TCCTGGCTCAG, 16S-RAAGGAGGTGATCCAGCCGCA)，PCR程序設(shè)定：預(yù)變性 95°C5min，循環(huán) 95°C30s，55°C30s，72°C9〇3,35個(gè)循環(huán)，延伸1〇111111。檢測(cè)得到一條14146口的 條帶，切膠測(cè)序得16SrDNA序列。去掉雜峰區(qū)序列后的800bp在NCBI上同源性比較，同源 性較高的為沉<3/7如iococc化沉/ccin化，同源性為99%W上。因此該菌株SM12屬于班巧葡 (Staphylococcussuccinus)〇 陽(yáng)02引實(shí)施例3:培養(yǎng)組分對(duì)班巧葡萄球菌SM12產(chǎn)膠原蛋白酶的影響 (1)碳源使用量的確定 所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):碳源10,牛肉膏10,明膠10,化C1 5，pH7.0。由表2可W看 出，最佳產(chǎn)膠原酶碳源為葡萄糖，其次為麥芽糖、甘油和果糖，而薦糖、淀粉和甘露醇為碳源 時(shí)膠原蛋白酶酶產(chǎn)量較低。隨著葡萄糖濃度增加，酶產(chǎn)量增加，最佳葡萄糖濃度為20g/L。
[0029] 表2碳源對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
選用葡萄糖濃度梯度為lg/L、5g/l、lOg/l、15g/l、20g/L和25g/l，確定其對(duì)膠原蛋白 酶產(chǎn)量的影響，各濃度梯度的相對(duì)酶活力分別為36. 69%、48. 52%、57. 99%、88. 75%、100%和 85. 21%，因此最佳葡萄糖使用量為20g/L。
[0030] (2)氮源使用量的確定 所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,氮源10,明膠10，化化5。由表3看出，最佳產(chǎn) 酶氮源為牛肉膏，其次為速效氮源(尿素、硫酸錠和氯化錠)。
[0031] 表3碳源對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
選用牛肉膏濃度梯度為lg/L、5g/l、10g/l、15g/L和20g/l，確定其對(duì)膠原蛋白酶產(chǎn)量 的影響，各濃度梯度的相對(duì)酶活力分別為35. 77%、71. 11%、82. 59%、100%和81. 11%，因此最 佳牛肉膏用量為15g/L。
[0032] (3)金屬鹽使用量的確定 所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,牛肉膏15,金屬鹽5,明膠10,抑7. 5。由表4可W看出，最佳產(chǎn)酶的金屬鹽為化C1。隨著化C1濃度上升，酶產(chǎn)量逐漸增加，在20g/L濃度下 獲得最大相對(duì)酶活力，且在10~30g/L的濃度區(qū)間內(nèi)酶活差異相對(duì)不顯著。
[0033] 表4金屬鹽對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
選用氯化鋼濃度依次為5旨/1、10旨/1、15旨/1、20旨/1和25旨/1，確定其對(duì)膠原蛋白酶產(chǎn)量 的影響，各濃度梯度的相對(duì)酶活力分別為41. 10%、90. 69%、95. 61%、100%、99. 50%和98. 46%， 因此最佳的氯化鋼濃度為20g/L。
[0034] 實(shí)施例4:培養(yǎng)條件對(duì)班巧葡萄球菌SM12產(chǎn)膠原蛋白酶的影響 (1) 培養(yǎng)最適抑的確定 初始抑對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表5,采用發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,牛肉膏15， 明膠10,化化20。由表5可W看出，最佳產(chǎn)酶的初始抑為7. 5,其次是抑7.0,在略偏堿性 條件下產(chǎn)酶量為宜。 陽(yáng)03引表5培養(yǎng)抑對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
(2) 最適裝液量的確定 裝液量對(duì)菌株SM12產(chǎn)膠原酶的影響見表6,最佳裝液量為lOOmL，50mL裝液量的產(chǎn)酶能 力與lOOmL裝液量時(shí)情形接近，故菌株SM12對(duì)氧有一定趨向需求。
[0036] 表6裝液量對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
(3) 接種量的確定 接種量對(duì)班巧葡萄球菌SM12產(chǎn)膠原酶的影響見表7,最佳產(chǎn)酶的接種量為7. 5%(K/V)， 接種量太低或太高均不利于膠原酶的產(chǎn)生。
[0037] 表7接種量對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
(4) 最佳培養(yǎng)溫度的確定 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表8,最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為37°C，在28~37°C區(qū)間 的產(chǎn)酶量均較高且差異不明顯，而培養(yǎng)溫度超過(guò)37°C后酶產(chǎn)量迅速降低。
[0038] 表8培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
(5) 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響 表9培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)膠原蛋白酶的影響
由表9可W看出，膠原蛋白酶在發(fā)酵24h后獲得最大酶活性。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)超 過(guò)24h時(shí)酶活呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，且在35~60h區(qū)間下降緩慢。
[0039]實(shí)施例5:班巧葡萄球菌SM12來(lái)源膠原蛋白酶的生產(chǎn) 1)種子活化 種子培養(yǎng)基：l〇g/L葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L明膠，5g/L化C1，0. 5g/L K2HPO4，0. 2g/L Μ拆〇4，0.1 g/L MnSO" pH7. 5。裝液量50血/500血瓶，在37°C的200巧m恒溫?fù)u床 中培養(yǎng)活化20h，即得種子液，菌體濃度為2X 108 C化/mL。 W40] 2)發(fā)酵生產(chǎn) 采用優(yōu)化的培養(yǎng)組分：20g/L葡萄糖，15g/L牛肉膏，20g/L化Cl，10g/L明膠，pH7. 5,裝 液量為100血/500血瓶。按照7. 5% (K/V)接種量接入活化菌種，在37°C的20化pm恒溫?fù)u 床中培養(yǎng)2地，即可發(fā)酵粗酶液，經(jīng)測(cè)定其酶活值為185. 32U/mL。
[0041] 3)膠原蛋白酶粉的制備 膠原蛋白酶的粗酶液經(jīng)SOOOr/min離屯、6min，收集上清液并添加硫酸錠至75%的飽和 度，在4°C下鹽析沉淀15h，然后再經(jīng)100(K)r/min冷凍離屯、（5°C)8min，收集沉淀的酶蛋白。
[0042] 濃縮沉淀的酶蛋白經(jīng)透析脫鹽處理，然后將透析袋附于聚乙二醇（PEG) 20000上 濃縮蛋白，濃縮的酶蛋白進(jìn)行冷凍干燥，即可獲得膠原蛋白酶粉。
[0043] 實(shí)施例6:水解膠原蛋白制備膠原蛋白多膚 1)膠原蛋白的水解試驗(yàn)（1) 稱取lOg轄魚皮膠原蛋白粉，加入150mL憐酸緩沖液（pH7. 4)中，然后加入Ig膠原蛋 白酶粉（6200U/g)，在37°C條件下緩慢振搖反應(yīng)1化后終止反應(yīng)。將蛋白水解液經(jīng)1000化/ min冷凍離屯、（5°C)8min，采用巧Ξ酬顯色法測(cè)定水解蛋白液中的-N屯含量，計(jì)算水解度后 確定膠原蛋白的水解率為57%。
[0044] 所用的水解度計(jì)算方法如下： 水解度（DH) =h/hbX100%，式中h為水解后每克膠原蛋白被裂解的膚鍵毫摩爾數(shù)，hb為 每克膠原蛋白原料的膚鍵毫摩爾數(shù)(為8. 41)。
[0045] 膠原蛋白水解液經(jīng)90°C加熱滅酶lOmin，經(jīng)100(K)r/min離屯、8min去除蛋白沉淀， 在-75°C下冷凍干燥獲得膠原蛋白多膚粉5. 2g。
[0046] 2)膠原蛋白的水解試驗(yàn)（2) 稱取lOg轄魚皮膠原蛋白粉，加入150mL憐酸緩沖液（P冊(cè).0)中，然后加入Ig膠原蛋 白酶粉（6200U/g)，在42°C條件下緩慢振搖反應(yīng)2化后終止反應(yīng)。將蛋白水解液經(jīng)1000化/min冷凍離屯、（5°C)8min，采用巧Ξ酬顯色法測(cè)定水解蛋白液中的-N屯含量，計(jì)算水解度后 確定膠原蛋白的水解率為74%。
[0047] 膠原蛋白水解液經(jīng)90°C加熱滅酶lOmin，經(jīng)100(K)r/min離屯、8min去除蛋白沉淀， 在-75°C下冷凍干燥獲得膠原蛋白多膚粉6. 9g。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)膠原蛋白酶的微生物菌株和培養(yǎng)方法，其特征在于該菌株為琥珀葡萄球菌 SM12,其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)葡萄微生物中心 的保藏號(hào)為CGMCCNo. 11254。2. 如權(quán)利要求1所述的琥珀葡萄球菌SM12的培養(yǎng)方法，包括如下培養(yǎng)組分和條件： 15 ~25g/L葡萄糖，10 ~20g/L牛肉膏，10 ~25g/LNaCl，3 ~10g/L明膠，ρΗ7· 0 ~7. 5， 裝液量為50~100mL/500mL瓶，按照5~7. 5% (κ/κ)接種量接入活化菌種，在32~37°C 的200rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24~48h。3. 如權(quán)利要求1所述的琥珀葡萄球菌SM12在富含膠原蛋白的水產(chǎn)加工下腳料的水解 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)膠原蛋白酶的新型微生物琥珀葡萄球菌（<i>Staphylococcus？succinus</i>）SM12及其發(fā)酵生產(chǎn)與應(yīng)用，該菌在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC？No.11254。本發(fā)明所提供的琥珀葡萄球菌SM12是從近海有機(jī)質(zhì)豐富的水土混合物中分離篩選得到的。該菌株能夠產(chǎn)生高活性的胞外膠原蛋白酶，對(duì)富含大分子膠原蛋白的魚皮、魚鱗等水產(chǎn)加工下腳料具有很好的降解效應(yīng)，在小分子膠原蛋白多肽的產(chǎn)品制備方面具有較好的應(yīng)用前景。CGMCC No.1125420150819
【IPC分類】C12P21/06, C12N1/20, C12N9/52, C12R1/44
【公開號(hào)】CN105255771
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510741401
【發(fā)明人】程仕偉, 韋術(shù)敏, 柳林, 孫虎山
【申請(qǐng)人】魯東大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月5日