專(zhuān)利名稱(chēng)：昆蟲(chóng)抗菌肽dsp融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲(chóng)抗菌肽DSP融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因植物是采用基因工程的手段將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞基因組中，使新的基因在植物體內(nèi)表達(dá)，能夠穩(wěn)定遺傳，同時(shí)使植物增強(qiáng)抗蟲(chóng)、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等性狀。轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)及其產(chǎn)品是當(dāng)今世界農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)科技革命的核心內(nèi)容之一，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)科技手段的更新?lián)Q代以及農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整具有重要的戰(zhàn)略意義。由植物病害所造成農(nóng)作物產(chǎn)量的損失全世界每年高達(dá)300-500億美元。傳統(tǒng)育種對(duì)抗病品種選育做出了最為重要的貢獻(xiàn)，但由于植物本身抗病基因有限和單個(gè)抗病基因所介導(dǎo)的抗病性具有高度專(zhuān)化性，抗病譜比較窄，只能抗有限的小種，以致病原菌群體發(fā)生變化時(shí)，就面臨抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)，從而無(wú)法滿(mǎn)足農(nóng)作物病害防治的需要?？共∞D(zhuǎn)基因植物研究具有廣闊前景，人類(lèi)為尋找新抗病基因正在不懈努力，抗病譜寬、抗病性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐受性的轉(zhuǎn)基因植物將為獲得新的抗病品種提供了更為強(qiáng)大的手段。抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在 2000 7000左右，由20 60個(gè)氨基酸殘基組成。這類(lèi)活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。植物本身可產(chǎn)生多種抗菌肽，但研究發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的抗菌肽基因的表達(dá)只對(duì)病原菌產(chǎn)生中等程度抗性，這是由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的病原與寄主的相互作用和進(jìn)化，植物病原菌已經(jīng)對(duì)這些植物抗菌肽產(chǎn)生了耐受性。因此，非植物來(lái)源的抗菌肽基因在植物抗病中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。昆蟲(chóng)抗菌肽昆蟲(chóng)免疫的效應(yīng)物，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等表現(xiàn)廣譜抗性，抗菌性強(qiáng)、抗菌效果快。據(jù)aiai-Matsuzaki-Huanf模型，多數(shù)抗菌肽的作用機(jī)制都是基于多肽與磷脂互作導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂而引起細(xì)胞損傷。由于抗菌肽作用于磷脂類(lèi)而非酶類(lèi)，因此，很少有病原對(duì)抗菌肽產(chǎn)生抗性，這些特點(diǎn)正是理想的外源抗病基因所需要具有的。因此，昆蟲(chóng)抗菌肽在植物抗病基因工程方面的應(yīng)用具有強(qiáng)大的潛力。目前已發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)抗菌肽可以抑制許多農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中非常重要的植物病原真菌和細(xì)菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假單孢菌、胡蘿卜軟腐歐氏桿菌、水稻白葉枯病菌等細(xì)菌。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗菌肽導(dǎo)入植物中表達(dá)，可使作物對(duì)植物病原細(xì)菌和真菌產(chǎn)生有效抗性、煙草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表達(dá)并獲得抗病株系的報(bào)道。然而，目前在植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的主要是天蠶素基因，而其他絕大多數(shù)抗菌肽在轉(zhuǎn)基因植物中的抗病功能還沒(méi)有測(cè)試。Diapause-specific peptide (DSP)產(chǎn)生于蓼藍(lán)齒脛葉甲(Gastrophysa atrocyanea)，含有41個(gè)氨基酸殘基，其中有6個(gè)Cys，具有抗真菌活性(Hiromasa Tanaka, et al. , 2003 ；Hiromasa Tanaka and Koichi Suzuki, 2005 ；Takahide Kouno,M. Μ. et al., 2007)。其氨基酸序列為 AVRIGPCDQVCPRIVPERHECCRAHGRSGYAYCSGGGMYCN。關(guān)于 DSP 的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域較多，在植物抗病方面尚無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種昆蟲(chóng)抗菌肽DSP融合蛋白。本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱(chēng)為ChtSP-DSP，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明所提供的所述融合蛋白的編碼基因(命名為ChtSP-DSP)，為如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述融合蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由183個(gè)堿基組成，自5’端第1位_60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I 的信號(hào)肽的編碼序列，第61位-183位為昆蟲(chóng)抗菌肽DSP的編碼序列。含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在PGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述編碼基因是通過(guò)權(quán)所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。所述病菌為擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(bootrytis cinerea)禾口 / 或卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)。將水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I的信號(hào)肽連接到DSP的N端，并對(duì)這一融合結(jié)構(gòu)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其有利于在植物中高表達(dá)，再將其構(gòu)建到Gateway載體系列的pGWBll (C端連FLAG標(biāo)簽)中?？共⌒詸z測(cè)的結(jié)果顯示，DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霄菌(Botrytis cinerea)禾口卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis) 等真菌具有明顯的抗性。證明DSP在控制植物真菌病害方面效果明顯，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將序列表中序列1所示的融合基因轉(zhuǎn)入植物提高植物的抗病性，這是傳統(tǒng)育種技術(shù)所無(wú)法做到的。本發(fā)明利用植物源外的基因來(lái)提高植物的抗病性，為植物病害控制提供了一條新途徑，若將其融入到作物育種程序?qū)⒂袕V闊的前景。


圖1為ChtSP-DSP融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析結(jié)果；其中，圖1中A為重組載體pGWBll =ChtSP-DSP的部分結(jié)構(gòu)示意圖；圖1中B為對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株Tl的15 個(gè)株系用PCR檢測(cè)DSP基因整合到基因組上的結(jié)果；圖1中C為對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T2的 6個(gè)株系用real-time PCR檢測(cè)DSP基因轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果；圖1中D為選擇轉(zhuǎn)錄水平較高的6個(gè)株系用western blot技術(shù)檢測(cè)ChtSP-DSP-FLAG的表達(dá)結(jié)果。圖2為ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌抗性的檢測(cè)結(jié)果；其中，圖2中A為接種后12天轉(zhuǎn)基因擬南芥line Kline 2和line3和野生型Col-O感染白粉菌的表型結(jié)果；圖 2中B為接種后6天擬南芥葉片上的單孢產(chǎn)生的分生孢子，紅色箭頭所指為原始單孢子；圖 2中C為擬南芥葉片上單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖3為ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)灰霉菌的抗性檢測(cè)結(jié)果；其中，圖3中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3以及野生型對(duì)照Col-O的表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥linel、line2、line3、line4和linel3以及野生型對(duì)照Col-O的病斑面積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖4為ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)卵菌的抗性檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例一、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及其檢測(cè)一、ChtSP-DSP融合基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析1、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體為gateway系列中的pGWBll載體(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是=Nakagawa, T.，Kurose, T.，Hino, T.，Tanaka, K.，Kawamukai，M.，Niwa, Y.，Toyooka, K.，Matsuoka, K.，Jinbo, T. and Kimura，Τ. (2007)Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J.Biosci.Bioeng. 104，34-41.)，該載體攜帶能夠組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaM35Spr0m0ter)，能夠組成型表達(dá)目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌為GV3101菌株(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是Van Larebeke N, Engler G, Holsters Μ, Van den Elsacker S, Zaenen I, Schilperoort RA, Schell J(1974)Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability. Nature 252:169-170·)。先>1 各經(jīng)過(guò)密碼子在線軟件 http://www. icat. de/禾口 http//miracle. iRib. res, in/dynavac/優(yōu)化過(guò)的ChtSP-DSP基因融合序列送到genescript公司合成，此序列被連接到PUC57載體(購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SD1176)上。以 PUC57 -ChtSP-DSP為模板，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCTTTG-3’ 和下游引物
5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTAG-3，，擴(kuò)增產(chǎn)物在華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼具有序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的融合蛋白，序列表中序列 2由61個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列1自5’端第1位-60位為水稻幾丁質(zhì)酶Cht-I 的信號(hào)肽的編碼序列，第61位-183位為昆蟲(chóng)抗菌肽diapause-specific peptide (DSP)的編碼序列。將該融合基因命名為ChtSP-DSP，將其編碼的融合蛋白命名為ChtSP-DSP。將測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物與pD0NR207載體(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為I22I3Ol3)以及Gateway BP Clonase酶混合物(購(gòu)自Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 11789-021)于25°C共同孵育，得到重組載體pD0NR207 =ChtSP-Thanatin(S)0將該重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DHlOB (購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為DP77)， 卡納霉素平板篩選獲得陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒。再將PD0NR207 =ChtSP-DSP, pGWBll和 Gateway LR Clonase酶混合物(購(gòu)自hvitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為11791-043)于25°C共同孵育，獲得重組表達(dá)載體pGWBll :ChtSP-DSP。將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB (購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為DP77)，潮霉素平板篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒并送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，在PGWBll載體的attR位點(diǎn)插入了序列表中序列1所示的編碼基因，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1中A)。將pGWBll =ChtSP-DSP導(dǎo)入轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，潮霉素平板篩選并通過(guò)菌落PCR反應(yīng)鑒定(引物同上文所述)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)繁，用于轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0。2、遺傳轉(zhuǎn)化和Tl代轉(zhuǎn)化植株的分析采用花序浸泡法將GV3101攜帶的pGWBl 1 =ChtSP-DSP轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型 Col-O (購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的生物資源中心(ABRC)，產(chǎn)品目錄號(hào)為CS39005)?；ㄐ蚪莘ň唧w步驟為將花序在0D600 = 0. 6 0. 8的農(nóng)桿菌懸液(0. 5%蔗糖， 0.02 0.05% Sliwet L-77)中浸泡30秒左右，轉(zhuǎn)化后的植株用黑色塑料袋避光保濕放置 16-24小時(shí)，然后在9小時(shí)光照/15小時(shí)黑暗、溫度為22°C的植物生長(zhǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)，直到種子成熟。收獲的種子播種于含潮霉素的平板上，篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。同時(shí)，用上述方法得到轉(zhuǎn)空載體pGWBll對(duì)照擬南芥植株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的擬南芥 Col-O為野生型對(duì)照擬南芥植株。對(duì)pGWBll :ChtSP_DSP轉(zhuǎn)化獲得的擬南芥植株Tl代的15個(gè)株系(Linel-15)的基因組DNA進(jìn)行DSP的PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)所用的引物序列為5’ -GCTGTTAGAATTGGAC-3’和 5， -ATTACAATACATTCCTC-3，。結(jié)果被檢測(cè)的PGWBll :ChtSP_DSP獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株中除了株系Il(Lll)外，其余14 個(gè)株系均能擴(kuò)增出目的條帶；野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O未擴(kuò)增出目的條帶(圖1中B)。為了解DSP在轉(zhuǎn)基因擬南芥中是否轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)pGWBll :ChtSP_DSP獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株 T2中的6個(gè)株系進(jìn)行了 Real-time PCR檢測(cè)，所用的引物序列為5’-GCTGTTAGAATTGGAC_3’ 禾口 5，-ATTACAATACATTCCTC-3，。結(jié)果表明目的基因在所檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中均能轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O中不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖1中C)。為了進(jìn)一步研究ChtSP-DSP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的翻譯表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)錄水平較高的株系1 (Li)、株系2 (L2)、株系3 (L3)、株系4 (L4)、株系5 (L5)和株系13 (L13)進(jìn)行了 western blot檢測(cè)，抗體為鼠抗FLAG抗體(購(gòu)自sigma公司，目錄號(hào)為F1804)。結(jié)果顯示，ChtSP-DSP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥Li、L2、L3、L4、L5和L13中均能翻譯表達(dá)，而在野生型對(duì)照擬南芥植株Col-O中不能翻譯表達(dá)(圖1中D)。二、ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌的抗性分析對(duì)ChtSP-DSP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系I(Ll)、株系 2(L2)和株系3(L3)接種擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是=Yiping Wang，Marc Τ. Nishimura, Ting Zhao, Dingzhong Tang. 2011. ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal，68，10 :74-87)。接種方法為用吹風(fēng)機(jī)將白粉菌孢子吹進(jìn)高1米左右的密閉容器內(nèi)，靜置1小時(shí)以上，孢子可以均勻散落于密閉容器內(nèi)的擬南芥葉片上。接種后6天取葉片用trypan blue染色(圖2中B，紅色箭頭所指的是原始單孢子)，在顯微鏡下觀察單孢所產(chǎn)生的孢子數(shù)，計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2中C，表明 ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥linel、line 2和line3與野生型Col-O相比對(duì)白粉菌具有顯著的抗性。接種后12天，拍攝Col-OUinelUine 2和line3感染白粉菌的表型照片，見(jiàn)圖2 中A，從圖中可見(jiàn)，ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥IinelUine 2和line3較野生型對(duì)照Col-O具有明顯的抗性。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型對(duì)照植株的表型一致。三、ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)灰霉菌的抗性分析對(duì)ChtSP-DSP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥中翻譯表達(dá)較高的株系I(Iinel)、株系 2(line2)、株系 3(line3)、株系 4(line 4)和株系 13(linel3)接種灰霉菌(Botrytis cinerea)。(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是:Yiping Wang, Marc Τ. Nishimura, Ting Zhao, Dingzhong Tang. 2011. ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal,68, (10) :74-87)。接種方法為取葉片平鋪于0. 8%瓊脂平板上，將濃度為5X 105spores/ml的灰霉菌孢子懸浮液10 μ L滴至葉片中央。22°C保濕3天后觀察表型，拍照并測(cè)量病斑直徑和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果見(jiàn)圖3，圖3中A為轉(zhuǎn)基因擬南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3以及野生型對(duì)照Col-O的葉片病斑表型，圖3中B為轉(zhuǎn)基因擬南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3 以及野生型對(duì)照Col-O的病斑面積的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。結(jié)果表明DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥的5個(gè)株系linel、line2、line3、line4和linel3較野生型對(duì)照Col-O對(duì)灰霉菌具有顯著的抗性。 轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型對(duì)照植株的表型一致。四、ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)卵菌的抗性分析對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的株系I(Iinel)、株系2 (line2)和株系3(line3)接種卵菌菌株Noco2 (Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2)(公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載過(guò)該材料的非專(zhuān)利文獻(xiàn)是=Adnane Nemri, Susanna Atwel 1, Aaron Μ. Tarone,Yu S. Huang,Keyan Zhao,David J. Studholme,Magnus Nordborg,and Jonathan D. G. Jones. 2010. Genome-wide survey of Arabidopsis natural variation in downy mildew resistance using combined association and linkage mapping. PNAS,107(22) 10302-10307.)。接種方法為將Noco2的孢子用滅菌水配制成濃度為5 X IO5孢子/ml的懸液，噴霧至2周大小的植株葉片上，于18°C、95%濕度、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天后取葉片，稱(chēng)重，用水將孢子洗下，顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算每克葉片的孢子數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖4所示，從圖中可見(jiàn)，ChtSP-DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥的3個(gè)株系linel、line2和line3與野生型對(duì)照Col-O相比，對(duì)卵菌Noco2具有顯著的抗性。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株與野生型對(duì)照植株的表型一致。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在pGWBll 載體的attR位點(diǎn)插入了權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入目的植物中， 得到與所述目的植物相比，抗病菌能力提高的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述病菌為擬南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰毒菌(Botrytis cinerea)禾口 / 或卵菌 (Hyaloperonospora arabidopsidis)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了昆蟲(chóng)抗菌肽DSP融合蛋白及其在植物抗病中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的昆蟲(chóng)抗菌肽DSP融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)?？共⌒詸z測(cè)的結(jié)果顯示，DSP轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)等真菌具有明顯的抗性。證明DSP在控制植物真菌病害方面效果明顯，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102372782SQ201110344468
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者吳廷全, 唐定中, 姚愛(ài)玉, 張永清, 陳偉達(dá), 陳永芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所