(GenScript公司， 0. 5yg/y1)重懸，