一種高純度京尼平的結晶方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體是涉及一種高純度京尼平的結晶方法。
【背景技術】
[0002]京尼平是源于梔子果實中的環(huán)烯醚萜苷-京尼平苷。它主要用于傳統(tǒng)中藥，以緩解II型糖尿病的癥狀。京尼平(Genipin)是一種很好的蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖的天然交聯(lián)劑。鼠靜脈注射(LD50)的實驗表明它是低急性毒性，因此，毒性遠低于戊二醛和許多其他常用交聯(lián)劑。與其他材料的交聯(lián)可用于制作生物材料，如人造骨骼、傷口包扎材料等。它也可用于制藥，如肝臟疾病控制，降壓，通便；用做指紋采集試劑；也可用作固定化酶和控釋藥物的交聯(lián)劑。
[0003]目前，京尼平的制備方法主要有提取法和生物法。提取法是直接從植物組織(如梔子果實)中提取分離京尼平苷，再用葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空濃縮、重結晶而制得。但由于京尼平活性高，在自然界中很少獨立存在(桅子果實中的含量也僅為
0.005?0.01%)，因此直接提取法不僅工藝復雜，且提取率低。生物法是以京尼平苷為底物，經(jīng)酶水解糖苷鍵得到京尼平。由于該方法反應路線短，反應條件溫和，且梔子苷來源豐富，因此生物法已成為京尼平制備的主要技術路線。但是目前生物法得到的京尼平一般純度都不是很高，因此制備出高純度的京尼平是目前研究的重點和難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種高純度京尼平的結晶方法，以制備純度高的京尼平。
[0005]本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn):
除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。
[0006]—種高純度京尼平的結晶方法，包括以下步驟:
(1)纖維素酶液的制備:將纖維素酶固體加入到pH為5.0?5.2的緩沖溶液中，使纖維素酶的濃度為4?10%，然后置于50°C下超聲提取30min后，經(jīng)抽濾得到酶液；
(2)京尼平溶液的制備:按京尼平苷占酶液質(zhì)量的2?5%，在京尼平苷中加入步驟(1)所得酶液，再置于50°C恒溫水浴鍋中，發(fā)酵反應1.5?2h，取出冷卻后即得到京尼平溶液；
(3)京尼平的粗分離:按無水乙醇與京尼平溶液的體積比為(1?2): (1?2)，在步驟(2)所得京尼平溶液中加入無水乙醇溶液中，使之充分混勻，然后經(jīng)抽濾去除不溶物，得京尼平粗溶液，將其真空干燥得到京尼平粗粉末；
(4)京尼平的萃取純化:按京尼平粗粉末與有機溶劑的固液比g/mL計為1:(10?100);將步驟(3)所得京尼平粗粉末加入有機溶劑中進行超聲萃取數(shù)次，合并萃取液，再在萃取液中加入活性炭進行超聲脫色，經(jīng)過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積的3?5%，取出置于常溫條件下進行結晶，即得到高純度的京尼平。
[0007]所述步驟(1)的緩沖溶液為乙酸鈉:乙酸或磷酸氫二鈉:檸檬酸的體積比為3?8:2?10:1?6的混合溶液。
[0008]所述步驟(4)的有機溶劑為無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的任意一種。
[0009]所述步驟(4)的活性炭加入量是占萃取液的1?2%。
[0010]本發(fā)明是在生物法制備京尼平的基礎上，用重結晶來精制純化以得到高純度的京尼平，純度達到98%以上。且該結晶方法比文獻報道過的結晶方法更簡單易得，不需要昂貴的儀器試劑，所用試劑低毒性，不污染環(huán)境，適用于高純度京尼平的制備。
[0011]相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點:
1、本發(fā)明利用京尼平易溶于無水乙醇等有機溶劑的特點，用無水乙醇提取發(fā)酵后得到的京尼平粗品，然后又用乙酸乙酯等有機溶劑萃取京尼平粗品，結晶得到高純度的京尼平，這樣達到了雙重萃取的目的，京尼平萃取率增加，而且結晶得到的京尼平純度也很高；目前常規(guī)生物法得到的京尼平一般純度都不是很高，原因分析是含有梔子苷或者天然色素類物質(zhì)導致的；本發(fā)明均能有效克服；
2、利用乙酸乙酯等有機溶劑來萃取京尼平粗品，然后結晶，它有很強的專屬性，因此不會產(chǎn)生干擾；
3、此種工藝簡單、對設備要求不高、投資成本低、經(jīng)濟效益高。
[0012]4、結晶條件是常溫，也不會產(chǎn)生任何環(huán)境污染，操作簡單。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明步驟(2)的化學反應式。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步地說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0015]實施例1
(1)纖維素酶液的制備:將40g纖維素酶固體加入到pH為5.1的緩沖溶液中，使纖維素酶的濃度為4%，然后置于50°C下超聲提取30min后，經(jīng)抽濾得到酶液；其中緩沖溶液為乙酸鈉:乙酸:檸檬酸的體積比為5:8:3的混合溶液；
(2)按京尼平苷占酶液質(zhì)量的2.5%，在10g京尼平苷中加入步驟(1)所得酶液，再置于50°C恒溫水浴鍋中，發(fā)酵反應1.8h，取出冷卻后即得到京尼平溶液；
(3)京尼平的粗分離:按無水乙醇與京尼平溶液的體積比為1:1，在步驟(2)所得京尼平溶液中加入無水乙醇溶液中，使之充分混勻，然后經(jīng)抽濾去除不溶物，得京尼平粗溶液，將其真空干燥得到京尼平粗粉末；
(4)京尼平的萃取純化:按京尼平粗粉末與有機溶劑的固液比g/mL計為1:50;將步驟
(3)所得京尼平粗粉末加入乙酸乙酯中進行超聲萃取數(shù)次，合并萃取液，再在萃取液中加入占萃取液1.5%的活性炭進行超聲脫色30min，經(jīng)過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積的4%，取出置于常溫條件下進行結晶，即得到高純度的京尼平。通過HPLC檢測其含量達到 98.3%ο
[0016]實施例2
(1)纖維素酶液的制備:將纖維素酶固體加入到pH為5.2的緩沖溶液中，使纖維素酶的濃度為10%，然后置于50°C下超聲提取30min后，經(jīng)抽濾得到酶液；其中緩沖溶液為乙酸鈉:磷酸氫二鈉:檸檬酸的體積比為8:10:6的混合溶液；
(2)按京尼平苷占酶液質(zhì)量的5%，在京尼平苷中加入步驟(1)所得酶液，再置于50°C恒溫水浴鍋中，發(fā)酵反應2h，取出冷卻后即得到京尼平溶液；
(3)京尼平的粗分離:按無水乙醇與京尼平溶液的體積比為1:2，在步驟(2)所得京尼平溶液中加入無水乙醇溶液中，使之充分混勻，然后經(jīng)抽濾去除不溶物，得京尼平粗溶液，將其真空干燥得到京尼平粗粉末；
(4)京尼平的萃取純化:按京尼平粗粉末與有機溶劑的固液比g/mL計為1:100;將步驟
(3)所得京尼平粗粉末加入無水乙醇中進行超聲萃取數(shù)次，合并萃取液，再在萃取液中加入占萃取液2%的活性炭進行超聲脫色，經(jīng)過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積的5%，取出置于常溫條件下進行結晶，即得到高純度的京尼平。通過HPLC檢測其含量達到98.5%。
[0017]實施例3
(1)纖維素酶液的制備:將纖維素酶固體加入到pH為5的緩沖溶液中，使纖維素酶的濃度為8%，然后置于50°C下超聲提取30min后，經(jīng)抽濾得到酶液；其中緩沖溶液為乙酸鈉:乙酸:檸檬酸的體積比為3:2:1的混合溶液；
(2)按京尼平苷占酶液質(zhì)量的2%，在京尼平苷中加入步驟(1)所得酶液，再置于50°C恒溫水浴鍋中，發(fā)酵反應1.5h，取出冷卻后即得到京尼平溶液；
(3)京尼平的粗分離:按無水乙醇與京尼平溶液的體積比為2:1，在步驟(2)所得京尼平溶液中加入無水乙醇溶液中，使之充分混勻，然后經(jīng)抽濾去除不溶物，得京尼平粗溶液，將其真空干燥得到京尼平粗粉末；
(4)京尼平的萃取純化:按京尼平粗粉末與有機溶劑的固液比g/mL計為1:10;將步驟
(3)所得京尼平粗粉末加入丙酮中進行超聲萃取數(shù)次，合并萃取液，再在萃取液中加入占萃取液1%的活性炭進行超聲脫色，經(jīng)過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積的3%，取出置于常溫條件下進行結晶，即得到高純度的京尼平。通過HPLC檢測其含量達到99.2%。
[0018]實施例4
同實施例3，僅將步驟(4)的丙酮替換為乙醚。通過HPLC檢測其含量達到99.5%。
【主權項】
1.一種高純度京尼平的結晶方法，其特征在于包括以下步驟: (1)纖維素酶液的制備:將纖維素酶固體加入到pH為5.0?5.2的緩沖溶液中，使纖維素酶的濃度為4?10%，然后置于50°C下超聲提取30min后，經(jīng)抽濾得到酶液； (2)京尼平溶液的制備:按京尼平苷占酶液質(zhì)量的2?5%，在京尼平苷中加入步驟(1)所得酶液，再置于50°C恒溫水浴鍋中，發(fā)酵反應1.5?2h，取出冷卻后即得到京尼平溶液； (3)京尼平的粗分離:按無水乙醇與京尼平溶液的體積比為(1?2): (1?2)，在步驟(2)所得京尼平溶液中加入無水乙醇溶液中，使之充分混勻，然后經(jīng)抽濾去除不溶物，得京尼平粗溶液，將其真空干燥得到京尼平粗粉末； (4)京尼平的萃取純化:按京尼平粗粉末與有機溶劑的固液比g/mL計為1:(10?100);將步驟(3)所得京尼平粗粉末加入有機溶劑中進行超聲萃取數(shù)次，合并萃取液，再在萃取液中加入活性炭進行超聲脫色，經(jīng)過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積的3?5%，取出置于常溫條件下進行結晶，即得到高純度的京尼平。2.根據(jù)權利要求1所述的結晶方法，其特征在于:所述步驟(1)的緩沖溶液為乙酸鈉:乙酸或磷酸氫二鈉:檸檬酸的體積比為3?8:2?10:1?6的混合溶液。3.根據(jù)權利要求1所述的結晶方法，其特征在于:所述步驟(4)的有機溶劑為無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的任意一種。4.根據(jù)權利要求1所述的結晶方法，其特征在于:所述步驟(4)的活性炭加入量是占萃取液的1?2%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高純度京尼平的結晶方法，先將京尼平苷與纖維素酶液發(fā)酵，再加入無水乙醇溶液混勻后，抽濾除去不溶物，濾液真空干燥后得到京尼平粗品，然后再用有機溶劑萃取，合并萃取液，用活性炭脫色后，濃縮至一定體積后置于常溫下結晶，得到京尼平純品。本發(fā)明達到了雙重萃取的目的，京尼平萃取率增加，而且結晶得到的京尼平純度也很高；利用有機溶劑來萃取京尼平粗品，然后結晶，它有很強的專屬性，因此不會產(chǎn)生干擾；結晶條件是常溫，也不會產(chǎn)生任何環(huán)境污染，操作簡單。
【IPC分類】C12P17/06, C07D311/94
【公開號】CN105294640
【申請?zhí)枴緾N201510858292
【發(fā)明人】李定忠
【申請人】云南麥瑞科生物科技有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月30日