一種非變性植物全蛋白提取液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到植物蛋白提取，屬于植物生理生化技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種非變性植 物全蛋白提取液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物生理生化的研究離不開相關(guān)酶活性的檢測，如在不同脅迫條件下所經(jīng)常關(guān)注 的S0D酶活性、GST酶活性的變化等。由于不同酶活性的專一性，使用全蛋白提取物進(jìn)行檢 測不需要對目的蛋白進(jìn)行純化，具有省時省力、結(jié)果可靠的特點(diǎn)。目前市場上的植物蛋白提 取液非常多，一般都是應(yīng)用于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的，其特點(diǎn)在于加入尿素、DTT等。尿素 使蛋白變性，無法進(jìn)行酶活性分析；而DTT等還原劑對BCA、Bradford等測定蛋白濃度方法 的干擾嚴(yán)重，無法對酶活性進(jìn)行準(zhǔn)確定量比較。很多實(shí)驗(yàn)室在提取植物全蛋白進(jìn)行生理生 化分析時，為了避免蛋白變性降解等，需要在提取后馬上進(jìn)行分析，對于大批量樣本來講顯 然是不現(xiàn)實(shí)的。因此本發(fā)明公開的植物全蛋白提取液擯棄了尿素、DTT等，添加了可以保護(hù) 并延緩蛋白降解的甘油，提取后的樣品可以馬上檢測也可以冷凍保存數(shù)月（超低溫保存可 以更久）后再進(jìn)行檢測，既可以進(jìn)行酶活分析也可以進(jìn)行蛋白定量，極大的方便了植物生理 生化相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供一種非變性植物全蛋白提取液 的配方及其制備方法，供植物生理生化研究人員使用和借鑒。
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種非變性植物全蛋白提取液，是包含有以下成分的水溶液： 1) 50-200mM磷酸緩沖液 2) O-lOmMEDTA 3) 5%_10% (w/v，單位g/ml)甘油 4) 0. 2%-0. 5% (w/v，單位g/ml)聚乙烯吡咯烷酮PVP 5) 蛋白酶抑制劑，添加量按照提取液體積的1/100-1/200加入。
[0005] 所述磷酸緩沖液的pH值在7. 0-8. 0之間，由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制而成。
[0006] 所述EDTA為事先配好的pH為L0-8. 0的200mMEDTA-Na母液或者是200mMEDTA 母液。
[0007] 所述提取液使用前需要預(yù)冷至0-4°C。
[0008] 本發(fā)明的提取液特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)： 1、不限制NaCl等鹽的加入。
[0009] 2、使用了甘油作為蛋白保護(hù)劑，且甘油濃度在5%-10%之間。
[0010] 3、不使用巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑。
[0011] 4、不使用尿素等蛋白變性試劑。
[0012] 5、使用前需要預(yù)冷。
[0013] 6、加入PVP和蛋白酶抑制劑前可以長期存放。
[0014] 7、加入蛋白酶抑制劑后最好于當(dāng)天使用。
[0015] 制備本發(fā)明非變性植物全蛋白提取液的方法，分以下三個步驟制備： 第一步：先將磷酸緩沖液、EDTA、甘油按照所需濃度混勻，定容至所需容量； 第二步：將所配溶液高壓滅菌； 第三步：使用前加入PVP和蛋白酶抑制劑。
[0016] 其具體步驟如下： 1. 按照不同pH值磷酸緩沖液的配比表，分別稱取所需的NaH2POJPNa2ΗΡ04; 2. 按照質(zhì)量體積百分比稱取甘油； 3. 根據(jù)最終濃度要求加入200mM的EDTA-Na母液（pH7. 0-8. 0); 4. 將前面3步的試劑放在一個燒杯中，加入去離子水至所需刻度之下，放入磁力攪拌 子，攪拌混勻； 5. 將燒杯內(nèi)的溶液用容量瓶或量筒定容至所需體積； 6. 轉(zhuǎn)移至試劑瓶，試劑瓶蓋不擰緊，121°C高壓滅菌15分鐘； 7. 待溫度冷卻至室溫后，擰緊試劑瓶蓋，常溫或4°C冷藏保存； 8. 使用前，取出適量體積，按照質(zhì)量百分比加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，振蕩混勻； 9. 加入適量蛋白酶抑制劑，混勻后冰浴放置待用，如果加PVP前的溶液是常溫存放需 要在加蛋白酶抑制劑前冰浴30分鐘。
[0017] 使用上述提取液提取植物總蛋白，從A280nm的光吸收和GST蛋白酶活性來看，其 提取量與市售的一些提取液的提取能力相當(dāng)（見表1和表2);本發(fā)明所提供的蛋白提取液 配置簡單，所需試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，價格便宜；而試劑配好后方便長期存放易于運(yùn) 輸，具有一定的市場價值，因此有必要通過專利加以保護(hù)。
[0018] 本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于：使用該蛋白提取液提取的植物全蛋白適用于蛋白酶活性 的分析及BCA等方法對蛋白濃度的測定。其特點(diǎn)在于不對蛋白進(jìn)行變性，不添加影響B(tài)CA 等測定的還原劑，提取后的蛋白可冷凍保存數(shù)月，復(fù)融后基本無沉淀，且保存前后蛋白活性 基本不受影響，提取的蛋白量較高，還可直接用于進(jìn)一步分離純化，因此該提取液在植物生 理生化研究方面具有重要的應(yīng)用價值。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明以下通過一個具體實(shí)施例做進(jìn)一步詳細(xì)說明： 1.配置提取液 配置1L提取液：含有100mM磷酸緩沖液、5mMEDTA、5%甘油、2. 5%PVP和蛋白酶抑制劑： 稱取29. 367克Na2HP04· 12H20和2. 808克NaH2P04· 2H20加入1L燒杯內(nèi)，溶解后作為 pH7. 5、lOOmM的磷酸緩沖液； 加入配置好的PH7. 5的200mM的EDTA-Na母液25ml; 將燒杯直接放在百分之一天平上，稱取50克甘油； 加入攪拌子，用磁力攪拌器攪拌均勻； 用量筒加入去離子水定容至1L; 倒入1L試劑瓶中，將瓶蓋松松的擰上，用滅菌指示條將瓶蓋與瓶身固定，高溫滅菌； 冷卻至室溫后，擰緊瓶蓋，4°C保存?zhèn)溆茫?使用前，取出50ml，加入1. 25克PVP粉末，漩渦震蕩溶解； 加入蛋白酶抑制劑(上海生工，BS380) 250μ1，上下顛倒混勻，放于冰上待用。
[0020] 2.提取全蛋白 以煙草為例，分別稱取新鮮煙草葉和根各1克放入兩個5ml離心管中，按照1:3 (W/V) 的比例分別加入提取液3ml; 用手持式勻漿機(jī)在冰浴下勻漿30s; 14000Xg，4°C，離心 20min; 用槍頭將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，葉片的提取液標(biāo)記為L，根的提取液標(biāo)記為R。
[0021] 同時用一商品化的植物蛋白提取液(不含尿素，含有DTT)進(jìn)行同樣的提取操作，但 只提取煙草葉片的總蛋白，所提取蛋白標(biāo)記為S。
[0022] 3.活性測定 將提取到的煙草全蛋白取出一部分進(jìn)行活性測定；其余分成兩份，一份用液氮快速 冷凍后放于超低溫冰箱中，一份凍存于-20°C，于2個月后全部取出復(fù)融；樣品復(fù)融后， 14000Xg，4°C，離心10分鐘后再進(jìn)行活性測定； 測定全蛋白提取液的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，使用的底物是GSH和CDNB; 活性測定結(jié)果如表1所示。
[0023] 4.提取的總蛋白的蛋白含量測定 使用BCA的方法及A280的光吸收值確定總蛋白含量，商品化的提取液中由于含有DTT， 對BCA測定結(jié)果干擾很大，無法得出提取蛋白的濃度。
[0024] 本發(fā)明所公開的提取液所提取的蛋白濃度及全部樣品的A280值見表2。
[0025] 從表1和表2可以看出與市售的提取液相比，本發(fā)明所公開的提取液的提取效率 及提取蛋白的活性與其相當(dāng)；隨著冷凍保存，本發(fā)明提取液的蛋白活性變化不大，而用市售 提取液所提取蛋白的活性則明顯降低。
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種非變性植物全蛋白提取液，其特征在于：該提取液是包含有以下成分的水溶 液： 1) 50-200mM磷酸緩沖液， 2. I-IOmM EDTA, 3) 5%-10% 甘油， 4) 0. 2%-0. 5%聚乙烯吡咯烷酮PVP， 5) 蛋白酶抑制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的非變性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述磷酸緩沖液的 pH值在7. 0-8. 0之間，由磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制而成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的非變性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述EDTA為事先配 好的 pH 為 7. 0-8. 0 的 200mM EDTA 母液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的非變性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述提取液使用前 需要預(yù)冷至0-4°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的非變性植物全蛋白提取液，其特征在于：蛋白酶抑制劑的添 加量按照提取液體積的1/100-1/200加入。6. -種如權(quán)利要求1所述的非變性植物全蛋白提取液的制備方法，其特征在于：分三 步制備： 1) 先將磷酸緩沖液、EDTA、甘油按照所需濃度混勻，定容至所需容量； 2) 將所配溶液高壓滅菌； 3) 使用前加入PVP和蛋白酶抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物蛋白提取，具體是一種非變性植物全蛋白提取液及其制備方法，其特征在于：該提取液是包含有以下成分的水溶液：磷酸緩沖液、EDTA、甘油、聚乙烯吡咯烷酮PVP及蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的特點(diǎn)在于使用該蛋白提取液提取的植物全蛋白適用于蛋白酶活性的分析及BCA等方法對蛋白濃度的測定。該提取液的特點(diǎn)在于不對蛋白進(jìn)行變性，不添加影響B(tài)CA等測定的還原劑，提取后的蛋白可冷凍保存數(shù)月，復(fù)融后基本無沉淀，且保存前后蛋白活性基本不受影響，提取的蛋白量較高，還可直接用于進(jìn)一步分離純化，因此該提取液在植物生理生化研究方面具有重要的應(yīng)用價值。
【IPC分類】C07K1/14
【公開號】CN105237613
【申請?zhí)枴緾N201510773280
【發(fā)明人】周會娜, 劉萍萍, 翟妞, 陳霞, 陳千思, 毛李鴻, 鄭慶霞, 徐國云, 張慧, 林福呈
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月13日