一種產(chǎn)膠原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種產(chǎn)膠原蛋白酶的班巧葡萄球菌和培養(yǎng)方法及其在富含膠原蛋白 的水產(chǎn)加工下腳料的水解應用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白是構(gòu)成動物細胞外基質(zhì)的主要成分，是整個動物世界的構(gòu)筑支架，約占 哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的1/3W上，廣泛存在于動物骨骼、軟骨、皮膚和結(jié)締組織中。膠 原蛋白具有獨特的Ξ股超螺旋結(jié)構(gòu)，3條α膚鏈W右手螺旋方式相互纏繞構(gòu)成特有的桿 狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)十分穩(wěn)定，從而導致其消化吸收困難，難W被利用。
[0003] 將膠原蛋白水解為膠原多膚，具有易吸收、抗?jié)?、抗過敏、降血壓、抗菌、抗氧化、 降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、預防骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)炎、促進角膜上皮損傷修復等多種 生理活性，使得膠原多膚成為膠原蛋白高值化利用的研究熱點。
[0004] 膠原蛋白酶是一種水解天然膠原的蛋白水解酶，能在適當?shù)囊趾蜏囟认轮磺懈?活性膠原螺旋區(qū)或明膠而不作用于其他蛋白底物的酶類。膠原蛋白酶的降解活力、穩(wěn)定性 等因素成為高效利用膠原蛋白關(guān)鍵。膠原蛋白酶按照其來源可分為植物膠原蛋白酶、動物 膠原蛋白酶和微生物膠原蛋白酶，其中細菌來源膠原蛋白酶可W分泌到細胞外，通過發(fā)酵 大量獲得，因此微生物來源的膠原蛋白酶在應用方面更加廣泛。目前研究最多的微生物膠 原蛋白酶為溶組織梭狀芽抱桿菌（C/o別'Wi?Ai別oXriic歴)，但其為病原菌，伴有毒素 產(chǎn)生，并非理想的膠原蛋白酶來源。 陽0化]水產(chǎn)品加工企業(yè)每年產(chǎn)生大量魚皮、魚鱗、魚頭、魚罐、魚尾、魚骨等下腳料，該類 物質(zhì)含有豐富的膠原蛋白，如魚皮的膠原蛋白含量最高可占其蛋白質(zhì)總量的80%W上，運 些下腳料的丟棄會造成資源浪費且污染生態(tài)環(huán)境。本發(fā)明的目的就是要解決水產(chǎn)加工下腳 料的綜合利用難題，提供一種產(chǎn)膠原蛋白酶的班巧葡萄球菌，利用產(chǎn)生的膠原蛋白酶制備 膠原蛋白多膚，使水產(chǎn)品加工的下腳料得到高附加值的利用，減少環(huán)境污染，同時也產(chǎn)生良 好的經(jīng)濟效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足，提供一種生產(chǎn)膠原蛋白酶的班巧葡萄球菌 (5'句oAjiococc化沉/cci打化)，W該菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)膠原蛋白酶， 該酶可通過高效水解膠原蛋白來生產(chǎn)膠原蛋白多膚。
[0007] 本發(fā)明的目的可W通過如下措施來達到：一種班巧葡萄球菌，其特征在于其保藏 名稱為：SM12,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2015年8月19日，保藏號為CGMCCNo. 11254， 分類命名：班巧葡萄球菌沉SjO如iococc化沉/cci打化·。
[0008] 本發(fā)明的班巧葡萄球菌（5'句oAjiococc化沉/ccin化)通過如下方法分離、篩選得 到： 1)收集豐富有機質(zhì)渺泥，梯度稀釋后涂布初篩培養(yǎng)基，28°c培養(yǎng)至長出單菌落，觀察并 挑取產(chǎn)生透明圈的菌株，接種復篩培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20~4她（28°C，180巧m)，80(K)r/min離 屯、lOmin，取上清測定酶活后確定膠原蛋白酶活力高的菌株SM12。
[0009] 2)通過明膠透明圈法篩選得到的高活力膠原酶產(chǎn)生菌株SM12在篩選培養(yǎng)基的固 體平板上呈圓形且中央凸起，白色，表面干燥，周圍粗糖，不透明也無光澤。顯微鏡觀察呈現(xiàn) 球狀但是不成鏈，革蘭氏陽性菌。生理生化測定發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)淀粉酶，分解葡萄糖產(chǎn)酸，能使明 膠液化。
[0010]W菌株SM12的總DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進行PCR擴增，檢測得到一 條1414bp的條帶，切膠測序得到的16SrDNA序列。去掉雜峰區(qū)序列后的8(K)bp，在NCBI上 同源性比較，同源性較高的為沉ajoAjiococc化沉/ccin化，同源性為99%W上。因此該菌株 SM12屬于班巧葡萄球菌（沉ajoAjiococc化沉/ccin化0。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種班巧葡萄球菌（沉化Si/cci打化) SM12發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的方法及其將膠原蛋白或明膠降解為膠原蛋白多膚的工藝，包括 如下步驟： 1)菌種活化 種子培養(yǎng)基：l〇g/L葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L明膠，5g/L化C1，0. 5g/L馬冊〇4，0. 2g/L Μ拆〇4，0.1 g/L MnSO"抑7. 5。裝液量100 mL/500 mL瓶，在37°C的200巧m恒溫搖 床中培養(yǎng)活化18~24h，即得種子液。 陽〇1引 2)發(fā)酵生產(chǎn) 采用優(yōu)化的培養(yǎng)組分和條件：15~25g/L葡萄糖，10~20g/L牛肉膏，10~25g/L化Cl，3~lOg/L明膠，pH7. 0~7. 5,裝液量為50~100血/500血瓶，按照5~7. 5% (K/V) 接種量接入活化菌種，在32~37 °C的20化pm恒溫搖床中培養(yǎng)24~4她，即為發(fā)酵粗酶液。
[0013] 3)膠原蛋白酶粉的制備 膠原蛋白酶的粗酶液經(jīng)SOOOr/min離屯、6min，收集上清液并添加硫酸錠至75%的飽和 度，在4°C下鹽析沉淀15h，然后再經(jīng)100(K)r/min冷凍離屯、（5°C)8min，收集沉淀的酶蛋白。 濃縮沉淀的酶蛋白經(jīng)透析脫鹽處理，然后將透析袋附于聚乙二醇（陽G)20000上濃縮蛋白， 濃縮的酶蛋白進行冷凍干燥，即可獲得膠原蛋白酶粉。
[0014] 4)膠原蛋白多膚的制備 稱取一定量的轄魚皮膠原蛋白粉，按照1 :15的比例加入150ml憐酸緩沖液（pH7. 4) 中，然后加入膠原蛋白酶粉(底物與酶量比為10 :1)，在37°C條件下緩慢振搖反應6~20h 后終止反應。膠原蛋白水解液經(jīng)90°C加熱滅酶lOmin，經(jīng)100(K)r/min離屯、8min去除蛋白 沉淀，在-75°C下冷凍干燥獲得膠原蛋白多膚粉。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于： 1)本發(fā)明的班巧葡萄球菌（沉<3/7如iococc化沉/cci打化)SM12為騰制食物中的常見菌， 非致病菌，對營養(yǎng)要求低，發(fā)酵條件易操作，產(chǎn)酶量高。
[0016] 2)該菌株所產(chǎn)膠原蛋白酶對膠原蛋白的水解效率高，對魚皮等大分子的膠原蛋白 具有較好的水解作用，利用該菌株進行膠原蛋白或明膠的降解并用于膠原蛋白多膚的生產(chǎn) 將具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0017] W下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細描述，運些實施例用于理解而不是限 制本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 采用的膠原蛋白酶活力測定方法：lmg的魚鱗膠原蛋白，用0. 5mL憐酸緩沖液溶解 (pH7. 4)，加入0. 1血稀釋酶液，37°C反應40min。加0. 5血Ξ氯乙酸（10%，Vk)終止反應， 再加入0. 9血乙酸緩沖液（P冊.4)和1血巧Ξ酬顯色液混勻。100°C下水浴加熱lOmin，冷 卻后用3血的60%%乙醇稀釋，在570皿下比色測定。
[0019] 所用的酶活力測定的對照組處理：為消除干擾，首先取0. 1血的稀釋酶液在100°C 下水浴煮沸l(wèi)Omin將酶進行滅活，其余步驟同酶活力測定。
[0020] 所用的酶活力計算方法：在37°C條件下W每血酶液水解膠原蛋白每min生成lug 的甘氨酸的量為一個酶活力單位（U)。 W21] 所用的相對酶活力計算方法：（對照品酶活力一樣品酶活力）/對照品酶活 為X100〇/〇。 實施例1:菌株SM12的分離篩選 采集自煙臺養(yǎng)馬島、海濱浴場、芝錄島和第一海水浴場的水±混合樣，吸取ImL入事先 滅菌的富集培養(yǎng)基，在30°C和2(K)rpm條件下培養(yǎng)30h。吸取ImL富集培養(yǎng)液經(jīng)逐級稀釋后 涂布篩選培養(yǎng)基的固體平板，在30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。分離獲得產(chǎn)生明膠降解圈的菌株 52株，對透明圈與菌落直徑比數(shù)值大的部分菌株進行膠原酶活力測定，結(jié)果見表1。由表1 可W看出，分離自養(yǎng)馬島海域的菌株SM12產(chǎn)膠原酶活力最高，為33.6抓/mL。
[0022] 表1產(chǎn)生透明水解圈的膠原蛋白酶活力
所用的富集培養(yǎng)基如下：l〇g/L明膠，Ig/L酵母粉，4g/L蛋白腺，pH7. 0。 陽02引所用的篩選培養(yǎng)基如下：20g/L明膠，3g/L酵母粉，20g/L瓊脂，5g/L化Cl，2g/L KzHPCVO. 2g/LΜ拆〇4,0.Ig/LMnSO"pH7. 0。
[0024]所用的分純培養(yǎng)基如下：lOg/L明膠，15g/L酵母粉，20g/L瓊脂，5g/L化Cl， pH7. 0〇
[0025] 實施例2:菌株SM12的菌屬鑒定 通過明膠透明圈法篩選得到的高活力膠原酶產(chǎn)生菌株SM12在篩選培養(yǎng)基的固體平板 上形態(tài)：圓形且中央凸起，白色，表面干燥，周圍粗糖，不透明也無光澤。
[00%] 顯微觀察呈現(xiàn)球狀但是不成鏈，革蘭氏陽性菌。生理生化測定發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)淀粉酶，分 解葡萄糖產(chǎn)酸，能使明膠液化。
[0027]W菌株SM12的總DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進行PCR擴增（16S-F AGAGTTTGA