專利名稱：：運用復(fù)合熒光pcr技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗技術(shù)，具體地說是運用熒光PCR反應(yīng)來檢測致病細(xì)菌，特別是食源性致病腸桿菌的技術(shù)，
背景技術(shù)：
：食品中常見的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人們的健康，食品中常見的致病菌主要是腸桿菌.快速、準(zhǔn)確的檢測食品中的致病菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的前提條件，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食品檢驗檢疫工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡單生化實驗水平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)發(fā)展，但是分子生物學(xué)的檢測方法在短期內(nèi)仍然難以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生化鑒定，目前分子生物學(xué)方法主要用于大量樣品的初篩，需要檢測的食源性腸桿菌主要包括以下幾種志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌0157:H7等.
發(fā)明內(nèi)容針對上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快速低成本的檢測志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌0157:H7方法，該方法包括應(yīng)用該方法檢測食源性病原微生物的所使用的引物組和與之配套的PCR反應(yīng)條件.其中引物、探針的全部序列如下引物t引物序列一5'CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列二5'TCTTTAAGAATCTGGATCAAGCTGAAA引物序列三5,CGAATGTGTCACCACATTCTCACCT引物序列四5'GGTAAAGAGGTTCTGACTACACGATG引物序列五5,CCCCATCGTGTAGTCAGAACCTCT引物序列六5'ATTTGAAGAGGT1T1AACTACATGTTAT引物序列七5，ATAACATGTAGTTAAAACCTCTTCAAAT引物序列八5,TGAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG引物序列九5，ATATGTCAACCTCTGACTGATAGTCTGA引物序列十5,CTTTATGAAAGCCTGCGAGTAAAG引物序列十-一5，CTGTTATGCTGGCTATCAGTCCTCT本發(fā)明提供了更加快速和低成本通過熒光PCR方法檢測食源性致病腸桿菌的方法,本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的(1)設(shè)計特異性寡核苷酸引物用于熒光染料嵌合熒光PCR技術(shù)檢測(2〉整合各引物使之不相互干擾*(3〉以引物序列組，擴增待測樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴增豕(4)擴增過程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實時熒光光強度淵i并在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行所合成DNA片段的熔解曲線的測定，并將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到各種病原微生物的特異性熔解曲線的峰值.本發(fā)明的體系l用特異性的引物組擴增沙門氏菌、志賀氏菌、小腸耶爾森氏菌的基因組均產(chǎn)生熒光信號，并生成相應(yīng)的熔解曲線峰值，均未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果.本發(fā)明中熒光PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95"IO分鐘；(2)95"15秒；(3)60"C30秒；(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)95"C2分(6)梯度升溫60"C至95*C每秒上升0,2"C。熒光PCR結(jié)果在擴增過程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實時熒光光強度淵量，并在PCR擴增程序結(jié)束后進(jìn)行梯度升溫淵定擴增片段的熔解溫度.將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到進(jìn)行特異性擴增產(chǎn)生的熒光，可得到對志賀氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(771C±0.31C):小腸耶爾森氏菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74"C土0,31C):沙門氏菌屬的特異性片段所特有的培解曲線雙峰值(81匸土0.31C和84.51C±0.3*C),如果得到對志賀氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(771C±0.31C),則證明待測樣品中存在志賀氏菌如果得到對小腸耶爾森氏菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74"C土0.310),則證明待測樣品中含有小腸耶爾森氏菌沙門氏菌屬的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(81"士0.3TC和84.5"C士0.3X:)則證明待測樣品中含有沙門氏菌。如出現(xiàn)其他結(jié)果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在志賀氏菌，沙門氏菌以及小腸耶爾森氏菌，霈重新檢驗.本發(fā)明的體系2用特異性的引物組擴增大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌的基因組均產(chǎn)生熒光信號，并生成相應(yīng)的熔解曲線峰值，均未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果.本發(fā)明中熒光PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12.5jiL熒光嵌合法所用引物序列八0早熒光嵌合法所用引物序列九熒光嵌合法所用引物序列十10pmol/L0舉熒光嵌合法所用引物序列十一10pmol/LDNA樣品叫雙蒸水IO早總體積25nL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘(2)95"C15秒；(3)60r30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次；(5〉951C2分(6)梯度升溫601C至951C每秒上升0.210.熒光PCR結(jié)果在擴增過程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實時熒光光強度測量，并在PCR擴增程序結(jié)束后進(jìn)行梯度升溫測定擴增片段的港解溫度.將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到進(jìn)行特異性擴增產(chǎn)生的熒光，可得到對大腸桿菌0"7:H7株的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(77.51C±0.31C)和出血性大腸桿菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(74*C±0.31C),如果得到對大腸桿菌0157:117株的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(77.51C±0.3*C),則證明待測樣品中存在大腸桿菌0"7:H7株如果得到對出血性大腸桿菌的特異性片段所特有的熔解曲線峰值(741C±0.3'C)則證明待測樣品中含有出血性大腸桿菌。如出現(xiàn)其他結(jié)果則表明此次檢驗失敗不能確定是否存在大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是基于熒光PCR的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴增靶基因，從而細(xì)菌，而且使用本方法只需要一次兩管熒光PCR反應(yīng)就能夠檢測出志賀氏菌、沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌、大腸桿菌0"7:H7株和出血性大腸桿菌，能夠節(jié)約檢溯成本和時間.熒光PCR方法具有檢測準(zhǔn)確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌，它用PCR的方法擴增細(xì)菌靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時間PCR鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。圖1某待測鮮肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度.圖2某待測鮮肉樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴增產(chǎn)物熔解溫度峰值。圖3某待測餅干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待淵樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度，圖4某待測餅干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴增產(chǎn)物熔解溫度峰值。圖5某待測原料奶樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度，圖6某待測原料奶樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA，擴增產(chǎn)物熔解溫度峰值。圖7某待測牛肉瞎頭樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度*圖8某待測牛肉瞎頭樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴增產(chǎn)物熔解溫度峰值.圖9某待測豆腐干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,SYBRGreen熒光信號強度，圖10某待淵豆腐干樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測待測樣品DNA,擴增產(chǎn)物熔解溫度峰值。具體實旌方式下面結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述.實施例l樣本某處出口鮮肉.用常規(guī)生理、生化方法檢測出志賀氏菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎.(2)溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37TC培養(yǎng)8小時，2.DNA抽提取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入1(KVL溶菌瞎溶液，37"保溫10分鐘，補加TE緩沖液500jiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入50nLTE溶液，置-20*0保存，3.PCR擴增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍熒光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L0.3)iL熒光嵌合法所用引物序列二10拜1/L0.3fiL熒光嵌合法所用引物序列三1O拜ol/L0.6)iL熒光嵌合法所用引物序列四1(HunoI/L0.3|iL熒光嵌合法所用引物序列五10拜1/L0.3)iL熒光嵌合法所用引物序列六10,ol/L0.6)iL熒光嵌合法所用引物序列七10拜ol/L0單DNA樣品雙蒸水總體積25iL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為《(1)951CIO分鐘(2)95"15秒；(3)30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)95^C2分(6)梯度升溫60X:至951C每秒上升0.210,PCR共進(jìn)行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖1.陰性對照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)志賀氏菌屬的特征峰值如圖2，圖1中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結(jié)果。圖2中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中志賀氏菌屬的特征峰值。實驗表明樣品中含有志賀氏菌.3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為福氏志賀氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ810*熒光PCR檢驗結(jié)果與生化檢淵結(jié)果一致*實施例2樣本某處出口餅干*用常規(guī)生理、生化方法檢測出沙門氏菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)溶解于1升營養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時，2.DNA抽提取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100^L溶菌酶溶液，371C保溫10分鐘，補加TE緩沖液500fiL，振蕩混勻，加同體積Tris飽和盼(pH8.0),強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重復(fù)酚抽提*取上淸液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2moi/L),混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上淸，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上淸,加入50iiLTE溶液，置-20C保存，3.PCR擴增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12單熒光嵌合法所用引物序列一1O萍o(jì)l/L熒光嵌合法所用引物序列二1(Hunol/L0.3^L熒光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0單熒光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3iL熒光嵌合法所用引物序列五10拜ol/L0.3fiL熒光嵌合法所用引物序列六10萍o(jì)l/L0單熒光嵌合法所用引物序列七10拜ol/L0.6(iLDNA樣品雙蒸水8單總體積25nL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)951CIO分鐘,(2)951C15秒(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)951C2分(6)梯度升溫601C至951C每秒上升0.2"0.PCR共進(jìn)行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為《本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖3。陰性對照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)沙門氏菌屬的特征峰值如圖4.圖3中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結(jié)果，圖4中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中沙門氏菌屬的特征峰值.實驗表明樣品中含有沙門氏菌.3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為腸炎沙門氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ815,熒光PCR檢驗結(jié)果與生化檢渕結(jié)果一致.實施例3樣本某處送檢的原料奶.用常規(guī)生理、生化方法檢測出小腸耶爾森氏菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢淵食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克離心*(2)沉淀物重新溶解于1升營養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時.2.DNA抽提取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100nL溶菌醉溶液，371C保溫10分鐘，補加TE緩沖液500jiL，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重復(fù)酚抽提，取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2moI/L),混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清,加入5(HiLTE溶液，置-201C保存.3.PCR擴增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12.5jiL熒光嵌合法所用引物序列一10pmol/L0.3^L熒光嵌合法所用引物序列二10拜ol/L0早熒光嵌合法所用引物序列三0.6fiL熒光嵌合法所用引物序列四10,1/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列五10,1/L0.3}iL熒光嵌合法所用引物序列六10拜ol/L0.64熒光嵌合法所用引物序列七10,1/L0.6&DNA樣品雙蒸水8.5&總體積25熒光PCR擴增程序及測定擴増片段的熔解溫度程序為(1)95*CIO分鐘(2)951C15秒；(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)2分(6)梯度升溫60TC至每秒上升0.2*0,PCR共進(jìn)行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA;無樣品的陰性對照.4.被檢擁樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖5*陰性對照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)小腸耶爾森氏菌的特征峰值如圖6.圖5中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結(jié)果，圖6中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中小腸耶爾森氏菌的特征峰值。實驗表明樣品中含有小腸耶爾森氏菌，3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為小腸耶爾森氏菌，將其中一個菌株命名為CIQ919.熒光PCR檢驗結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致.實施例4樣本某處送檢的肉瞎頭.用常規(guī)生理、生化方法檢測出大腸桿菌Om7:H7疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)處理后的樣品溶解于1升營養(yǎng)肉湯中37C培養(yǎng)8小時，2.DNA抽提取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌雜溶液，37"C保溫10分鐘，補加TE緩沖液500jiL,振蕩混勻.加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上淸液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2邁ol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上淸,加入5(HiLTE溶液，置-20X:保存.3.PCR擴增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)泡合物2倍12早熒光嵌合法所用引物序列八1Ofunol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列九0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列十10拜ol/L0.3^L熒光嵌合法所用引物序列十一10拜ol/L0舉DNA樣品1&雙蒸水10.3nL總體積25jiL熒光PCR擴增程序及潿定擴增片段的熔解溫度程序為《(1)95"CIO分鐘(2)951C15秒(3)601C30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)95匸2分(6)梯度升溫60*0至95"C每秒上升0.210。PCR共進(jìn)行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照.4.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖7，陰性對照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀測擴增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)大腸桿菌0W:H7的特征峰值如圖8,圖7中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結(jié)果，圖8中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中大腸桿菌OIS7:H7的特征蜂值*實驗表明樣品中含有大腸桿菌01S7:H7.3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢溯證明，所檢驗的目的菌落為大腸桿菌0w:H7，將其中一個菌株命名為CIQ869.熒光PCR檢驗結(jié)果與生化檢測結(jié)果一致.實施例5樣本某處送檢的豆腐干。用常規(guī)生理、生化方法檢測出出血性大腸桿菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢淵食源性致病菌的檢測1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎.(2)處理后的樣品溶解于1升營養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時.2.DNA抽提取營養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37"C保溫10分鐘，補加TE緩沖液500jiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上淸液，重復(fù)酚抽提.取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醉，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘,棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50nLTE溶液，置-20"C保存.3.PCR擴增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12單熒光嵌合法所用引物序列八0.3^L熒光嵌合法所用引物序列九{IO,oIZL0.3|iL熒光嵌合法所用引物序列十10拜1/L0.3&熒光嵌合法所用引物序列十一0.3^LDNA樣品1&雙蒸水10.3nL總體積25jiL熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為:(1)95X:IO分鐘(2)95"C15秒(3)60"30秒；(4)回到第(2)步，重復(fù)40次；(5)95"2分；(6)梯度升溫至95*0每秒上升0.210,PCR共進(jìn)行2管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為，本待測樣品DNA:無樣品的陰性對照，4.被檢淵樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過程中可以觀察到本待測樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖9,陰性對照在PCR過程中沒有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過觀淵擴增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)出血性大腸桿菌的特征峰值如圖10.圖9中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強度信號是樣品中DNA擴增結(jié)果.圖10中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中出血性大腸桿菌的特征峰值*實驗表明樣品中含有出血性大腸桿菌.3天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落為出血性大腸桿菌，將其中一個菌株命名為CIQ639.熒光PCR檢驗結(jié)果與生化檢淵結(jié)果一致.序列列表SEQUENCELISTING<110>中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局<120>運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法<130>2007118<160>11<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>人工合成<220><221>prima一bind<222>(1)..(26)<400>1ccgtgtacgcttagtcgcttaacctc26<210>2<211>27<212>DNA<213>人工合成<400>15tgttaataagagcacaactagtaagccttgcctcactgacagtggaatatg51〈210〉16<211>51<212>DNA〈213>Homosapiens<400>16tgttaataagagcacaactagtaagacttgcctcactgacagtggaatatg51<210>17<211>51〈212〉DNA<213>Horaosapiens<400>17tggtggtaggaattgtatttttttttattttacttttaactgacacataat￡51<210〉<211〉<212>〈213〉1850DNAHomosapiens〈400>18t.Rgtgg'aggafittgtatttttttl:att.ttartt-ttnactgacacat朋t<210><211〉<212>〈213>1951DNAHomosapiens<400>19ttcaggaggcgctatcacacttggtgtgacatcaagataaagagcggaggt51<210>20<211>51<212>DNA〈213>Homosapiens<400>20ttcaggaggcgctatcacacttggtatgacatcaagataaagagcggaggt51<210>21<211>51〈212〉醒<213>Homosapiens<400>21ggcatagagcttgaaattcatttatatatactaa鄉(xiāng)aaaaactcataact51ccccatcgtgtagtcagaacctct<210>6<211>28<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer_bind<222>(1)"(28)<400>6atttgaagaggttttaactacatgttat<210>7<211>28<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(28)<400>7ataacatgtagttaaaacctcttcaaat<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(23)<400>8tgaacaggaggtttctgcgttag<210>9<211>27<212>DNA24282823<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(27)<400>9atatgtcaacctctgactgatagtctg27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(24)<400>10ctttatgaaagcctgcgagtaaag2<210>11<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(25)<400>11ctgttatgctggctatcagtcctct2權(quán)利要求1.一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法，其特征在于，所使用的引物組序列如下引物引物序列一5’CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列二5’TCTTTAAGAATCTGGATCAAGCTGAAA引物序列三5’CGAATGTGTCACCACATTCTCACCT引物序列四5’GGTAAAGAGGTTCTGACTACACGATG引物序列五5’CCCCATCGTGTAGTCAGAACCTCT引物序列六5’ATTTGAAGAGGTTTTAACTACATGTTAT引物序列七5’ATAACATGTAGTTAAAACCTCTTCAAAT引物序列八5’TGAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG引物序列九5’ATATGTCAACCTCTGACTGATAGTCTGA引物序列十5’CTTTATGAAAGCCTGCGAGTAAAG引物序列十一5’CTGTTATGCTGGCTATCAGTCCTCT。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系1中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12.5jiL引物序列一10|imol/L0.3jiL引物序列二10funol/L0.3nL引物序列三10拜ol/L0.6(iL引物序列四10拜ol/L0.3jiL引物序列五10拜ol/L0單引物序列六10[imol/L0.64引物序列七0單DNA樣品l(iL雙蒸水8.54總體積25*3.種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法,其特征在于，PCR反應(yīng)體系2中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12單引物序列八10拜ol/L0.3jiL引物序列九10拜ol/L0舉引物序列十1(Hunol/L0.3jiL引物序列十一10拜ol/L0攀DNA樣品雙蒸水10.3fiL總體積25^L*4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢溯食源性致病腸桿菌的方法，其特征在于，熒光PCR擴增程序及測定擴增片段的熔解溫度程序為(1)95*0IO分鐘(2)95"15秒(3)65X:30秒；(4)回到第(2)步，重復(fù)40次；(5)95"C2分(6)梯度升溫60卩至95"每秒上升0.210.5.權(quán)利要求1所述的一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)在檢測食源性致病腸桿菌方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測食源性致病腸桿菌的方法，屬于細(xì)菌檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要的技術(shù)方案是設(shè)計了引物組序列。致病腸桿菌是食品中常見的致病菌，嚴(yán)重威脅著人們的健康。快速、準(zhǔn)確的檢測食品中的致病腸桿菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的主要前提條件。需要檢測的食源性致病腸桿菌主要包括以下幾種志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌O157:H7。針對上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種運用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快速低成本的檢測志賀氏菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、出血性大腸桿菌和大腸桿菌O157:H7的方法。該方法可以使用兩管PCR反應(yīng)，能夠初篩出上述幾種病原微生物。文檔編號G01N33/52GK101113471SQ200710057578公開日2008年1月30日申請日期2007年6月7日優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日發(fā)明者佳于,寅劉,葉露萌,唐丹舟,張宏偉,李永君,鄭文杰,魏亞東,黃熙泰申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心;南開大學(xué)