5-30°C，最適生長(zhǎng)抑為7. 0,在R2A培養(yǎng)基上培養(yǎng)Ξ 天后，呈現(xiàn)黃色圓形菌落，邊緣光滑凸起，菌落直徑約1. 5-1.8mm。 陽(yáng)03U 16SrDM鑒定：利用細(xì)菌的16SrDM通用引物 (27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），提取菌株CW574的基因組DM作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。菌株CW574的16S rDNA序列如沈QIDNo. 1所示。 陽(yáng)0巧 3、菌株的培養(yǎng)
[0033] 最適固體培養(yǎng)基為：膜蛋白腺17.0g/l，大豆腺3.0g/l，葡萄糖2. 5g/l，^C1 5.0g/l，K2HP〇4 2. 5g/l，瓊脂20.0g/L。最適液體培養(yǎng)基為上述配方中不含瓊脂。
[0034]最適培養(yǎng)條件為：30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)4她。
[0035] 實(shí)施例2高效液相色譜法檢測(cè)菌株CW574的降解特性
[0036] 降解菌株降解動(dòng)態(tài)檢測(cè)：將降解菌株CW574在最適固體培養(yǎng)基上連續(xù)活化2代，接 種于4mL液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，獲得新鮮菌液。將50μL新鮮菌液分別接種于4mL0TA測(cè) 試培養(yǎng)基（含20. 0μg/L0TA)和AFB1測(cè)試培養(yǎng)基（含20. 0μg/LAFB1)，將接種后的試管 振蕩培養(yǎng)化、1化、24h和4她，每個(gè)降解實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。W大腸桿菌K12(E.coliK12) 為陰性對(duì)照菌株。培養(yǎng)結(jié)束后混勻，800化/min離屯、lOmin后，分別收集上清液和菌體沉淀。
[0037] 降解上清液分別經(jīng)過(guò)0TA免疫親和柱與AFB1免疫親和柱，甲醇洗脫，收集洗脫液 于玻璃進(jìn)樣瓶中，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（GB/T25220-2010和GB/T18979-2003)進(jìn)行 0TA和AFB1殘留量的高效液相色譜巧光檢測(cè)（HPLC-FLD)。離屯、后的菌體沉淀，采用色譜純 的甲醇進(jìn)行重懸混勻，劇烈震蕩lOmin提取細(xì)胞吸附的殘留毒素，離屯、后棄沉淀，上清液過(guò) 0. 22μπι濾膜后通過(guò)HPLC-FLD進(jìn)行細(xì)胞吸附的殘留毒素檢測(cè)。
[0038] 降解菌株酶學(xué)特征檢測(cè)：將降解菌株CW574在最適固體培養(yǎng)基上連續(xù)活化2代，將 活化后的菌株接種于50mL液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，獲得0成。。=0.8的新鮮菌液。將菌液 混勻，分裝于50血離屯、管中，lOOOOr/min離屯、15min，棄沉淀。準(zhǔn)確量取培養(yǎng)上清液40血 于無(wú)菌的潔凈Ξ角瓶中，分別添加髓曲霉毒素A/黃曲霉毒素B1，使其終濃度達(dá)到20μg/L。 將配制好的Ξ角瓶30°C避光靜置培養(yǎng)，于化、1化、24h和4化取樣檢測(cè)OTA/AFBl的殘留濃 度。每個(gè)降解實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并WE.coliK12為陰性對(duì)照菌株。將取出的樣本分裝于 2mL離屯、管中，離屯、，棄沉淀。上清液分別經(jīng)過(guò)0TA免疫親和柱與AFB1免疫親和柱，甲醇洗 脫，收集洗脫液于玻璃進(jìn)樣瓶中，分別進(jìn)行0TA和AFB1殘留量檢測(cè)。
[0039]HPLC檢測(cè)0TA條件為：流動(dòng)相：乙臘：水：乙酸（體積比96:102:4)，巧光檢測(cè) 器：激發(fā)波長(zhǎng)333皿，發(fā)射波長(zhǎng)460皿，流速：1. 0血/min,進(jìn)樣量：20μ1，色譜柱：Cis色譜柱 (4.6X250mm，填料直徑5μmWaters) ;HPLC檢測(cè)AFB1條件為：流動(dòng)相：甲醇：水（體積比 45:55)，巧光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)360皿，發(fā)射波長(zhǎng)420皿，流速：0.8血/min,進(jìn)樣量：20μ1，色 譜柱：Cls色譜柱（4.6X250mm，填料直徑5μmWaters)，0.05%艦溶液柱后衍生法。
[0040] 菌株CW574對(duì)曲霉毒素的動(dòng)態(tài)降解曲線如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CW574菌株處 理12h，對(duì)0ΤΑ的降解率為53. 1 %，處理4她降解率達(dá)到90. 1 % ;處理1化對(duì)AFB1的降解 率為42. 5%，處理4化后降解率超過(guò)85. 5%。用菌株CW574處理毒素復(fù)合污染的飼料（終 濃度分別為20μg/kg)，4化對(duì)0TA降解率為48. 3%，AFB1降解率為52. 1 %。
[0041] 降解菌株酶學(xué)特征檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，菌株CW574對(duì)0TA和AFB1的降解機(jī)理主 要為胞內(nèi)酶促降解作用，胞外粗酶液處理4化對(duì)0TA(終濃度20μg/L)的降解率為17. 7 %; 對(duì)AFB1 (終濃度20μg/L)的降解率為40.6%。
[0042] 實(shí)施例3菌株CW574在玉米豆巧型飼料脫毒處理中的應(yīng)用
[0043] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0044] 菌種活化培養(yǎng)基I:膜蛋白腺17.Og/l，大豆腺3.Og/l，葡萄糖2. 5g/l，^Cl 5.Og/l，K2HPO42. 5g/l，瓊脂 20.Og/L。
[0045] 菌種活化培養(yǎng)基II :蛋白腺5.Og/l，牛肉膏30.Og/L，化Cl5.Og/L，抑7. 0-7. 2。
[0046] 上述培養(yǎng)基均在120°C下高壓滅菌15min，實(shí)驗(yàn)飼料為玉米豆巧型日糧。 W47] 2、實(shí)驗(yàn)方法 W48] 向50血憐酸鹽緩沖液中加入適量0TA和AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混勻后立即傾注于lOOg已粉碎好的飼料樣品中，攬拌均勻，使0TA和AFB1的終濃度分別達(dá)到40. 0μg/kg，飼 料于陰涼通風(fēng)處驚干待用。在固體活化培養(yǎng)基I上連續(xù)活化待測(cè)菌種2代，將活化后的菌 種接種于150血液體活化培養(yǎng)基II培養(yǎng)4她，獲得0的。。=1.0的新鮮菌液。取100血新鮮 菌液與lOOg制備好的復(fù)合污染飼料混合均勻，將配制好的樣品在35°C條件下培養(yǎng)，于化、 1化、24h和4化取樣，每個(gè)降解實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。同時(shí)，WlOOmL新鮮空白培養(yǎng)基與lOOg 制備好的污染毒素混合均勻混合作為陰性對(duì)照處理。處理組和空白對(duì)照組每次取樣15g，立 即進(jìn)行0TA和AFB1提取和分析。 W例毒素的提取與純化。稱取lOg培養(yǎng)后的樣品于150mL具塞S角瓶?jī)?nèi)，加入Ig化C1 和20血甲醇-水混合液（體積比4:1)，常溫震蕩提取30min，取下瓶塞經(jīng)曹紋濾紙過(guò)濾于 干凈的杯子中（或在3000r/min下常溫離屯、5min)，準(zhǔn)確移取5.0血上清液并加入20血純 水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾1-2次至濾液澄清，進(jìn)行免疫親和柱純化操作。
[0050] 準(zhǔn)確移取10. 0血（代表1.Og樣品）上述澄清濾液，注入玻璃注射器中，調(diào)節(jié)壓力 使溶液W1-2滴/秒的流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至有部分空氣通過(guò)柱體，WlOmL純水 淋洗柱子（重復(fù)一次），棄去全部流出液并使部分空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1. 5mL甲醇洗 脫，流速為1滴/秒，收集洗脫液于玻璃進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC-FLD檢測(cè)。
[0051] 菌株CW574對(duì)曲霉毒素的降解效率如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株CW574處理毒 素復(fù)合污染的飼料（終濃度分別為20μg/Kg)，4化對(duì)0TA降解率為48. 3 %，對(duì)AFB1降解率 為52. 1%。說(shuō)明菌株CW574對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中低濃度的黃曲霉毒素B1的降解效果較好，對(duì)髓曲 霉類毒素A的降解效果次之。
[0052] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 藤黃單胞菌（Luteimonassp.)CW574,其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015374。2. 含有權(quán)利要求1所述藤黃單胞菌CW574的菌劑。3. 由權(quán)利要求1所述藤黃單胞菌CW574或權(quán)利要求2所述菌劑制備的黃曲霉毒素B1 和赫曲霉毒素A雙功能生物降解劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物降解劑，其特征在于，其活性成分為由所述菌劑制備的 粗酶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物降解劑，其特征在于，其活性成分為菌株CW574的發(fā)酵 液、菌株CW574發(fā)酵液經(jīng)離心所得上清液或菌體裂解液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物降解劑，其特征在于，用于制備菌株CW574發(fā)酵液的培養(yǎng) 基為：胰蛋白胨 17.Og/L，大豆胨 3.Og/L，葡萄糖 2. 5g/L，NaCl5.Og/L，K2HP042. 5g/L，以水 配制；發(fā)酵條件為：30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)48h。7. 權(quán)利要求1所述藤黃單胞菌CW574、權(quán)利要求2所述菌劑、權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述 生物降解劑在黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A生物降解中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述藤黃單胞菌CW574、權(quán)利要求2所述菌劑、權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述 生物降解劑在霉變食品原料或飼料脫毒處理中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述霉變食品原料或飼料中黃曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的含量分別為20μg/kg及以下。10. 權(quán)利要求1所述藤黃單胞菌CW574或權(quán)利要求2所述菌劑在制備黃曲霉毒素B1和 赭曲霉毒素A雙功能生物降解劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供降解黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的藤黃單胞菌及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供一株雙功能高效降解菌(Luteimonas？sp.)CW574及其在降解低污染濃度黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A中的應(yīng)用。與現(xiàn)有的黃曲霉毒素降解菌相比，本發(fā)明的菌株CW574能夠在低濃度毒素污染條件下達(dá)到極佳的降解效果。在液體發(fā)酵條件下，在含有黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A終濃度20μg/L的發(fā)酵培養(yǎng)液中，48h菌株CW574對(duì)赭曲霉毒素A的降解率為90.1％；48h菌株CW574對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率為85.5％。用菌株CW574處理毒素污染的飼料(終濃度20μg/kg)，48h對(duì)OTA降解率為48.3％，AFB1降解率為52.1％。菌株CW574在食品及飼料生物脫毒應(yīng)用方面具有實(shí)質(zhì)性的應(yīng)用價(jià)值和重大意義。CCTCC NO:M 201537420150614
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01, A23L5/20, A23K10/16
【公開(kāi)號(hào)】CN105255774
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510760193
【發(fā)明人】周育, 王旭, 姜楠, 韋朝領(lǐng), 鄔艷博
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月9日