專利名稱：無(wú)細(xì)胞蛋白合成所用的昆蟲細(xì)胞提取液,其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成(cell-free protein synthesis)的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法、昆蟲細(xì)胞提取液和利用所述的昆蟲細(xì)胞提取液在非細(xì)胞體系中合成蛋白質(zhì)的方法，以及含有所述的昆蟲細(xì)胞提取液的試劑盒，該試劑盒可以用于非細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，大量生物的遺傳信息(如人類基因組)已經(jīng)披露。在這樣的情況下，基于這些遺傳信息的蛋白質(zhì)功能分析和基因藥物正向著后基因組研究的方向發(fā)展。與這些遺傳信息相關(guān)的蛋白質(zhì)在用于制備藥物等產(chǎn)品的應(yīng)用中時(shí)，需要在短時(shí)間內(nèi)且能夠簡(jiǎn)便易行的大量合成蛋白質(zhì)。
現(xiàn)在，通過(guò)基因重組技術(shù)生成的能夠自行生長(zhǎng)發(fā)育的酵母細(xì)胞(下文中稱為“細(xì)胞體系”)、昆蟲細(xì)胞等表達(dá)體系，已被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的合成中。但是，能自行生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞因?yàn)樾枰３制涔δ芏憩F(xiàn)出清除外源蛋白的傾向，由于在能自行生長(zhǎng)發(fā)育細(xì)胞中毒性蛋白的表達(dá)而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，使得許多蛋白質(zhì)不能輕易的表達(dá)出來(lái)。
另一方面，作為脫離細(xì)胞體系的蛋白生產(chǎn)方法，無(wú)細(xì)胞蛋白合成的方法是已知的，它包含在試管中加入基質(zhì)、酶等細(xì)胞破碎物、以及能夠提供在較寬范圍內(nèi)選擇生物遺傳信息翻譯體系的提取液等物質(zhì)，這樣就重新構(gòu)建了一個(gè)合成體系，該體系能夠?qū)被釟埢凑沼蒻RNA編碼的目的蛋白質(zhì)的特定順序連接起來(lái)。這樣的無(wú)細(xì)胞蛋白合成相對(duì)于上面提到的細(xì)胞體系不受任何限制，并且它能夠在不損傷生物體的情況下合成蛋白質(zhì)。另外，由于這樣的蛋白質(zhì)合成與生物體的生長(zhǎng)過(guò)程等沒(méi)有關(guān)系，因此相對(duì)與細(xì)胞體系而言能夠在短時(shí)間內(nèi)合成大量的蛋白質(zhì)。而且由于無(wú)細(xì)胞蛋白合成方法能夠大量的合成蛋白質(zhì)，合成的蛋白質(zhì)中還包含不能被生物體利用的氨基酸序列，所以它是很有前景的蛋白質(zhì)表達(dá)體系。除了細(xì)胞破碎物或提取液應(yīng)用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成中外，還應(yīng)該考慮使用由生物衍生而來(lái)的各種基質(zhì)。昆蟲細(xì)胞并不需要這樣的基質(zhì)，而不象許多哺乳動(dòng)物那樣，而它能在二氧化碳?xì)怏w中生長(zhǎng)，也能在沒(méi)有血清的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并且夠能大量表達(dá)出在細(xì)胞體系中經(jīng)過(guò)翻譯后修飾的具有特異生物活性的蛋白質(zhì)，因此能夠利用它們來(lái)表達(dá)各種各樣的蛋白質(zhì)。如果昆蟲細(xì)胞能夠用于非細(xì)胞體系、翻譯后修飾(如糖基化)等中，這將是一個(gè)充滿前景的應(yīng)用。因此，昆蟲細(xì)胞的應(yīng)用發(fā)展受到越來(lái)越多的關(guān)注。
通常，為了從昆蟲細(xì)胞中獲得用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的提取液，使用如下已知的方法(參見(jiàn)JP-A-2000-325076)，將昆蟲細(xì)胞用惰性氣體密封，然后降低壓力，從而將昆蟲細(xì)胞破碎獲得提取液。然而，這種從昆蟲細(xì)胞獲得提取液的方法，需要特殊的裝置和工具，還有復(fù)雜的操作過(guò)程。而且，復(fù)雜的操作是必要的，因?yàn)榉羌?xì)胞體系合成蛋白的能力很大程度上依賴于細(xì)胞的數(shù)量、氮?dú)鈮毫驮谥苽涮崽崛∫哼^(guò)程中密封的時(shí)間。另外，通過(guò)上述方法利用所述的提取液合成的蛋白質(zhì)的數(shù)量是很少的，其可以檢測(cè)到的水平是經(jīng)過(guò)放射性標(biāo)記的氨基酸。
因此，對(duì)昆蟲細(xì)胞提取液制備方法的做了進(jìn)一步研究，使得制備方法更加簡(jiǎn)單，以便滿足大量合成蛋白質(zhì)的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明解決了上述提到的問(wèn)題，并且提供了一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，所述的提取液容易制備且比一般的提取液具有更高的蛋白質(zhì)合成能力，還提供了所述的昆蟲細(xì)胞提取液和利用所述的昆蟲細(xì)胞提取液在非細(xì)胞體系中合成蛋白質(zhì)的方法，以及含有所述的昆蟲細(xì)胞提取液的試劑盒，該試劑盒可以用于非細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)的合成。
本發(fā)明的發(fā)明者為了解決上面提到的問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，進(jìn)而完成了本發(fā)明，提供了如下的

發(fā)明內(nèi)容
(1)一種用于非細(xì)胞體系蛋白合成中的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，該方法包括至少一步快速冷凍懸浮在溶液中的昆蟲細(xì)胞，為了從昆蟲細(xì)胞中獲得提取液。
(2)根據(jù)(1)所述的方法，所述的提取液來(lái)自于昆蟲細(xì)胞，該昆蟲細(xì)胞包含經(jīng)過(guò)融化的快速冷凍過(guò)的昆蟲細(xì)胞和經(jīng)過(guò)離心的昆蟲細(xì)胞。
(3)根據(jù)(1)或(2)所述的方法，所述的昆蟲細(xì)胞在液氮中冷凍。
(4)根據(jù)(2)或(3)所述的方法，所述的昆蟲細(xì)胞在-10℃至20℃的水浴或冰浴中融化。
(5)根據(jù)(1)至(4)所述的任一方法，所述的用于提取的溶液包含蛋白酶抑制劑。
(6)根據(jù)(1)至(5)所述的任一方法，進(jìn)一步包括核酸酶的處理。
(7)根據(jù)(1)至(6)所述的任一方法，所述的昆蟲細(xì)胞是一種來(lái)源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)卵子細(xì)胞(ovum)或草地夜蛾(Spodoptera fruglperda)卵巢細(xì)胞(ovary cell)或由粉紋夜蛾卵子細(xì)胞和草地夜蛾卵巢細(xì)胞形成的細(xì)胞組合物。
(8)一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液，所述的提取液根據(jù)(1)至(7)所述的任一方法制備得到。
(9)一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的方法，該方法包括使用(1)至(8)任一所述的昆蟲細(xì)胞提取液。
(10)根據(jù)(9)所述的方法，還包括使用具有帽子結(jié)構(gòu)的外源mRNA。
(11)一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的試劑盒，該試劑盒含有(8)中所述的昆蟲細(xì)胞提取液。


圖1是本發(fā)明優(yōu)選的制備方法1-3的簡(jiǎn)明流程圖。
圖2是利用實(shí)施例1的昆蟲細(xì)胞提取液進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)間與合成的螢光素酶含量的關(guān)系圖，縱坐標(biāo)表示合成的螢光素酶含量(μg/ml)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)的時(shí)間(h)。
圖3是分別使用實(shí)施例1和2的昆蟲細(xì)胞提取液反應(yīng)5h內(nèi)合成的螢光素酶含量的變化關(guān)系圖，縱坐標(biāo)表示螢光素酶的相對(duì)含量(％)，以沒(méi)有用核酸酶處理過(guò)的提取液作為反應(yīng)溶液在5h內(nèi)合成的螢光素酶的含量作為100％，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。
圖4是分別使用實(shí)施例1的昆蟲細(xì)胞提取液和含有參考例3提到的mRNA的昆蟲細(xì)胞提取液在10h內(nèi)合成的螢光素酶相對(duì)含量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖。
圖5是使用實(shí)施例3的昆蟲細(xì)胞提取液合成的螢光素酶的含量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖，縱坐標(biāo)表示合成的螢光素酶的含量(μg/ml)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)的時(shí)間(h)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的說(shuō)明書中所述的“無(wú)細(xì)胞蛋白合成”是指利用非細(xì)胞翻譯體系來(lái)合成由外源mRNA編碼的蛋白質(zhì)。這里所述的“蛋白質(zhì)”是根據(jù)本發(fā)明所述的合成方法在非細(xì)胞體系中合成的，它包含有多種氨基酸殘基組成的任意分子量的分子，例如從小分子量到發(fā)分子量的多肽。本發(fā)明所述的“蛋白質(zhì)”還包括經(jīng)過(guò)糖基化的糖蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
下文將具體的描述本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明提供了一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，其特征在于至少含有一步快速冷凍懸浮在用于提取的溶液中的昆蟲細(xì)胞的步驟，為的是從昆蟲細(xì)胞中得到提取液。為了獲得上述的昆蟲細(xì)胞提取液，將細(xì)胞在相對(duì)于上述通常的方法(詳見(jiàn)JP-A-2000-325076)較溫和的條件下破碎細(xì)胞，這樣就可以在不損傷細(xì)胞的情況下把用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的基本成分提取出來(lái)，比用通常方法得到的提取液具有更高的在非細(xì)胞體系中合成蛋白質(zhì)的能力。依據(jù)本發(fā)明所述的方法，此外，可以用加入核糖核酸酶及其類似物等手段阻止污染，基質(zhì)的結(jié)合同時(shí)也阻止了翻譯的進(jìn)行，應(yīng)當(dāng)在細(xì)胞破碎時(shí)考慮使用降解劑及其類似物，以避免上述基質(zhì)結(jié)合的發(fā)生。
本發(fā)明所述的制備方法需要快速冷凍懸浮在用于提取的溶液中的昆蟲細(xì)胞。在本發(fā)明所述的制備方法中，“快速冷凍”是指在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍處理時(shí)冷凍的時(shí)間不超過(guò)10秒鐘，最好不超過(guò)2秒鐘。在本發(fā)明中如果昆蟲細(xì)胞沒(méi)有被快速的冷凍，那么用于蛋白質(zhì)合成的基本成分就會(huì)失去活性，并且前述的本發(fā)明的效果就不能實(shí)現(xiàn)。
正如上面提到的那樣，快速冷凍昆蟲細(xì)胞的溫度一般不高于-80℃，最好不高于-150℃。這是因?yàn)榧?xì)胞快速冷凍的溫度高于-80℃時(shí)，合成蛋白質(zhì)的基本成分就會(huì)失去活性，那么合成蛋白質(zhì)的能力就會(huì)下降。
上面提到的快速冷凍昆蟲細(xì)胞的方法是可以實(shí)現(xiàn)的，例如使用液體氮?dú)?、液體氦氣等惰性氣體。最好使用液體氮?dú)?，因?yàn)檩^容易得到而且也比較經(jīng)濟(jì)。
根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法，至少含有一步用于快速冷凍懸浮于提取用的溶液中的昆蟲細(xì)胞，該步驟中含有昆蟲細(xì)胞提取液，而其它的步驟沒(méi)有特別的限制。例如，通常從大腸桿菌、小麥病菌提取用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的提取液的方法也可以用于昆蟲細(xì)胞的破碎和提取，這樣的方法還包括在研缽中搗碎細(xì)胞、使用杜恩斯勻漿機(jī)和使用玻璃珠等方法。由于昆蟲細(xì)胞相對(duì)于大腸桿菌、小麥病菌等在用于制備無(wú)細(xì)胞蛋白合成的提取液時(shí)較容易破碎，并且可以得到具有高蛋白質(zhì)合成能力的提取液，這是因?yàn)樵诩?xì)胞破碎的過(guò)程中進(jìn)行了冷凍和融化，從而將用于蛋白質(zhì)合成的基本成分的活性保留了下來(lái)，因此特別優(yōu)選的使用經(jīng)過(guò)快速冷凍、融化和離心過(guò)的上述的昆蟲細(xì)胞。
當(dāng)上述經(jīng)過(guò)快速冷凍的昆蟲細(xì)胞需要融化和離心時(shí)，所述細(xì)胞可以在-10℃至20℃的水浴或冰浴、放置在室溫(25℃)中等條件下進(jìn)行融化。為了防止合成蛋白質(zhì)的基本成分的失活，當(dāng)然也是為了防止蛋白質(zhì)合成能力的降低，所述細(xì)胞最好在0℃至20℃的水浴或冰浴中融化(更優(yōu)選于4℃至10℃中)。融化后的細(xì)胞在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域通常的條件下(10,000×g-50,000×g，0℃-10℃，10分鐘-60分鐘)進(jìn)行離心。離心后的上清液含有所需的昆蟲細(xì)胞提取液。
用于本發(fā)明的昆蟲細(xì)胞的種類不受任何特別的限制，例如，所述的細(xì)胞優(yōu)選于來(lái)源于鱗翅目昆蟲、直翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、膜翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲、脈翅目昆蟲、半翅目昆蟲等的細(xì)胞，而其它許多生物細(xì)胞系已經(jīng)被確定了。此外，用于本發(fā)明的昆蟲細(xì)胞可以是來(lái)自于任何組織的細(xì)胞，例如，血細(xì)胞、性腺衍生來(lái)的細(xì)胞、脂肪體衍生來(lái)的細(xì)胞、胚胎衍生來(lái)的細(xì)胞、孵化幼蟲衍生來(lái)的細(xì)胞等，而沒(méi)有任何特別的限制。當(dāng)然，優(yōu)先使用由性腺衍生來(lái)的細(xì)胞，因?yàn)樗哂休^高的蛋白質(zhì)合成能力。特別的，使用來(lái)源于粉紋夜蛾卵子的High Five細(xì)胞(由Invitrogen生產(chǎn))或來(lái)源于草地夜蛾卵巢的Sf21細(xì)胞(由Invitrogen生產(chǎn))作為優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)胞體系中具有高的蛋白質(zhì)合成能力而且還可以在沒(méi)有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
在本發(fā)明中，所述的昆蟲細(xì)胞并不局限于單一物種的同一組織中，還可以是來(lái)源于同一昆蟲種類的不同組織，或者是不同昆蟲種類的不同組織。
本發(fā)明所述的制備方法中，用于提取的溶液沒(méi)有特別的限制，但最好是含有一種蛋白酶抑制劑。當(dāng)用于提取的溶液中含有蛋白酶抑制劑時(shí)，昆蟲細(xì)胞提取液中的蛋白酶活性就會(huì)被抑制，從而防止了在所述提取液中不必要的活性蛋白質(zhì)的降解，這樣來(lái)源于昆蟲細(xì)胞的提取液就具有了更高效的蛋白質(zhì)合成能力。
上述的蛋白酶抑制劑沒(méi)有特別的限制，只要它具有抑制蛋白酶的作用，例如，苯甲醇磺基的氟化物(下文中被稱為“PMSF”)、抑酶肽、苯丁抑制素、亮抑酶肽、抑胃酶肽A、E-64(L-反式-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酸(4-胍基)丁烷)、乙二胺四乙酸、膦酰二肽等都可以使用。由于昆蟲細(xì)胞提取液中含有絲氨酸蛋白酶，所以優(yōu)先使用上面提到的PMSF，因?yàn)樗芴禺愋缘囊种平z氨酸蛋白酶的活性。不僅可以使用單一蛋白酶抑制劑，而且還可以使用多種蛋白酶抑制劑的混合物(蛋白酶抑制劑的雞尾酒)。
用于提取的溶液中蛋白酶抑制劑的含量沒(méi)有任何特殊的限制，但較好在1μM-50mM，最好在0.01mM-5mM的范圍內(nèi)，此時(shí)蛋白酶的活性被較好的抑制住，因?yàn)榈鞍酌傅姆纸鈱?duì)于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的反應(yīng)來(lái)說(shuō)是必要的。這是因?yàn)榈鞍酌敢种苿┑暮康暮康陀?μM時(shí)，蛋白酶的活性不能被完全的抑制，當(dāng)含量高于50mM時(shí)，合成蛋白質(zhì)的反應(yīng)可能會(huì)被抑制。
本發(fā)明中所述的用于提取的溶液，除了含有上面提到的蛋白酶抑制劑外，最好至少還含有鉀鹽、鎂鹽、二硫代蘇糖醇和緩沖劑只要不抑制本發(fā)明所述的反應(yīng)，上面提到的鉀鹽沒(méi)有任何特別的限制，可以用它的一般的形式，例如醋酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫鉀、硫酸鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀磷酸鉀等形式，可以參考給出的醋酸鉀。鉀鹽是所述的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的輔助因子。
用于提取的溶液中的鉀鹽含量沒(méi)有任何特別的限制，但從穩(wěn)定性方面考慮，鉀鹽的含量較好在10mM-500mM，最好在50mM-300mM的范圍內(nèi)，在這中情況下使用單價(jià)的鉀鹽，如醋酸鉀等。當(dāng)鉀鹽的含量低于10mM或高于500mM時(shí)，用于蛋白質(zhì)合成的基本成分可能會(huì)不穩(wěn)定。
只要不抑制本發(fā)明所述的反應(yīng)，上面提到的鎂鹽沒(méi)有任何特別的限制，可以用它的一般的形式，例如醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂、檸檬酸鎂、磷酸氫鎂、碘化鎂、乳酸鎂、草酸鎂等，可以參考給出的醋酸鎂。鎂鹽也是所述的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的輔助因子。
用于提取的溶液中的鎂鹽含量沒(méi)有任何特別的限制，但從穩(wěn)定性方面考慮，鉀鹽的含量較好在0.1mM-10mM，最好在0.5mM-5mM的范圍內(nèi)，在這中情況下使用二價(jià)的鉀鹽，如醋酸鎂等。當(dāng)鎂鹽的含量低于0.1mM或高于10mM時(shí)，用于蛋白質(zhì)合成的基本成分可能會(huì)不穩(wěn)定。
上面提到的二硫代蘇糖醇(下文中被稱為“DTT”)是作為抗氧化劑被加入的，它在提取液中的含量較好在0.1mM-10mM，最好在0.5mM-5mM的范圍內(nèi)。當(dāng)DTT的含量低于0.1mM或高于10mM時(shí)，用于蛋白質(zhì)合成的所述基本成分可能會(huì)不穩(wěn)定。
上面提到的緩沖劑使得提取液具有一定的緩沖容量，該緩沖劑可以防止由提取液pH急劇變化而引起的提取液變性，例如在提取液中加入酸性或堿性物質(zhì)時(shí)。這樣的緩沖劑沒(méi)有任何特別的限制，例如可以是HEPES-KOH、Tris-HCL、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
所述的緩沖劑能夠?qū)⑻崛∫旱膒H值維持在4-10的范圍內(nèi)，最好是pH6.5-8.5的范圍內(nèi)。當(dāng)所述提取液的pH值低于4或高于10時(shí)，用于本發(fā)明所述反應(yīng)的基本成分就會(huì)失活，從這方面考慮，特別優(yōu)選使用HEPES-KOH(pH6.5-8.5)的緩沖體系。
所述提取液中緩沖劑的含量沒(méi)有任何特殊的限制，在優(yōu)選的5mM-200mM，更優(yōu)選的10mM-100mM范圍內(nèi)時(shí)具有更好的緩沖容量。當(dāng)緩沖劑的含量低于5mM時(shí)，由于酸性或堿性物質(zhì)的加入會(huì)使pH值會(huì)急劇的改變，當(dāng)緩沖劑的含量高于200mM時(shí)，由于鹽濃度太高而使得用于蛋白質(zhì)合成的基本成分變得不穩(wěn)定。
此外，如果在上面提到的用于提取的溶液中加入氯化鈣和甘油，那么就進(jìn)一步提高了昆蟲細(xì)胞提取液的蛋白質(zhì)合成能力。
在這種情況下，氯化鈣的含量沒(méi)有特別的限制。為了更有效的發(fā)揮上面提到的提取液的蛋白質(zhì)合成能力，氯化鈣的含量范圍優(yōu)選于0.1mM-10mM，更優(yōu)選于0.5mM-5mM。此外，甘油的含量也沒(méi)有特別的限制，為了更有效的發(fā)揮上面提到的提取液的蛋白質(zhì)合成能力，甘油的添加比例優(yōu)選于5(v/v)％-80(v/v)％，更優(yōu)選于10(v/v)％-50(v/v)％。
在制備本發(fā)明所述的昆蟲細(xì)胞提取液時(shí)，為了得到用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液，而進(jìn)行的細(xì)胞破碎，但破碎之后的其它步驟沒(méi)有特別的限制。圖1是本發(fā)明優(yōu)選的制備方法1-3的簡(jiǎn)明流程圖。在圖1中制備方法1-3中每一個(gè)制備方法都含有前述的快速冷凍、融化和離心用于破碎細(xì)胞的方法。
如圖1所示，用本發(fā)明所述的制備方法破碎細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)上述的離心步驟后得到的上清液(上清液1A)，也可以作為提取液，或者進(jìn)一步將上清夜1A離心(10,000×g-100,000℃×g，0℃-10℃，10分鐘-120分鐘)后得到的上清液(上清液1B)，也可以作為提取液(上清液1)(下文中稱為制備方法1)。而且，上述的上清液1(上清液1A和1B)經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾后得到的組分(具有高吸光度的組分)，在280nm處有不低于10的吸光度，該組分也可以作為提取液(下文中被稱為制備方法2)。下面將具體的描述制備方法2的操作步驟。
首先，將懸浮液1A或1B進(jìn)行凝膠過(guò)濾。為了進(jìn)行凝膠過(guò)濾，優(yōu)先使用脫鹽柱(由Amersham Biosciences公司生產(chǎn))，根據(jù)通常的方法，用上面提到的用于凝膠過(guò)濾的緩沖液來(lái)平衡柱子、上樣和洗脫。通常所知的含有適當(dāng)組分的緩沖液可以作為凝膠過(guò)濾的緩沖液，而沒(méi)有任何特別的限制。例如，用于凝膠過(guò)濾的緩沖液，含有10mM-100mM的HEOES-KOH(pH6.5-8.5)、50mM-300mM的醋酸鉀、0.5mM-5mM醋酸鎂、0.5mM-5mM的DTT和0.01mM-5mM的PMSF。凝膠過(guò)濾后的濾液通常被分成0.1-1mL的組分，優(yōu)選于每組分是0.4-0.6mL，這樣就可以有效的得到具有高蛋白質(zhì)合成能力的組分。
其次，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾后且在280nm處的吸光度不低于30的組分被過(guò)濾分離出來(lái)，通過(guò)Ultrospec 3300 pro(由Amersham Biosciences公司生產(chǎn))檢測(cè)，該組分可以作為提取液。
利用上述制備方法2得到的具有高吸光度的組分，還可以再進(jìn)一步的離心而得到的上清液(上清液2)也可以作為提取液(下文中被稱為制備方法3)。經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾之后的離心條件優(yōu)選于30,000×g-100,000×g、0℃-10℃、10分鐘-60分鐘，為的是除去抑制翻譯進(jìn)行的不溶性組分。
使用本發(fā)明所述制備方法的細(xì)胞，最好在所述的快速冷凍前預(yù)先進(jìn)行清洗，清洗液最好是使用含有與上述的用于昆蟲細(xì)胞提取的溶液相同的組合物的溶液，除了該溶液不含有蛋白酶抑制劑和甘油，這樣用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基將不再進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。清洗還包括使用用于清洗昆蟲細(xì)胞的清洗液，在離心的條件下清洗細(xì)胞(如7,000×g，4℃下10分鐘)。為完全去除培養(yǎng)基，用于清洗的清洗液含量?jī)?yōu)選于5mL-100mL，更優(yōu)選于10mL-50mL每1g(凈重)的昆蟲細(xì)胞。清洗的次數(shù)優(yōu)選于1-5次，更優(yōu)選于2-4次。
另外，雖然本發(fā)明所述的制備方法中昆蟲細(xì)胞的含量沒(méi)有特別的限制，但優(yōu)選于在每1mL的提取液中含有0.1g-5g的昆蟲細(xì)胞，更優(yōu)選于0.5g-2g，這樣可以較好的保持提取液的效率。
根據(jù)本發(fā)明所述方法制備得到的昆蟲細(xì)胞提取液，來(lái)自于昆蟲細(xì)胞提取液中的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選于1mg/mL-200mg/mL范圍內(nèi)，更優(yōu)選于10mg/mL-100mg/mL。當(dāng)提取液中的蛋白質(zhì)濃度低于1mg/mL時(shí)，完成本發(fā)明所需的基本成分的濃度就會(huì)降低，影響了合成反應(yīng)的充分進(jìn)行。當(dāng)提取液中的蛋白質(zhì)濃度高于200mg/mL時(shí)，使得提取液本身具有了很高的粘度，操作也將變得困難起來(lái)。
從昆蟲細(xì)胞得到的提取液的含量是由上述蛋白質(zhì)的濃度決定的。例如，可以用BCA蛋白質(zhì)分析儀(由PIERCE公司生產(chǎn))檢測(cè)上述蛋白質(zhì)的濃度。特別的，將1mL的樣品加入到2mL的反應(yīng)試劑中，在37℃中反應(yīng)30分鐘，用分光光度計(jì)(由Amersham Biosciences公司生產(chǎn)的Ultrospec 3300 pro)在562nm處測(cè)量吸光度。作為對(duì)照，通常用牛血清白蛋白(BSA)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣測(cè)量的方法就完備了。
上述的提取液不論其是否含有來(lái)源于昆蟲細(xì)胞的的提取液，它還由提取液中核糖體RNA的堿基序列來(lái)決定。
本發(fā)明所述的提取液最好含有來(lái)源于昆蟲細(xì)胞的提取液，所述的昆蟲細(xì)胞提取液的蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL-100mg/mL，同時(shí)還含有50mM-300mM的醋酸鉀、0.5mM-5mM的醋酸鎂、0.5mM-5mM的DTT、0.01mM-5mM的PMSF和10mM-100mM的HEPES-KOH(pH6.5-8.5)。
本發(fā)明所述的昆蟲細(xì)胞提取液最好在無(wú)細(xì)胞蛋白合成之前用核酸酶處理。經(jīng)過(guò)核酸酶處理過(guò)的昆蟲細(xì)胞提取液用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成時(shí)，比未經(jīng)過(guò)核酸酶處理的昆蟲細(xì)胞提取液能夠合成更多的目的蛋白質(zhì)。這是因?yàn)橄率龅睦碛伞?br> 當(dāng)在非細(xì)胞體系中合成目的蛋白質(zhì)時(shí)，來(lái)自于細(xì)胞提取液的外源mRNA的存在，合成了由該外源mRNA編碼的蛋白質(zhì)。當(dāng)在非細(xì)胞體系中目的蛋白質(zhì)被標(biāo)記時(shí)，由上述外源mRNA編碼的蛋白質(zhì)也被標(biāo)記了，這就給后面的目的蛋白質(zhì)的分析帶來(lái)了困難。此外，上述外源mRNA的存在使得目的蛋白質(zhì)的合成量急劇的減少。因此，在用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的細(xì)胞提取液中不希望有上述外源mRNA的存在。
通常已知合適的方法在核酸酶處理中沒(méi)有特別的限制，由于外源mRNA是被選擇性的去除，所以最好選用微球菌核酸酶(由Roche Diagnostics生產(chǎn))來(lái)處理昆蟲細(xì)胞提取液，該核酸酶在鈣離子存在的條件下選擇性降解mRNA。
特別的，將微球菌核酸酶(由Roche Diagnostics生產(chǎn))和氯化鈣一起加入到昆蟲細(xì)胞提取液中混合，在15℃-25℃反應(yīng)5分鐘-60分鐘。因?yàn)樵诩尤胗糜诘鞍缀铣傻耐庠磎RNA和基本成分翻譯開(kāi)始進(jìn)行后，這時(shí)微球菌核酸酶就會(huì)降解，所以微球菌核酸酶最終加入的濃度優(yōu)選于在10μg/mL-100μg/mL范圍內(nèi)，更優(yōu)選于30μg/mL-60μg/mL。并且，由于氯化鈣可能抑制翻譯的進(jìn)行，而且對(duì)微球菌核酸酶的活性起著重要的作用，所以它的最終加入濃度優(yōu)選于在0.05mM-50mM范圍內(nèi)，更優(yōu)選于0.1mM-1mM。進(jìn)行完上述的反應(yīng)之后，鈣離子需要被螯合掉，因?yàn)槲⑶蚓怂崦傅幕钚砸蕾囉阝}離子，所以加入聚乙二醇二(2-氨乙基乙醚)四乙酸(下文中被稱為EGTA)能使微球菌核酸酶失活。為了使鈣離子被充分的螯合掉，EGTA的最終加入濃度優(yōu)選于0.1mM-100mM范圍內(nèi)，更優(yōu)選于1mM-20mM。
本發(fā)明同時(shí)也提供了一種利用上述提取液用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的方法。為了現(xiàn)實(shí)這樣的合成反應(yīng)，需要制備所需反應(yīng)溶液，該反應(yīng)溶液通常含有上面所述的提取液和在非細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)合成的必要添加物。上述的添加物只要能夠用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的領(lǐng)域中，就沒(méi)有任何特別的限制。
上述的反應(yīng)溶液優(yōu)選以如下方式制備包含體積比10(v/v)％-80(v/v)％，特別是30(v/v)％-60(v/v)％的本發(fā)明的提取物。
換一種表達(dá)方式，反應(yīng)溶液優(yōu)選以如下方式制備昆蟲細(xì)胞提取物在上述反應(yīng)溶液中的含量是0.1mg/ml-160mg/ml，更優(yōu)選是3mg/ml-60mg/ml。如果提取物的蛋白含量低于0.1mg/ml或高于160mg/ml，目標(biāo)蛋白的合成率可能會(huì)比較低。
總的來(lái)說(shuō)，上述反應(yīng)溶液的成分除了包含上述的提取物以外，至少還包含鉀鹽，鎂鹽，DTT，5’-三磷酸腺苷，5’-三磷酸鳥苷，磷酸肌氨酸，肌氨酸激酶，氨基酸成分，RNase抑制劑，tRNA，外源mRNA和緩沖液。上述成分使反應(yīng)溶液用于非細(xì)胞體系蛋白的合成得以實(shí)現(xiàn)，非細(xì)胞體系蛋白合成的優(yōu)點(diǎn)在于它能在短時(shí)間內(nèi)合成大量的蛋白質(zhì)。
提到反應(yīng)溶液中的鉀鹽，可以使用上述的作為提取物溶液成分的各種鉀鹽，優(yōu)選是醋酸鉀。從前述的提取物溶液中鉀鹽的單方面來(lái)看，包含在反應(yīng)溶液中鉀鹽的比例，優(yōu)選是10mM-500mM，更優(yōu)選是50mM-150mM。
提到反應(yīng)溶液中的鎂鹽，可以使用上述的作為提取物溶液成分的各種鎂鹽，優(yōu)選是醋酸鎂。從前述的提取物溶液中鎂鹽的單方面來(lái)看，包含在反應(yīng)溶液中鎂鹽的比例，優(yōu)選是0.1mM-10mM，更優(yōu)選是0.5mM-3mM。
從前述的提取物溶液中DTT的單方面來(lái)看，包含在反應(yīng)溶液中DTT的比例，優(yōu)選是0.1mM-10mM，更優(yōu)選是0.2mM-5mM。
考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中5’-三磷酸腺苷(下文中有時(shí)稱為“ATP”)的比例，優(yōu)選是0.01mM-10mM，更優(yōu)選是0.1mM-5mM。如果ATP的含量低于0.01mM或高于10mM，蛋白的合成率往往會(huì)低一些。
考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中5’-三磷酸鳥苷(下文中有時(shí)稱為“GTP”)的比例，優(yōu)選是0.01mM-10mM，更優(yōu)選是0.05mM-5mM。如果GTP的含量低于0.01mM或高于10mM，蛋白的合成率往往會(huì)低一些。
反應(yīng)溶液中的磷酸肌氨酸，作為蛋白連續(xù)合成的組分之一，用于ATP和GTP的再生。考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中磷酸肌氨酸的比例，優(yōu)選是1mM-200mM，更優(yōu)選是10mM-100mM。如果磷酸肌氨酸的含量低于1mM，大量的ATP和GTP將可能不容易再生。因此，蛋白的合成率往往會(huì)更低。如果磷酸肌氨酸的含量超過(guò)了200mM，它就會(huì)作為一種抑制物質(zhì)起作用，蛋白的合成率往往也會(huì)更低。
反應(yīng)溶液中的肌氨酸激酶，作為蛋白連續(xù)合成的組分之一，與磷酸肌氨酸同時(shí)加入，用于ATP和GTP的再生?？紤]到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中肌氨酸激酶的比例，優(yōu)選是1μg/ml-1000μg/ml，更優(yōu)選是10μg/ml-500μg/ml。如果肌氨酸激酶的含量低于1μg/ml，大量的ATP和GTP將可能不會(huì)再生。因此，蛋白的合成率往往會(huì)更低。如果肌氨酸激酶的含量超過(guò)了1000μg/ml，它就會(huì)作為一種抑制物質(zhì)起作用，蛋白的合成率往往也會(huì)更低。
反應(yīng)溶液中的氨基酸成分，包含至少20種氨基酸，例如，纈氨酸，甲硫氨酸，谷氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸，異亮氨酸，色氨酸，天冬酰氨，絲氨酸，蘇氨酸，組氨酸，天冬氨酸，酪氨酸，賴氨酸，谷氨酰氨，半胱氨酸，以及精氨酸。氨基酸也包括放射性同位素標(biāo)記的氨基酸。如果需要，而且也可以包含修飾的氨基酸。氨基酸成分在總體上包含幾乎等量的上述20種氨基酸。
本發(fā)明中，考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中上述氨基酸成分的比例，優(yōu)選是1μM-1000μM，更優(yōu)選是10μM-200μM。如果氨基酸成分的含量低于1μM或高于1000μM，蛋白的合成率往往會(huì)低一些。
反應(yīng)溶液中的RNasc抑制劑，在本發(fā)明的非細(xì)胞體系蛋白合成中，可以防止RNase酶解mRNA和tRNA，從而防止其阻礙蛋白的合成。RNase來(lái)自于昆蟲細(xì)胞，是提取溶液的干擾物質(zhì)。包含在反應(yīng)溶液中RNase抑制劑的比例，優(yōu)選是0.1U/μL-100U/μL，更優(yōu)選是1U/μL-10U/μL。如果RNase抑制劑的含量少于0.1U/μL，RNase的降解活性往往不能被充分抑制；如果RNase抑制劑的含量超過(guò)100U/μL，蛋白的合成反應(yīng)往往被抑制。
提到反應(yīng)溶液中的外源mRNA，它編碼的蛋白(包括肽)沒(méi)有特別的限制，只要mRNA不是來(lái)自昆蟲細(xì)胞，以及mRNA能編碼一種毒性蛋白或一種糖蛋白。包含在反應(yīng)溶液中的mRNA，是外源性的mRNA，還是來(lái)自于昆蟲細(xì)胞的mRNA，可以通過(guò)以下步驟來(lái)確定分離純化來(lái)自提取溶液的mRNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，分析獲得的cDNA的堿基序列，以及與已知的外源mRNAs比較堿基序列。
使用的外源mRNA在堿基的數(shù)量上沒(méi)有特別的限制，所有的外源mRNAs可以有數(shù)量不同的堿基，只要它們能合成目標(biāo)蛋白。另外，只要序列的同源性達(dá)到允許目標(biāo)蛋白合成的程度，每個(gè)外源mRNA有至少多于一個(gè)的堿基，可以缺失，替換，插入或添加。
本發(fā)明的外源mRNA可以是商業(yè)上有用的mRNA，或者是把目標(biāo)蛋白的ORF(開(kāi)放閱讀框)插入到商業(yè)上可用的載體—5’-β-球蛋白引導(dǎo)序列—的下游，如pTNT載體(Promega公司生產(chǎn))，用得到的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。另外，由核糖核酸的甲基化及其類似方法而形成的具有帽結(jié)構(gòu)的外源mRNA在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中也可以使用。
考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中的外源mRNA的比例，優(yōu)選是5μg/ml-2000μg/ml，更優(yōu)選是20μg/ml-1000μg/ml。如果外源mRNA的含量少于5μg/ml或超過(guò)2000μg/ml，蛋白的合成率往往會(huì)降低。
反應(yīng)溶液中的tRNA，包含幾乎等量的相應(yīng)于上述20種氨基酸的每一種tRNAs。在本發(fā)明中，考慮到蛋白的合成率，包含在反應(yīng)溶液中的tRNA的比例，優(yōu)選是1μg/ml-1000μg/ml，更優(yōu)選是10μg/ml-500μg/ml。如果tRNA的含量少于1μg/ml或超過(guò)1000μg/ml，蛋白的合成率往往會(huì)降低。
反應(yīng)溶液中的緩沖液，優(yōu)選是與本發(fā)明前述提取液中使用的緩沖液類似。HEPES-KOH(PH6.5-8.5)由于它與本發(fā)明前述提取液中使用的緩沖液相同，所以是優(yōu)選的。從前述的包含在提取液中的緩沖液的單方面來(lái)看，緩沖液的含量?jī)?yōu)選是5mM-200mM，更優(yōu)選是10mM-50mM。
上述的反應(yīng)溶液最好包含EGTA。這是因?yàn)?，提取液中的EGTA與其中的金屬離子可以形成一種螯合劑，使核糖核酸酶、蛋白酶及其類似物失活，從而可以抑制本發(fā)明蛋白合成中的必需組分的降解。即使上述的提取液使用了核酸酶的處理，核酸酶對(duì)隨后的無(wú)細(xì)胞蛋白合成的不利影響也肯定能夠被抑制，因?yàn)榉磻?yīng)溶液中包含有EGTA。上述反應(yīng)溶液中包含的EGTA，優(yōu)選是0.01mM-50mM，更優(yōu)選是0.1mM-10mM，考慮到其能夠較好的發(fā)揮上述的降解抑制能力。如果EGTA的含量少于0.01mM，必需組分的降解不能被充分抑制。如果EGTA的含量超過(guò)了50mM，往往能夠抑制蛋白的合成反應(yīng)。
也就是說(shuō)，用于本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞蛋白合成方法的反應(yīng)溶液，優(yōu)選包含體積比為30(v/v)％-60(v/v)％的上述提取液，50mM-150mM的醋酸鉀，0.5mM-3mM的醋酸鎂，0.2mM-5mM的DTT，0.1mM-5mM的ATP，0.05mM-5mM的GTP，10mM-100mM的磷酸肌氨酸，10μg/mL-500μg/mL的肌氨酸激酶，10μM-200μM的氨基酸成分，1U/μL-10U/μL的RNase抑制劑，10μg/mL-500μg/mL的tRNA，20μg/mL-1000μg/mL的外源mRNA，以及10mM-50mM的HEPES-KOH(PH6.5-8.5)。另外，除了上述的物質(zhì)以外，反應(yīng)溶液最好還包括0.1mM-10mM的EGTA。
本發(fā)明的非細(xì)胞體系蛋白合成方法，用上述的本發(fā)明的提取液，例如，在常規(guī)已知的低溫培養(yǎng)器中進(jìn)行。在合成反應(yīng)中，包含上述提取液的反應(yīng)溶液通常被制備和使用。
反應(yīng)溫度通常在10℃-40℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選是15℃-30℃。如果反應(yīng)溫度低于10℃，蛋白的合成率往往會(huì)更低；如果反應(yīng)溫度超過(guò)40℃，反應(yīng)溶液中的必需組分往往會(huì)發(fā)生變性。
反應(yīng)時(shí)間通常是1hr-72hr，最好是3hr-24hr。
本發(fā)明也涉及到包含本發(fā)明昆蟲細(xì)胞提取液的非細(xì)胞體系蛋白合成的試劑盒。包含在試劑盒里的昆蟲細(xì)胞提取液，最好經(jīng)過(guò)核酸酶處理。昆蟲細(xì)胞，最好是來(lái)自于粉紋夜蛾卵子或草地夜蛾卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。
試劑盒最好還進(jìn)一步包括選自下列組的全部或部分鉀鹽，鎂鹽，DTT，5’-三磷酸腺苷，5’-三磷酸鳥苷，磷酸肌氨酸，肌氨酸激酶，氨基酸成分，RNase抑制劑，tRNA，和緩沖液。這些組分，以粉末或溶液的形式包含在試劑盒中。這些組分的全部或部分，可以以混合的狀態(tài)包含在試劑盒中。試劑盒的各種組分，最好分別包裝于一個(gè)包裝盒中。
用本發(fā)明的非細(xì)胞體系蛋白合成方法合成的蛋白，可以用酶活分析，SDS-PAGE，免疫分析，以及其它的類似方法來(lái)測(cè)定。
用本發(fā)明的非細(xì)胞體系蛋白合成方法合成的蛋白，不受任何特別的限制。
實(shí)施例部分本發(fā)明在下文中以實(shí)施例的方式進(jìn)行詳細(xì)地解釋，但不是限制性的解釋。
參考實(shí)施例1昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)High Five(Invitrogen公司生產(chǎn))昆蟲細(xì)胞(2.1×107個(gè)細(xì)胞)用ExpressFive無(wú)血清培養(yǎng)基(Invitrogen公司生產(chǎn))，補(bǔ)加L-谷氨酰胺，在培養(yǎng)瓶(600cm2)中27℃培養(yǎng)6天。結(jié)果是，細(xì)胞量達(dá)到1.0×108，濕重1.21g。
實(shí)施例1昆蟲細(xì)胞提取液的制備收集上述參考實(shí)施例1中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，用下列組合物組成的抽提用的溶液洗滌3次(700×g，4℃下離心10分鐘)，然后懸浮在1mL的抽提溶液中。
60mM HEPES-KOH(PH7.9)200mM醋酸鉀4mM 醋酸鎂4mM DTT
0.5mM PMSF上述懸浮液在液氮中迅速冷凍(在10秒之內(nèi))。充分冷凍之后，懸浮液在大約10℃的水浴中解凍。完全解凍之后，15000×g 4℃下離心15分鐘(himacCR20B3，Hitachi Koki公司制造)，回收上清液。回收的上清液(1.5mL)，用下列組分的凝膠過(guò)濾緩沖液平衡過(guò)的PD-10脫鹽柱(AmershamBiosciences公司生產(chǎn))處理。
40mM HEPES-KOH(PH7.9)100mM醋酸鉀2mM 醋酸鎂1mM DTT0.5mMPMSF脫鹽處理之后，上清液用凝膠過(guò)濾緩沖液(4mL)洗脫，使用分光光度計(jì)(Ultrospec 3300 pro，Amersham Biosciences公司制造)對(duì)在280nm處吸光度不低于30的洗脫液部分進(jìn)行回收?；厥盏臑V液，進(jìn)一步進(jìn)行45,000×g，4℃下離心30分鐘，其上清液用作昆蟲細(xì)胞提取液。
參考實(shí)施例2外源mRNA的制備(1)載體DNA的構(gòu)建用pGEM-luc載體(5ng，Promega公司生產(chǎn))作為模板，加入SEQ ID；NO 1描述的堿基序列引物(Luc T7-F3-Kpn)，SEQ ID；NO 2描述的堿基序列引物(Luc T7-R4-Kpn)，以及KOD(TOYOBO公司生產(chǎn))，97℃，15秒；55℃，30秒；68℃，120秒，運(yùn)行30個(gè)PCR循環(huán)。DNA片段用乙醇沉淀純化，再用KpnI限制性酶消化。
相應(yīng)地，pTNT載體(Promega公司生產(chǎn))也用KpnI限制性酶消化。消化過(guò)的反應(yīng)溶液，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再使用Gen洗脫凝膠純化試劑盒(Gen Elute Gel Purification Kit，SIGMA公司生產(chǎn))，進(jìn)行DNA片段的純化。使用Ligation High(TOYOBO公司生產(chǎn))，對(duì)純化的DNA片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α(TOYOBO公司生產(chǎn))。質(zhì)粒DNA用堿-SDS抽提法從轉(zhuǎn)化的Escherichia coli中分離，然后用SEQ ID；NO 3描述的堿基序列引物(T7啟動(dòng)子)和Big Dye終止子循環(huán)順序FS(Big Dye TerminatorCycle Sequencing FS，Applied Biosystems公司生產(chǎn))進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序反應(yīng)(96℃下10秒，50℃下5秒，60℃下4分鐘，運(yùn)行30個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增的反應(yīng)溶液，用ABI PRISM 310基因測(cè)序儀(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer，Applied Biosystems公司生產(chǎn))進(jìn)行堿基序列的分析。將把熒光素酶基因的起始密碼子插入到源自5’-β-球蛋白引導(dǎo)序列的pTNT載體下游的質(zhì)粒，命名為pTNT-Luc。
(2)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)上述(1)中制備的pTNT-Luc用BamHI酶消化，然后用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀純化。用純化的pTNT-Luc作為模板，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液使用下列的組合物[轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液組合物]80mM HEPES-KOH(PH7.4)24mM 醋酸鎂40mM DTT7.5mM NTPs(ATP，GTP，UTP，CTP)2mM 亞精胺1U/μLRNase抑制劑(來(lái)源于人胎盤)1U/μLT7 RNA聚合酶50μg/mL pTNT-Luc/BamHINTPs(SIGMA公司生產(chǎn))，RNase抑制劑(TAKARA SHUZO公司生產(chǎn))，和T7 RNA聚合酶(Promega公司生產(chǎn))分別使用。使用低溫干燥儀MG-1000(TOKYO RIKAKIKAI公司生產(chǎn))作為反應(yīng)裝置。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃進(jìn)行4小時(shí)，反應(yīng)溶液的量是20μL。
(3)外源mRNA的純化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成之后，1U不含RNase的RQ1 DNase(RQ1 RNase freeDNase，Promega公司生產(chǎn))加入到上述(2)的反應(yīng)溶液(20μL)中?；旌衔镌?7℃保溫15分鐘，使模板DNA消化。蛋白用苯酚-氯仿抽提法除去，加入終濃度為0.3M的醋酸鉀，進(jìn)行乙醇沉淀。獲得的沉淀，用100μL的雙蒸水溶解，然后上Nick柱(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))用雙蒸水(400μL)洗脫。洗脫部分進(jìn)行回收，再加入終濃度為0.3M的醋酸鉀，接著進(jìn)行乙醇沉淀。合成的外源mRNA，在260nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)量。結(jié)果是，20μL的反應(yīng)溶液中有大約60μg的外源mRNA合成。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1用實(shí)施例1中的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中的外源mRNA進(jìn)行非細(xì)胞體系蛋白合成用實(shí)施例1中制備的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中合成的外源mRNA，制備如下組分的反應(yīng)溶液，進(jìn)行非細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白合成。
50(v/v)％昆蟲細(xì)胞提取液40mM HEPES-KOH(PH7.9)100mM醋酸鉀2mM 醋酸鎂2mM DTT0.5mMATP0.25mM GTP20mM 磷酸肌氨酸200μg/mL肌氨酸激酶80μM氨基酸(20種)0.25mM EGTA1U/μL RNase抑制劑(來(lái)源于人胎盤)200μg/mLtRNA320μg/mL外源mRNAATP(SIGMA公司生產(chǎn))，GTP(SIGMA公司生產(chǎn))，氨基酸(20種，SIGMA公司生產(chǎn))，RNase抑制劑(TAKARA SHUZO公司生產(chǎn))，以及tRNA(RocheDiagnostics公司生產(chǎn))要分別使用。使用低溫干燥儀MG-1000作為反應(yīng)裝置。反應(yīng)溶液量是25μL，反應(yīng)溫度是25℃，反應(yīng)時(shí)間間隔取樣，測(cè)定熒光素酶的合成量。合成的熒光素酶，用熒光素酶分析試劑盒(E-1500，Promega公司生產(chǎn))定量。將反應(yīng)溶液(2.5μL)加入到熒光素酶分析試劑(50μL)中，由熒光素酶產(chǎn)生的熒光用光度計(jì)(Tuner Designs TD-20/20，Promega公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)量。
圖2顯示了用實(shí)施例1中的昆蟲細(xì)胞提取液在每個(gè)反應(yīng)時(shí)間間隔合成的熒光素酶量。圖2中，縱坐標(biāo)表示合成的熒光素酶量(μg/mL)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。如圖2所示，蛋白合成反應(yīng)在反應(yīng)開(kāi)始后進(jìn)行了8小時(shí)，合成了24.7μg/mL的熒光素酶。
實(shí)施例2實(shí)施例1中的昆蟲細(xì)胞提取液的核酸酶處理在實(shí)施例1中的提取液中，加入微球菌核酸酶(Roche Diagnostics公司生產(chǎn)，終濃度36μg/mL)和氯化鈣(終濃度0.36mM)，混合溶液在20℃反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)后，加入終濃度為6mM的EGTA，得到的混合溶液再用作昆蟲細(xì)胞提取液。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2用實(shí)施例2中的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中的外源mRNA進(jìn)行非細(xì)胞體系蛋白合成除了使用了實(shí)施例2中制備的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中合成的外源mRNA以外，其它組分與實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的相同，制備與實(shí)施例1中有相似組分的反應(yīng)溶液，進(jìn)行非細(xì)胞體系的蛋白合成。
圖3顯示了用實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1和2的昆蟲細(xì)胞提取液，在合成反應(yīng)開(kāi)始后的5小時(shí)中，熒光素酶合成量的變化。圖3中，縱坐標(biāo)是以未經(jīng)核酸酶處理的提取液在反應(yīng)5小時(shí)后反應(yīng)溶液中熒光素酶含量作為100％計(jì)算，來(lái)表示的熒光素酶的相對(duì)合成量(％)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。如圖3所示，如果使用實(shí)施例2中核酸酶處理過(guò)的昆蟲細(xì)胞提取液，蛋白的合成量會(huì)增加。
參考實(shí)施例3帽結(jié)構(gòu)的添加已知許多真核細(xì)胞mRNAs中的7-甲基鳥嘌呤5’帽結(jié)構(gòu)，能夠使mRNA穩(wěn)定，并且可以提高mRNA對(duì)核糖體的親和力。如果在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入甲基化的核糖核苷酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’末端會(huì)形成帽結(jié)構(gòu)。更明確地，有帽結(jié)構(gòu)的外源mRNA可以按下文中的步驟合成。
以參考實(shí)施例2(1)中相同方式生產(chǎn)的pTNT-Luc，用BamHI消化，然后用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，進(jìn)行純化。以純化的pTNT-Luc作為模板，核糖7-甲基帽類似物(Ribo m7Cap Analog，Promega公司生產(chǎn))作為甲基化的核糖核苷酸，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液的組成如下[轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液組合物]80mM HEPES-KOH(PH7.9)24mM 醋酸鎂40mM DTT7.5mM ATP7.5mM UTP7.5mM CTP0.6mM GTP3mM核糖7-甲基帽類似物2mM亞精胺1U/μL RNase抑制劑(來(lái)源于人胎盤)1U/μL T7 RNA聚合酶50μg/mL pTNT-Luc/BamHI實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3除了使用了實(shí)施例1中制備的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例3中合成的有帽結(jié)構(gòu)的外源mRNA以外，制備與實(shí)施例1中有相同組分的反應(yīng)溶液，進(jìn)行非細(xì)胞體系的蛋白合成。結(jié)果是，反應(yīng)10小時(shí)后合成的熒光素酶，大約是無(wú)帽結(jié)構(gòu)外源mRNA合成量(實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1)的2.6倍。
圖4顯示了用實(shí)施例1中的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例3中的mRNA，在合成反應(yīng)開(kāi)始后的10小時(shí)中，熒光素酶合成量的變化。圖4中，縱坐標(biāo)是以實(shí)施例1中的昆蟲細(xì)胞提取液和無(wú)帽結(jié)構(gòu)的外源mRNA(參考實(shí)施例2)在反應(yīng)10小時(shí)后反應(yīng)溶液中熒光素酶含量作為100％計(jì)算，來(lái)表示的熒光素酶的相對(duì)合成量(％)，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。
比較實(shí)施例1除了將參考實(shí)施例1中以相同方式培養(yǎng)的High Five(Invitrogen公司生產(chǎn))昆蟲細(xì)胞冷卻，懸浮，劇烈振蕩5分鐘用于抽提之外，以實(shí)施例1和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中相同的方式，進(jìn)行非細(xì)胞體系的蛋白合成。
結(jié)果是，反應(yīng)在2小時(shí)后終止了，熒光素酶的合成量是20ng/mL，大約是實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中合成量的1/1000。
比較實(shí)施例2除了將參考實(shí)施例1中以相同方式培養(yǎng)的High Five(Invitrogen公司生產(chǎn))昆蟲細(xì)胞溶解在一種細(xì)胞裂解試劑中(Cell Culture Lysis Reagent，Promega公司生產(chǎn))然后抽提之外，以實(shí)施例1和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中相同的方式，進(jìn)行非細(xì)胞體系的蛋白合成。
結(jié)果是，反應(yīng)在2小時(shí)后終止了，熒光素酶的合成量是200ng/mL，大約是實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中合成量的1/100。
參考實(shí)施例4昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)Sf21(Invitrogen公司生產(chǎn))昆蟲細(xì)胞27℃在sf900-II無(wú)血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將每毫升培養(yǎng)基含有的6.0×105個(gè)Sf21細(xì)胞，在培養(yǎng)基中(50mL)懸浮培養(yǎng)，以125mL厄氏搖瓶(Erlenmeyer flask)，27℃，130rpm，培養(yǎng)5天。結(jié)果是，每毫升培養(yǎng)基細(xì)胞量達(dá)到了1.0×108，濕重3g。用這些細(xì)胞，制備細(xì)胞提取液。
實(shí)施例3昆蟲細(xì)胞提取液的制備首先，收集上述參考實(shí)施例4中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，用下列組分組成的洗滌溶液洗滌3次(700×g，4℃下離心10分鐘)，然后懸浮在3mL有下列組分的抽提溶液中。
40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸鉀2mM 醋酸鎂2mM 氯化鈣1mM DTT[抽提溶液組合物]40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸鉀2mM 醋酸鎂2mM 氯化鈣20％(v/v)甘油
1mM DTT0.5mM PMSF上述懸浮液在液氮中迅速冷凍(在10秒之內(nèi))。充分冷凍之后，懸浮液在大約4℃的冰水浴中解凍。完全解凍之后，30,000×g，4℃下離心10分鐘(himacCR20B3，Hitachi Koki公司制造)，上清液1A回收。回收的上清液1A，進(jìn)一步在45,000×g，4℃下離心30分鐘(himacCR20B3，Hitachi Koki公司制造)，得到上清液1B?；厥盏纳锨逡?B(2.5mL)，用下列組分的凝膠過(guò)濾緩沖液平衡過(guò)的PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))處理。
40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸鉀2mM 醋酸鎂1mM DTT0.5mM PMSF脫鹽處理之后，上清液用凝膠過(guò)濾緩沖液(3mL)洗脫，使用分光光度計(jì)(Ultrospec 3300 pro，Amersham Biosciences公司制造)對(duì)在280nm處吸光度不低于30的洗脫液部分進(jìn)行回收，用作昆蟲細(xì)胞提取液。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4用實(shí)施例3中的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中的外源mRNA進(jìn)行非細(xì)胞體系蛋白合成用實(shí)施例3中制備的昆蟲細(xì)胞提取液和參考實(shí)施例2中合成的外源mRNA，制備如下組分的反應(yīng)溶液，進(jìn)行非細(xì)胞體系的蛋白合成。
50(v/v)％昆蟲細(xì)胞提取液40mM HEPES-KOH(pH7.9)100mM醋酸鉀1.5mM醋酸鎂2mM DTT0.25mM ATP0.1mMGTP20mM 磷酸肌氨酸
200μg/mL 肌氨酸激酶80μM 氨基酸(20種)0.1mM EGTA1U/μL RNase抑制劑200μg/mL tRNA320μg/mL 外源mRNA(編碼熒光素酶基因)要使用ATP(SIGMA公司生產(chǎn))，GTP(SIGMA公司生產(chǎn))，氨基酸(20種，SIGMA公司生產(chǎn))，RNase抑制劑(TAKARA SHUZO公司生產(chǎn))，以及tRNA(Roche Diagnostics公司生產(chǎn))。使用低溫干燥儀MG-1000作為反應(yīng)裝置。反應(yīng)溶液量是25μL，反應(yīng)溫度是25℃，反應(yīng)時(shí)間是6小時(shí)。以實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中相同的方式，隨時(shí)間測(cè)定熒光素酶的合成量。結(jié)果是，合成了16.3μg/mL的熒光素酶(圖5)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種用于非細(xì)胞體系蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法(該提取液制備簡(jiǎn)單，并且可以合成大量的蛋白)，昆蟲細(xì)胞提取液，非細(xì)胞體系的蛋白合成方法(該方法使用了昆蟲細(xì)胞提取液)，以及非細(xì)胞體系蛋白合成的試劑盒(包含昆蟲細(xì)胞提取液)。
本申請(qǐng)是在申請(qǐng)?zhí)枮?82415/2002的日本專利基礎(chǔ)上進(jìn)行的申請(qǐng)，其內(nèi)容一并引入這里作為參考。
序列表(自由格式文本(free text))SEQ ID；NO 1引物L(fēng)uc T7-F3-KpnSEQ ID；NO 2引物L(fēng)uc T7-R4-KpnSEQ ID；NO 3引物T7啟動(dòng)子序列表<110>聯(lián)合株式會(huì)社(RENGO CO，LTD.)<120>無(wú)細(xì)胞蛋白合成所用的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，昆蟲細(xì)胞提取液和利用昆蟲細(xì)胞提取液進(jìn)行的無(wú)細(xì)胞蛋白合成<130>1160<140>
<141>
<150>JP 2002-382415<151>2002-12-27<160>3<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-F3-Kpn<400>1ggggtaccat ggaagacgcc aaaaacataa 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-R4-Kpn<400>2ggggtacctt acaatttgga ctttccgcc 29
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7啟動(dòng)子<400>3taatacgact cactataggc20
權(quán)利要求
1.無(wú)細(xì)胞蛋白合成所用的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，包括至少一個(gè)將懸浮在抽提溶液中的昆蟲細(xì)胞迅速冷凍的步驟，以便允許從所述昆蟲細(xì)胞進(jìn)行抽提。
2.權(quán)利要求1的方法，其中從所述昆蟲細(xì)胞進(jìn)行抽提包括將所述昆蟲細(xì)胞在迅速冷凍之后解凍，并對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行離心。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中昆蟲細(xì)胞用液氮冷凍。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中昆蟲細(xì)胞在-10℃-20℃的水浴或冰水浴中解凍。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的方法，其中抽提溶液包括蛋白酶抑制劑。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的方法，還包括進(jìn)行核酸酶處理。
7.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的方法，其中昆蟲細(xì)胞是來(lái)自于粉紋夜蛾卵子細(xì)胞或草地夜蛾卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞，或者是粉紋夜蛾卵子細(xì)胞和草地夜蛾卵巢細(xì)胞的細(xì)胞組合物。
8.由權(quán)利要求1-7任一方法制備的用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液。
9.一種無(wú)細(xì)胞蛋白合成方法，包括使用權(quán)利要求8的昆蟲細(xì)胞提取液。
10.權(quán)利要求9的方法，包括使用具有帽結(jié)構(gòu)的外源mRNA。
11.一種無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒，包含權(quán)利要求8的昆蟲細(xì)胞提取液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于無(wú)細(xì)胞蛋白合成的昆蟲細(xì)胞提取液的制備方法，昆蟲細(xì)胞提取液，使用昆蟲細(xì)胞提取液的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白合成方法，以及包含昆蟲細(xì)胞提取液的無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒。該提取液用本發(fā)明的方法制備簡(jiǎn)單，并且比用傳統(tǒng)方法制備的提取液能合成更高產(chǎn)量的蛋白。
文檔編號(hào)C12N1/06GK1609228SQ200310124960
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者江連徹, 東出將賢, 鈴木崇, 伊東昌章, 遠(yuǎn)藤幸喜 申請(qǐng)人:株式會(huì)社島津制作所