專利名稱：蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
蘇云金芽孢桿菌(本文中縮寫為＂Bt＂)因其對昆蟲害蟲的特異毒性而出名，幾乎一個(gè)世紀(jì)以來，人們利用它控制植物的昆蟲害蟲。最近幾年，產(chǎn)生了表達(dá)Bt蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因植物成功控制了昆蟲對植物的損害(例如，Vaeck等，1987，Jansens等，1997)。
盡管分離了相當(dāng)多的殺昆蟲Bt基因，但是還在繼續(xù)尋找編碼殺昆蟲蛋白質(zhì)的新的基因。實(shí)際上，與化學(xué)殺昆蟲劑比較，已知?dú)⒗ハxBt蛋白質(zhì)有相對窄的靶昆蟲范圍。并且，如果有多種毒素可以針對相同的靶昆蟲物種，則將允許應(yīng)用不同作用方式的蛋白質(zhì)，由此可以防止或延遲昆蟲抗性的發(fā)展。而且，具有不同氨基酸序列的殺昆蟲Bt蛋白質(zhì)對特定昆蟲有不同水平的殺昆蟲效力，為了能夠控制不同農(nóng)作物的相關(guān)昆蟲害蟲，人們可能期望有幾種不同的殺昆蟲蛋白質(zhì)可用。
(ii)相關(guān)領(lǐng)域的描述以前，已鑒定了幾種類型的Cry2A-蛋白質(zhì)(參見Crickmore等，1998，這里并其為參考文獻(xiàn))。
本發(fā)明新的Cry2Ae蛋白質(zhì)與Cry2Aa1蛋白質(zhì)(Donovan等，GenBank記錄號M31738)有最高氨基酸序列的同一性，但是兩者的氨基酸序列仍舊有約9％的不同。
在Cry2Ab1蛋白質(zhì)(Widner和Whiteley，GenBank記錄號M23724)中發(fā)現(xiàn)了與Cry2Af蛋白質(zhì)最接近的序列同一性，但是兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列仍舊有約5％的不同。
在Cry2Ac1蛋白質(zhì)(Wu等，GenBank記錄號X57252)中，發(fā)現(xiàn)了與Cry2Ag蛋白質(zhì)最接近的序列同一性，但是兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列仍舊有約20％的不同。
其它已知的Cry2A蛋白質(zhì)包括Cry2Ad1蛋白質(zhì)(Choi等，1999)和其它Cry2Aa，Cry2Ab和Cry2Ac蛋白質(zhì)(Crickmore等，1998)。在美國專利5,338,544，公布的PCT專利申請WO 00/26371和公布的PCT專利申請WO 98/40490中還記載了Cry2A-樣蛋白質(zhì)和編碼它們的DNA序列。
植物中Cry2A-類蛋白質(zhì)的表達(dá)在例如，Kota等，(1999)和公布的PCT專利申請WO 00/26371中已有描述。
本發(fā)明目的和概述本發(fā)明提供了編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列，所述蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP4248的cry2Ae基因編碼的蛋白質(zhì)的最小毒性片段的氨基酸序列，b)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4247的cry2Af基因編碼的蛋白質(zhì)的最小毒性片段的氨基酸序列，和c)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP4249的cry2Ag基因編碼的蛋白質(zhì)的最小毒性片段的氨基酸序列。
本發(fā)明特別優(yōu)選的是編碼如下蛋白質(zhì)的核酸序列，尤其是DNA序列，所述蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列SEQ ID No.2蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列，SEQ ID No.4蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列，SEQID No.4蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列。
而且，本發(fā)明提供了編碼如下蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列，所述蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列SEQ ID No.2中從氨基酸位置1到氨基酸位置632的氨基酸序列，SEQ ID No.4中從氨基酸位置1到氨基酸位置632的氨基酸序列，SEQ ID No.6中從氨基酸位置1到氨基酸位置627的氨基酸序列。
而且，本發(fā)明提供了包含人工序列的上述核酸序列，特別是DNA序列，其中所述人工序列盡管與天然存在的序列比較有不同的密碼子使用，但是仍編碼相同的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲片段，優(yōu)選此密碼子使用類似于植物的密碼子使用，特別是核酸序列(尤其是DNA序列)將要轉(zhuǎn)化的宿主植物的密碼子使用。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了包含選自下面的氨基酸序列的蛋白質(zhì)a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4248的cry2Ae基因編碼的蛋白質(zhì)的最小毒性片段的氨基酸序列，b)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP4247的cry2Af基因編碼的蛋白質(zhì)的最小毒性片段的氨基酸序列，和c)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4249的cry2Ag基因編碼的蛋白質(zhì)的殺昆蟲最小毒性片段的氨基酸序列。
這里特別優(yōu)選的是包含選自下面的氨基酸序列的蛋白質(zhì)SEQ ID No.2蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列，SEQ ID No.4蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列，SEQ ID No.6蛋白質(zhì)的殺昆蟲片段的氨基酸序列。
這里也提供了受植物可表達(dá)啟動(dòng)子控制的包含上述DNA的嵌合基因，及經(jīng)轉(zhuǎn)化而含有這些嵌合基因的植物細(xì)胞、植物或種子，特別是選自下面的植物細(xì)胞、植物或種子玉米、棉花、水稻、煙草、油籽油菜、蕓苔屬種、茄子、大豆、馬鈴薯、向日葵、番茄、甘蔗、茶、豆、煙草、草莓、苜蓿、黃瓜、西瓜、胡椒、燕麥、大麥、小麥、大麗花、唐菖蒲、菊花、甜菜、高梁、紫花苜蓿、蘋果、梨、草莓、花生。根據(jù)本發(fā)明，嵌合基因可以整合在植物細(xì)胞的核，質(zhì)體或線粒體DNA中，或還可以含有編碼用于靶向液泡、葉綠體、線粒體、質(zhì)體或用于分泌的有效導(dǎo)向肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了被轉(zhuǎn)化而含有任何上述DNA序列的微生物，特別是選自假單孢菌屬(Pseudomonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)或芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物。
這里也提供了控制昆蟲的方法，包括在宿主細(xì)胞，尤其是植物細(xì)胞中表達(dá)任何上述核酸序列，特別是DNA序列，和用所述宿主細(xì)胞接觸昆蟲；以及提供了使植物抗昆蟲的方法，包括用任何上述DNA序列或嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從該抗昆蟲的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明也涉及控制鱗翅目昆蟲，特別是棉花、玉米或大豆的鱗翅目昆蟲害蟲的方法，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所述的Cry2A蛋白質(zhì)，優(yōu)選這里所述的Cry2Ae蛋白質(zhì)(即，通過種植用本發(fā)明cry2A基因轉(zhuǎn)化的植物，或通過噴灑含有本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的組合物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)抗鱗翅目昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對大豆植物的損害的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及控制鱗翅目水稻昆蟲害蟲，特別是鱗翅目二化螟，稻苞蟲，稻切根蟲，稻葉夜蛾，稻縱卷葉螟或美洲稻弄蝶的方法，優(yōu)選地，昆蟲選自二化螟(Chilo suppressalis)，Chilo partellus，一點(diǎn)螟(Scirpophaga incertulas)，稻蛀莖夜蛾(Sesamia inferens)，稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocis medinalis)，Marasmia patnalis，Marasmia exigua，Marasmia ruralis，Scirpophaga innotata，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物應(yīng)用這里所述的Cry2A蛋白質(zhì)，優(yōu)選這里所述的Cry2Ae蛋白質(zhì)(即，通過種植用本發(fā)明cry2A基因轉(zhuǎn)化的水稻植物，或通過噴灑含有本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的組合物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)抗鱗翅目水稻昆蟲害蟲以最小化所述昆蟲對水稻植物的損害的用途。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，“核酸序列”指編碼本發(fā)明任何Cry2A蛋白質(zhì)的單或雙鏈形式的DNA或RNA分子，優(yōu)選DNA或RNA，特別是DNA。用在這里的“分離的核酸序列”指不再存在于其分離自的天然環(huán)境中的核酸序列，例如在另外的細(xì)菌宿主或植物核基因組中的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，可交換使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”指氨基酸序列，而不考慮任何功能性、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。因此，這里仍舊稱本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的片段或部分在本文中亦稱作“蛋白質(zhì)”。
根據(jù)本發(fā)明，已分離和表征了編碼新的BtCry毒素的核酸序列，特別是DNA序列。這些新的基因命名為cry2Ae，cry2Af，cry2Ag，它們編碼的蛋白質(zhì)命名為Cry2Ae，Cry2Af和Cry2Ag。
本發(fā)明“Cry2Ae蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.2氨基酸序列中保留了殺昆蟲活性的最小片段(此后稱為“最小毒性片段”)的任何蛋白質(zhì)，特別是包含SEQ ID No.2中從氨基酸位置1到氨基酸位置625，尤其是到氨基酸位置632的氨基酸序列的任何蛋白質(zhì)。這包括含有最小毒性蛋白質(zhì)片段的雜合和嵌合蛋白質(zhì)，及含有SEQ ID No.2蛋白質(zhì)的三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)的蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ ID No.2氨基酸序列的變異體，例如，用GCG的Wisconsin包的GAP程序(Madison，Wisconsin，美國，版本10.0；在GAP程序中用GCG缺省值；對于氨基酸序列比較，用blosum62記分矩陣)利用成對對齊測定在氨基酸序列水平上有至少92％、特別是至少93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選已添加、置換或缺失一些(優(yōu)選5-10個(gè)，尤其是少于5個(gè))氨基酸而未顯著改變，優(yōu)選沒有改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲活性的蛋白質(zhì)，例如SEQ ID No.8的Cry2Ae蛋白質(zhì)。
這里所用的術(shù)語“包含序列X的DNA/蛋白質(zhì)”指包含或含有至少序列X的DNA或蛋白質(zhì)，這樣可以在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端包含其它的核苷酸或氨基酸序列，例如EP 0 193 259中所公開的可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)(的核苷酸序列)、轉(zhuǎn)運(yùn)肽(的核苷酸序列)和/或5′或3′前導(dǎo)序列。
這里所用本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的“最小毒性片段”是指可以通過對全長Cry蛋白質(zhì)酶促消化得到的保留殺昆蟲活性的Cry蛋白質(zhì)的最小片段或部分，所述酶優(yōu)選為胰蛋白酶或糜蛋白酶；或是指可以通過在編碼Cry蛋白質(zhì)的DNA中產(chǎn)生核苷酸缺失而得到的保留殺昆蟲活性的Cry蛋白質(zhì)的最小片段或部分。利用本領(lǐng)域常規(guī)可用技術(shù)，通過對上述片段的氨基酸序列進(jìn)行測定可以方便地確定最小毒性片段的N-和C-端氨基酸序列的末端。對于本發(fā)明保留殺昆蟲活性的Cry2A蛋白質(zhì)片段，通?？梢援a(chǎn)生N-末端缺失而幾乎不可以在其C-末端進(jìn)行缺失。對于本發(fā)明Cry2Ae和Cry2Af蛋白質(zhì)，預(yù)期在C-末端可以產(chǎn)生一直到氨基酸位置625的缺失(即，C-末端氨基酸可以是位置625的氨基酸)而同時(shí)保留殺昆蟲活性，對于Cry2Ag蛋白質(zhì)，預(yù)期在C-末端可以產(chǎn)生一直到氨基酸位置620的缺失(即，C-末端氨基酸可以是位置620的氨基酸)而同時(shí)保留蛋白質(zhì)的殺昆蟲活性。在本發(fā)明三種Cry2A蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，預(yù)期N-末端缺失可以一直到約第50位氨基酸，優(yōu)選N-末端缺失一直到氨基酸位置50(即，N-末端氨基酸將是序列表所示序列的第50位)而仍保留它們的抗鱗翅目昆蟲的大部分殺昆蟲活性。
本發(fā)明“Cry2Af蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.4氨基酸序列中的最小毒性片段的任何蛋白質(zhì)，特別是包含SEQ ID No.4中從氨基酸位置1到氨基酸位置625，尤其是到氨基酸位置632的氨基酸序列的任何蛋白質(zhì)。這包括含有最小毒性蛋白質(zhì)片段的雜合和嵌合蛋白質(zhì)，及含有SEQ ID No.4蛋白質(zhì)的三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)的蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ ID No.4氨基酸序列的變異體，例如，用GCG的Wisconsin包的GAP程序(Madison，Wisconsin，美國，版本10.0；在GAP程序中用GCG缺省值；對于氨基酸序列比較，用blosum62記分矩陣)利用成對對齊測定在氨基酸序列水平上有至少95％、特別是至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選已添加、置換或缺失一些(優(yōu)選5-10個(gè)，尤其是少于5個(gè))氨基酸而未顯著改變，優(yōu)選沒有改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明“Cry2Ag蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.6氨基酸序列中的最小毒性片段的任何蛋白質(zhì)，特別是包含SEQ ID No.6中從氨基酸位置1到氨基酸位置620，尤其是到氨基酸位置627的氨基酸序列的任何蛋白質(zhì)。這包括含有最小毒性蛋白質(zhì)片段的雜合或嵌合蛋白質(zhì)，及含有SEQ ID No.6的毒性片段的三個(gè)結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ ID No.6氨基酸序列的變異體，例如，用GCG的Wisconsin包的GAP程序(Madison，Wisconsin，美國，版本10.0；在GAP程序中用GCG缺省值；對于氨基酸序列比較，用blosum62記分矩陣)利用成對對齊測定在氨基酸序列水平上有至少80％，特別是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選已添加、置換或缺失一些(優(yōu)選5-10個(gè)，尤其是少于5個(gè))氨基酸而未顯著改變，優(yōu)選沒有改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲活性的蛋白質(zhì)。
這里所用術(shù)語“cry2Ae DNA”，“cry2Af DNA”或“cry2Ag DNA”分別指編碼如上所定義的Cry2Ae，Cry2Af或Cry2Ag蛋白質(zhì)的任何DNA序列。這包括編碼如上所述SEQ ID Nos.2，4或6的蛋白質(zhì)或它們的殺昆蟲片段或變異體的天然、人工或合成的DNA序列。這里也包括編碼殺昆蟲蛋白質(zhì)的如下DNA序列，該DNA序列與保藏的基因組DNA序列或序列表中提供的序列的編碼區(qū)足夠相似，這樣在嚴(yán)格雜交條件下它們能(即，有能力)與這些DNA序列雜交。這里所用的嚴(yán)格雜交條件特別指下面的條件在濾膜上固定相關(guān)基因組DNA序列，在42℃，50％甲酰胺，5％SSPE，2xDenhardt試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交濾膜1到2小時(shí)，或者在68℃，6x SSC，2xDenhardt試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交濾膜1到2小時(shí)。然后，向預(yù)雜交液體中直接加入變性的(地高辛或放射性)標(biāo)記探針，在上述合適的溫度下，進(jìn)行溫育16到24小時(shí)。溫育后，在室溫，2x SSC，0.1％SDS中洗濾膜30分鐘，隨后在68℃，0.5x SSC和0.1％SDS中再洗2次，每次30分鐘。在-70℃，用增感屏，通過濾膜使X射線膠片(Kodak XAR-2或等效物)曝光24到48小時(shí)，建立放射自顯影。當(dāng)然，在該方法中，可以用等同的條件和參數(shù)，同時(shí)仍舊保留期望的嚴(yán)格雜交條件。本發(fā)明cry2AeDNA的優(yōu)選變異體是編碼上述殺昆蟲Cry2Ae蛋白質(zhì)變異體的DNA，或是與SEQ ID No.1的編碼序列有至少92％，優(yōu)選至少93到97％，特別地至少98％或至少99％序列同一性的、編碼殺昆蟲蛋白質(zhì)的DNA序列。特別是，在嚴(yán)格雜交條件下，該DNA序列也能與保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4248的cry2Ae編碼序列雜交，或與SEQ ID No.1的編碼序列雜交。本發(fā)明cry2Af DNA的優(yōu)選變異體是編碼上述殺昆蟲Cry2Af蛋白質(zhì)變異體的DNA，或是與SEQ ID No.3的編碼序列有至少95％，優(yōu)選至少96％或97％，更優(yōu)選至少98％或至少99％序列同一性的、編碼殺昆蟲蛋白質(zhì)的DNA序列。特別是，在嚴(yán)格雜交條件下，該DNA序列也能與保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4247的cry2Af編碼序列雜交，或與SEQ ID No.3的編碼序列雜交。本發(fā)明cry2Ag DNA的優(yōu)選變異體是編碼上述Cry2Ag蛋白質(zhì)變異體的DNA，或是與SEQ ID No.5的編碼序列有至少86％，優(yōu)選87％，特別地至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。特別是，在嚴(yán)格雜交條件下，該DNA序列也能與保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4249的cry2Ag編碼序列雜交，或與SEQID No.5的編碼序列雜交。上述序列同一性用10.0版本GCG的Wisconsin包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA)(使用GCG缺省值，對于DNA序列比較，用＂nwsgapdna＂記分矩陣)計(jì)算得到，而嚴(yán)格雜交條件如上所述。
這里所用蛋白質(zhì)的“殺昆蟲活性”意指當(dāng)喂食昆蟲該蛋白質(zhì)(優(yōu)選通過在重組宿主如植物中表達(dá)該蛋白質(zhì))時(shí)蛋白質(zhì)殺傷昆蟲的能力。本文中，蛋白質(zhì)的“控制昆蟲的量”指足以將以該植物為食的昆蟲對植物的損害限制到商業(yè)可接受的水平的蛋白質(zhì)量，例如可通過殺死昆蟲或抑制昆蟲的發(fā)育、生育力或生長來降低昆蟲對植物的損害以及使植物產(chǎn)量不受到顯著不利地影響。
根據(jù)本發(fā)明，使對本發(fā)明的新Cry蛋白質(zhì)敏感的昆蟲接觸該蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的用量為控制昆蟲的量，優(yōu)選為殺昆蟲量。本發(fā)明蛋白質(zhì)的優(yōu)選靶昆蟲是造成經(jīng)濟(jì)損失的玉米，棉花，水稻和大豆植物的昆蟲害蟲，特別是在北美和南美國家中。本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，尤其是Cry2Ae蛋白質(zhì)的特別優(yōu)選的靶昆蟲是實(shí)夜蛾屬(Heliothis spp.)，棉鈴蟲屬(Helicoverpaspp.)，灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp.)，蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp.)，Anticarsia spp.，稈野螟屬(Ostrinia spp.)，禾草螟屬(Chilo spp.)，蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp.)，刷須野螟屬(Marasmia spp.)，白種螟屬(Scirpophaga spp.)和縱卷葉野螟屬(Cnaphaloerocis spp.)昆蟲，優(yōu)選地，最佳為煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，玉米穗蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴實(shí)夜蛾(Helicoverpa armigera)，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)和玉米螟(Ostrinia nubilalis)。
這里所用術(shù)語“Cry2A蛋白質(zhì)”，“本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)”，“Cry蛋白質(zhì)”，或“本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)”指可按本發(fā)明分離的并在這里鑒定和定義為Cry2Ae，Cry2Af或Cry2Ag蛋白質(zhì)的任何一種新的蛋白質(zhì)。這里所用Cry蛋白質(zhì)可以是全長蛋白質(zhì)，也稱為毒素原，或可以是保留了殺昆蟲活性的截短的形式，或可以是聯(lián)合了不同蛋白質(zhì)的雜合或融合蛋白質(zhì)形式。“Cry蛋白質(zhì)”指全長晶體蛋白質(zhì)，其是由天然存在的Bt DNA序列編碼的；“Cry毒素”指其殺昆蟲片段，特別是其最小的毒性片段，通常分子量為如通過SDS-PAGE電泳所測定的約50-65kD，特別是約60kD。這里所用“cry基因”，“cry2A基因”，“cry DNA”或“cry2A DNA”是編碼本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的DNA序列，指上述任何cry2Ae，cry2Af或cry2Ag DNA序列。
可以通過常規(guī)方法從重組大腸桿菌株系中分離編碼本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列，所述重組大腸桿菌株系根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2000年10月6日保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，比利時(shí))(此后縮寫為“BCCM-LMBP”)，保藏號為BCCM-LMBP 4247，表示株系XL1Blue:pUC1099E/cry2clone1，其編碼Cry2Af蛋白質(zhì)；BCCM-LMBP4248，表示株系XL1Blue:pUC1099E/cry2 clone7，其編碼Cry2Ae蛋白質(zhì)；和BCCM-LMBP 4249，表示株系XL1Blue:pUC2761A/cry2clone141，其編碼Cry2Ag蛋白質(zhì)。用常規(guī)技術(shù)，可以從這些保藏株系中分離編碼本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的DNA序列，而且可以將其插入表達(dá)載體中以產(chǎn)生大量的Cry蛋白質(zhì)?？梢杂肅ry蛋白質(zhì)通過常規(guī)方法制備特異性單克隆或多克隆抗體(H_fte等，1988)。
而且，可以通過合成產(chǎn)生用在本發(fā)明中的DNA序列。實(shí)際上，由于遺傳密碼子的簡并性，可以不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列而將一些氨基酸密碼子替換為其它氨基酸密碼子。而且，可以將一些氨基酸替換為其它等效氨基酸而不顯著改變，優(yōu)選不改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲活性。而且，對與結(jié)合或成孔無關(guān)的分子區(qū)域中氨基酸序列或組成進(jìn)行改變也不太可能引起蛋白質(zhì)殺昆蟲活性出現(xiàn)不同。本發(fā)明DNA序列的等效物包括能與SEQ ID.No.1，3或5的Cry蛋白質(zhì)的DNA序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交并編碼與本發(fā)明蛋白質(zhì)有相同殺昆蟲特征的蛋白質(zhì)的DNA序列；或與本發(fā)明天然cry2A基因比較有不同密碼子使用，但是編碼具有相同殺昆蟲活性及相同或基本相同(優(yōu)選相同)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA序列。在SEQ ID Nos.7和9中示例性顯示了密碼子優(yōu)化后的本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的DNA序列。優(yōu)化這些DNA序列的方式是利用現(xiàn)有的密碼子使用表將密碼子使用適應(yīng)性修改為植物基因(特別是目的植物屬或種的天然基因)中最優(yōu)選的密碼子使用(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等1977)(SEQ ID No.7更適應(yīng)于在棉花中的表達(dá)，而SEQ ID No.9更適應(yīng)于玉米)，并消除長于5或6，優(yōu)選長于5個(gè)核苷酸的AT或GT核苷酸序列，及插入合適的限制性位點(diǎn)。
而且，可以修飾Cry蛋白質(zhì)的N-末端以便具有最適的翻譯起始環(huán)境，為此在蛋白質(zhì)N-末端添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在大多數(shù)情況下，作為最佳翻譯起始，優(yōu)選使待在植物細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明蛋白質(zhì)開始于Met-Asp或Met-Ala二肽，這就需要在cry2A DNA中于起始密碼子的下游插入一個(gè)編碼Asp或Ala氨基酸的密碼子作為新的第二密碼子。
當(dāng)然，根據(jù)特定的目的，可以構(gòu)建密碼子使用不同但是編碼相同蛋白質(zhì)或具有基本相同殺昆蟲活性的類似蛋白質(zhì)的DNA序列。有記載，在原核生物和真核生物表達(dá)系統(tǒng)中，對于外源宿主中的基因表達(dá)可能期望將密碼子使用改變成宿主細(xì)胞的密碼子使用(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等，1977)。而且，已知Bt晶體蛋白質(zhì)基因并不偏向真核生物的密碼子，而且非常富含AT(Adang等，1985，Schnepf等，1985)。在文獻(xiàn)中(Wada等，1990；Murray等，1989)和主要DNA序列數(shù)據(jù)庫中(例如，在德國Heidelberg的EMBL)可得到密碼子使用表。因此，可以構(gòu)建合成DNA序列，以產(chǎn)生相同或基本相同的蛋白質(zhì)。明顯地，一旦已知本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就可以產(chǎn)生幾種DNA序列。這些其它DNA序列包括經(jīng)改變而使基因中一些位點(diǎn)失活的合成或半合成DNA序列，所述改變?yōu)槔?，按PCT公布WO 91/16432和WO 93/09218所述選擇性地失活天然序列中存在的一些隱蔽的調(diào)節(jié)或加工元件，或使全部密碼子使用適應(yīng)性修改為更相關(guān)的宿主生物體(優(yōu)選期望在其中實(shí)施表達(dá)的宿主生物體)的密碼子使用。在專利和科技文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)幾種可將密碼子使用修飾為宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用的技術(shù)。修飾密碼子使用的確切方法并不是本發(fā)明的重點(diǎn)，只要多數(shù)或所有隱蔽的調(diào)節(jié)序列或加工元件可以被其它序列置換即可。在所附SEQ ID Nos.7和9中示例性顯示了用于植物中表達(dá)的優(yōu)化DNA序列。
可以常規(guī)地，即通過PCR介導(dǎo)的誘變對DNA序列產(chǎn)生如上所述的小修飾(Ho等，1989，White等，1989)。并可以用現(xiàn)有技術(shù)，通過從頭DNA合成期望的編碼區(qū)域，常規(guī)地對DNA序列產(chǎn)生更復(fù)雜的修飾。
所用術(shù)語“基本相同”，當(dāng)指Cry蛋白質(zhì)的氨基酸序列時(shí)，意指包括這樣的氨基酸序列，其與被比蛋白質(zhì)的氨基酸序列有不超過5％，優(yōu)選不超過2％的差異；當(dāng)指Cry蛋白質(zhì)的毒性時(shí)，意指包括這樣的蛋白質(zhì)，其LC50值與在相同生物測定條件下得到的被比蛋白質(zhì)的LC50值相差不超過10％，優(yōu)選不超過5％。
本文中，術(shù)語Cry毒素的“結(jié)構(gòu)域”意指毒素中具有特定結(jié)構(gòu)的任何部分或域，其可以被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)(Cry)蛋白質(zhì)上以產(chǎn)生具有本發(fā)明Cry毒素的至少一個(gè)功能特征(例如結(jié)合和/或毒性特征)的新的雜合蛋白質(zhì)(Ge等，1991)。該部分可以構(gòu)成具有本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的結(jié)合和/或毒性特征的雜合Bt蛋白質(zhì)的基本特征。該雜合蛋白質(zhì)可以有擴(kuò)大的宿主范圍，改進(jìn)的毒性和/或可以用在預(yù)防昆蟲抗性發(fā)展的策略中。(歐洲專利公布(＂EP＂)408403；Visser等，1993)。
可以在適宜的表達(dá)載體中連接從總DNA制備的本發(fā)明cry DNA序列，并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后可以通過常規(guī)菌落免疫探針方法(French等，1986)用抗Cry蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體篩選表達(dá)此毒素的克隆。
而且，可以在適合的Bt穿梭載體中(Lereclus等，1992)連入本發(fā)明cry DNA，并且轉(zhuǎn)化晶體負(fù)型Bt突變體。然后篩選產(chǎn)生晶體(通過顯微鏡檢術(shù)檢測)或晶體蛋白質(zhì)(通過SDS-PAGE檢測)的克隆，或檢測這些克隆與對照晶體負(fù)型株系相比較的殺昆蟲活性。
可以用常規(guī)方法(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)測定編碼本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的基因的序列以獲得DNA序列。序列比較表明這些基因不同于以前所述編碼具有抗鱗翅目活性的毒素原和毒素的基因(參見，例如，H_fte和Whiteley，1989；Crickmore，等，1998；及與Crickmore等(1998)公開對應(yīng)的，2000年10月16日更新的Bt命名網(wǎng)站http//epunix biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html)。而且與2001年12月13日更新的該Bt命名網(wǎng)站上的任何蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白質(zhì)序列比較，本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)是新的。
基因序列分析后，可以用常規(guī)方法產(chǎn)生DNA序列的殺昆蟲有效部分，其編碼新鑒定的毒素原形式的Cry蛋白質(zhì)的殺昆蟲有效部分。在該片段中，優(yōu)選該蛋白質(zhì)中至少包含與Bt晶體蛋白質(zhì)的保守序列塊5(Hofte &Whiteley，1989；Schnepf等，1998)同源的序列，優(yōu)選多達(dá)該同源區(qū)域后2個(gè)氨基酸。對于Cry2Ae和Cry2Af蛋白質(zhì)，該同源區(qū)域分別終止在SEQ IDNos.2和4的氨基酸位置625，對于Cry2Ag則在SEQ ID No.6的氨基酸位置620?？梢詮姆蛛x的DNA序列的DNA序列信息確定Cry蛋白質(zhì)的氨基酸序列。編碼Cry蛋白質(zhì)的DNA序列的“殺昆蟲有效部分”(或區(qū)段或片段)在這里也稱作“截短的基因”或“截短的DNA”，意指編碼比毒素原形式的Cry蛋白質(zhì)具有較少氨基酸但具有殺昆蟲活性的多肽的DNA序列。
為了在大腸桿菌、其它Bt株系和植物中表達(dá)編碼本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的DNA序列的全部或殺昆蟲有效部分，可以在DNA序列側(cè)翼引入適合的限制位點(diǎn)。這可以用已知方法(Stanssens等，1989；White等，1989)，通過位點(diǎn)定向誘變完成。
為了在植物中獲得改進(jìn)的表達(dá)，可以根據(jù)PCT公布WO 91/16432和WO 93/09218；EP 0 358 962和EP 0 359 472，修飾本發(fā)明cry基因或cry基因的殺昆蟲有效部分的密碼子使用以形成等效的、修飾的或人工的基因或基因部分，或者可以在質(zhì)體、線粒體或葉綠體基因組中插入這些Bt基因或基因部分，并且用適合的啟動(dòng)子使這些基因在其中表達(dá)(如，Mc Bride等，1995；美國專利5,693,507)。為了在單子葉植物，如玉米中獲得提高的表達(dá)，也可以向嵌合基因中添加內(nèi)含子，優(yōu)選單子葉植物內(nèi)含子；此外，還可以通過位點(diǎn)定向內(nèi)含子插入和/或通過改變密碼子使用，例如將密碼子使用適應(yīng)性修改為植物(優(yōu)選特定相關(guān)植物屬)最優(yōu)選的密碼子使用(Murray et al.，1989)而不顯著改變(優(yōu)選不改變)所編碼的氨基酸序列，以翻譯中性方式進(jìn)一步改變cry基因或其殺昆蟲部分的DNA序列，從而修飾基因部分中存在的可能抑制性DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，優(yōu)選使蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，如質(zhì)體，優(yōu)選葉綠體、線粒體，或向細(xì)胞外分泌，從而潛在地優(yōu)化蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和/或表達(dá)。為了達(dá)到這個(gè)目的，本發(fā)明嵌合基因包含編碼信號或?qū)螂牡木幋a區(qū)，其與本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接?？砂诒景l(fā)明蛋白質(zhì)中的特別優(yōu)選的肽是用于靶向葉綠體或其它質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，特別是從基因產(chǎn)物靶向質(zhì)體的植物基因復(fù)制得到的轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域、Capellades等(美國專利5,635,618)的優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽，菠菜鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Oelmuller等，1993)、Wong等(1992)所述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和公布的PCT專利申請WO 00/26371中的導(dǎo)向肽。還優(yōu)選這樣的肽，與這種肽連接的蛋白質(zhì)可以在該肽發(fā)出的信號的指引下向細(xì)胞外分泌，如馬鈴薯蛋白酶抑制因子II的分泌信號(Keil等，1986)，水稻α-淀粉酶3基因的分泌信號(Sutliff等，1991)和煙草PR1蛋白質(zhì)的分泌信號(Cornelissen等，1986)。
本發(fā)明特別有用的信號肽包括引起蛋白質(zhì)向葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如，Van Den Broeck等，(1985))或美國專利5,510,471和美國專利5,635,618的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、分泌信號肽、或引導(dǎo)蛋白質(zhì)靶向其它質(zhì)體、線粒體、ER或其它細(xì)胞器的肽。在天然定向蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)中可以發(fā)現(xiàn)用于靶向細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或用于向植物細(xì)胞外分泌或靶向細(xì)胞壁的信號序列，優(yōu)選Kl_sgen等，(1989)，Kl_sgen和Weil(1991)，Neuhaus &Rogers(1998)，Bih等，(1999)，Morris等，(1999)，Hesse等，(1989)，Tavladoraki等，(1998)，Terashima等，(1999)，Park等，(1997)，Shcherban等，(1995)所述信號序列(這里并入所有這些文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))，特別是來自于玉米，棉花，水稻或大豆的定向蛋白或分泌蛋白的信號肽序列。
而且，用本領(lǐng)域已知的方法(例如，Van Rie等，1990)可以評估本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)的結(jié)合特性，以確定本發(fā)明Cry蛋白質(zhì)是否結(jié)合在其它已知Cry或Bt蛋白質(zhì)不識別(或競爭)的昆蟲中腸位點(diǎn)。特別是在植物中表達(dá)時(shí)，具有不同結(jié)合位點(diǎn)且所述位點(diǎn)在相關(guān)敏感昆蟲中不存在競爭結(jié)合的Bt毒素是極有價(jià)值的，它們可以置換昆蟲可能已經(jīng)產(chǎn)生了抗性的已知Bt毒素，或與具有不同作用方式的Bt毒素聯(lián)合使用以防止或延遲昆蟲抗Bt毒素抗性的發(fā)展。鑒于新分離的Bt毒素的這些特征，用它們轉(zhuǎn)化植物，例如單子葉植物，如玉米或水稻和雙子葉植物如棉花，大豆和蕓苔屬種植物以保護(hù)這些植物免受昆蟲損害是極其有用的。在玉米穗蟲(Helicoverpa zea)中，Cry2Aa蛋白質(zhì)與Cry1Ac蛋白質(zhì)不共用結(jié)合位點(diǎn)，這已經(jīng)有過描述(English等，1994)。類似地，預(yù)期在相關(guān)昆蟲害蟲中，本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的結(jié)合特性也不同于目前在轉(zhuǎn)基因植物中所用的Cry1或Cry9毒素的結(jié)合特性。如上所述，可以通過常規(guī)結(jié)合測定法檢測這種不同的結(jié)合特性。特別是對特定昆蟲害蟲，為了控制昆蟲抗性，優(yōu)選本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)和其它昆蟲控制蛋白質(zhì)，特別是Bt晶體蛋白質(zhì)聯(lián)合，其中所述控制蛋白質(zhì)不能識別至少一個(gè)該Cry2A蛋白質(zhì)的識別結(jié)合位點(diǎn)。與本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)(優(yōu)選Cry2Ae蛋白質(zhì))聯(lián)合(特別是用于在植物，優(yōu)選棉花植物中同時(shí)表達(dá)時(shí))的優(yōu)選昆蟲控制蛋白質(zhì)包括Cry1F蛋白質(zhì)或來源于Cry1F蛋白質(zhì)的雜合蛋白質(zhì)(例如，美國專利6,326,169；6,281,016；6,218,188中所述的雜合Cry1A-Cry1F蛋白質(zhì)，或其毒性片段)，Cry1A-類蛋白質(zhì)或其毒性片段，優(yōu)選Cry1Ac蛋白質(zhì)或來自于Cry1Ac蛋白質(zhì)的雜合蛋白質(zhì)(例如，美國專利5,880,275中所述的雜合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白質(zhì))，Estruch等(1996)和美國專利6,291,156中所述的VIP3Aa蛋白質(zhì)或其毒性片段，來源于Xhenorhabdus、沙雷氏菌屬(Serratia)或光桿狀菌屬(photorhabdus)種的殺昆蟲蛋白質(zhì)(例如，Waterfield等，2001；ffrench-Constant和Bowen，2000)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用本發(fā)明Cry2A轉(zhuǎn)化已表達(dá)昆蟲控制蛋白質(zhì)的植物，或通過雜交用昆蟲控制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物和用本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物，可以容易地實(shí)現(xiàn)此共表達(dá)。對于棉花植物，優(yōu)選用Cry2Ae蛋白質(zhì)作為第一昆蟲控制蛋白質(zhì)，用Cry1Ac或VIP3Aa蛋白質(zhì)或其衍生物作為第二昆蟲控制蛋白質(zhì)。歐洲專利0 408 403中描述了在相同植物中獲得不同Bt(或類似地，對于其它昆蟲控制蛋白質(zhì))殺昆蟲蛋白質(zhì)表達(dá)以試圖最小化或阻止昆蟲對轉(zhuǎn)基因抗昆蟲植物產(chǎn)生抗性的方法。
在昆蟲對控制蛋白質(zhì)，如Cry1 Bt蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)目前已通過轉(zhuǎn)基因植物商品化)產(chǎn)生了抗性的情況下，也可以方便地利用本發(fā)明的Cry2A蛋白質(zhì)控制昆蟲。
優(yōu)選地，為了篩選目的及增加雜草控制選項(xiàng)，也可以用編碼能賦予抗廣譜除草劑(例如基于草銨膦或草甘膦的除草劑)抗性的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物。
用常規(guī)方法，可以向單植物細(xì)胞的核基因組中穩(wěn)定插入編碼Cry毒素原的殺昆蟲有效部分的殺昆蟲有效cry基因部分或其等效物，優(yōu)選cry嵌合基因，而且可以用常規(guī)方法利用這樣轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生抗昆蟲的轉(zhuǎn)化植物。在這方面，可以用根癌農(nóng)桿菌中含有殺昆蟲有效cry基因部分的卸甲Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，此后，可以用例如在EP 0 116 718，EP 0 270 822，PCT公布WO 84/02913和公開的歐洲專利申請(＂EP＂)0 242 246及Gould等，(1991)中所述程序，從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選的Ti質(zhì)粒載體在Ti質(zhì)粒的T-DNA的兩個(gè)邊界序列之間，或至少在右邊界序列的左側(cè)含有殺昆蟲有效cry基因部分。當(dāng)然，使用如直接基因轉(zhuǎn)移(例如，如EP 0 233 247中所述)、花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，如EP 0 270 356，PCT公布WO 85/01856，和美國專利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，如EP 0 067 553和美國專利4,407,956中所述)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，如美國專利4,536,475中所述)以及其它方法，如最近描述的用于轉(zhuǎn)化一些玉米(例如，美國專利6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和水稻(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)株系的方法和通用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法(PCT公布WO92109696)，亦可以用其它類型的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。對于棉花轉(zhuǎn)化，特別優(yōu)選PCT專利公布WO 00/71733中所述的方法。對于大豆轉(zhuǎn)化，參照本領(lǐng)域已知的方法，例如Hinchee等，(1988)和Christou等，(1990)，或WO 00/42207的方法。
并且，除了核基因轉(zhuǎn)化的方法外，本發(fā)明也包括質(zhì)體基因組，優(yōu)選葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化。Kota等，(1999)描述了在煙草葉綠體中超表達(dá)Cry2Aa蛋白質(zhì)的方法。
可以在常規(guī)植物育種方案中使用得到的轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生更多具有相同特征的轉(zhuǎn)化植物或向相同或相關(guān)植物物種的其它品種中引入殺昆蟲有效的cry基因部分。從轉(zhuǎn)化植物得到的種子含有作為穩(wěn)定基因組插入物的殺昆蟲有效cry基因部分?？梢杂贸Ｒ?guī)方式培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生Cry毒素原的殺昆蟲有效部分，優(yōu)選Cry毒素，然后可以回收用于抗鱗翅目的常規(guī)殺昆蟲組合物(美國專利5,254,799)中。
可以在植物細(xì)胞基因組中插入殺昆蟲有效cry基因部分，優(yōu)選截短的cry基因，使插入的基因位于啟動(dòng)子下游(即，3′)并且受其控制，其中該啟動(dòng)子為可以指導(dǎo)該基因部分在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選通過在植物細(xì)胞基因組，特別在核或質(zhì)體(例如，葉綠體)基因組中插入cry嵌合基因來完成上述過程。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括CM 1841(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)分離物的花椰菜花葉病毒(CaMV)的強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子(＂35S啟動(dòng)子＂)；Odell等，(1985)所述的35S啟動(dòng)子，泛素家族的啟動(dòng)子(例如，Christensen等，1992的玉米泛素啟動(dòng)子，也參見Cornejo等，1993)，gos2啟動(dòng)子(de Pater等，1992)，emu啟動(dòng)子(Last等，1990)，擬南芥屬肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如An等(1996)所述的啟動(dòng)子，水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如Zhang等(1991)所述的啟動(dòng)子；木薯脈花葉病毒的啟動(dòng)子(WO 97/48819，Verdaguer等，(1998))，地下三葉草矮化病毒的pPLEX系列啟動(dòng)子(WO 96/06932，特別是S7啟動(dòng)子)，醇脫氫酶啟動(dòng)子例如pAdh1S(GenBank記錄號X04049，X00581)及分別驅(qū)動(dòng)T-DNA的1′和2′基因表達(dá)的TR1′啟動(dòng)子和TR2′啟動(dòng)子(分別是“TR1′啟動(dòng)子”和“TR2′啟動(dòng)子”)(Velten等，1984)。做為替代方案，可以利用非組成型的但是對植物的一個(gè)或多個(gè)組織或器官(例如，葉子和/或根)具有特異性的啟動(dòng)子，這樣插入的cry基因部分僅僅在特異組織或器官的細(xì)胞中表達(dá)。例如，通過將此殺昆蟲有效基因部分置于光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，殺昆蟲有效cry基因部分可以在植物(例如，玉米，棉花)的葉子中選擇性地表達(dá)，所述光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的例子是該植物自身或其它植物如豌豆的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因啟動(dòng)子，見美國專利5,254,799的公開。其它替代方案是利用可誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選通過傷口，如昆蟲咬食誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如，Cordera等(1994)所述的MPI啟動(dòng)子，或化學(xué)因子誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
可以在植物基因組中插入殺昆蟲有效的cry基因部分，使插入的基因部分位于適合的3′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(即，轉(zhuǎn)錄形成和聚腺苷酸化信號)的上游(即，5′)。優(yōu)選通過在植物細(xì)胞基因組中插入cry嵌合基因完成上述過程。優(yōu)選的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄形成信號包括胭脂堿合成酶基因(Depicker等，1982)，章魚堿合成酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的那樣，它們在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中充當(dāng)3′-非翻譯DNA序列。
可選地，殺昆蟲有效cry基因部分可以作為雜合基因插入到植物基因組中(美國專利5,254,799；Vaeck等，1987)并且與可選擇或評分的標(biāo)志基因，如編碼卡那霉素抗性的neo基因(EP 0 242 236)處于相同的啟動(dòng)子的控制下，這樣，植物將表達(dá)易檢測的融合蛋白質(zhì)。
也可以通過轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，在植物細(xì)胞培養(yǎng)中大量生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如生產(chǎn)Cry2A蛋白質(zhì)，然后，在適宜配制后，可以將其應(yīng)用在作物上。本文中提到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞時(shí)，指分離的或組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞(或也指植物原生質(zhì)體)，或包含在植物中或分化器官或組織中的植物細(xì)胞(或原生質(zhì)體)，且本文中這兩種可能性均明確地包括在內(nèi)。因此，在說明書或權(quán)利要求書中提到植物細(xì)胞不僅僅意指培養(yǎng)中分離的細(xì)胞，也指可能位于任何位置或可能存在于任何類型的植物組織或器官中的任何植物細(xì)胞。
也可以用編碼抗鱗翅目蛋白質(zhì)的所有或部分cry基因轉(zhuǎn)化其它細(xì)菌，如對鱗翅目或鞘翅目昆蟲有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌。由此，可以產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)化Bt株系，該株系可對鱗翅目和鞘翅目昆蟲害蟲產(chǎn)生廣譜抗性或可用于抗其它的鱗翅目昆蟲害蟲?？梢杂贸Ｒ?guī)方法，優(yōu)選用如Mahillon等，(1989)和PCT專利公布WO 90/06999中所述的常規(guī)電穿孔技術(shù)，用引入適當(dāng)克隆載體中的本發(fā)明cry基因的全部或部分轉(zhuǎn)化細(xì)菌，如假單胞菌屬，農(nóng)桿菌屬，芽孢桿菌屬或埃希氏屬細(xì)菌。
可以用常規(guī)方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)發(fā)酵含有本發(fā)明cry基因的轉(zhuǎn)化芽孢桿菌株系以提供高產(chǎn)量的細(xì)胞。在熟知的適當(dāng)條件下(Dulmage，1981)，這些株系每一個(gè)都可形成孢子從而高產(chǎn)量地生產(chǎn)含有Cry毒素原的晶體蛋白質(zhì)。
可以將cry基因所轉(zhuǎn)化的微生物、或優(yōu)選它們各自的Cry蛋白質(zhì)或Cry毒素原、毒素或殺昆蟲有效的毒素原部分作為活性組分，與適宜的載體、稀釋劑、乳化劑和/或分散劑(例如，如Bernhard和Utz，1993所述)一起通過常規(guī)方法制成本發(fā)明的殺昆蟲組合物，特別是抗鱗翅目組合物。該殺昆蟲組合物可以制成可濕性粉劑，小球，顆粒劑或粉劑，或具有含水或不含水溶劑的液體制劑，如泡沫，凝膠，混懸液，濃縮物等。
根據(jù)本發(fā)明，控制昆蟲，特別是鱗翅目的方法包括向要保護(hù)的場所(區(qū)域)施用(例如，噴霧)殺昆蟲量的Cry蛋白質(zhì)或本發(fā)明cry基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。要保護(hù)的場所可以包括，例如昆蟲害蟲的棲息地或植物生長或待生長的區(qū)域。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及控制鱗翅目大豆昆蟲害蟲，特別是鱗翅目二化螟，稻苞蟲，稻切根蟲，稻葉夜蛾，稻縱卷葉螟或美洲稻弄蝶的方法，優(yōu)選昆蟲選自二化螟(Chilo suppressalis)，Chilo partellus，一點(diǎn)螟(Scirpophagaincertulas)，稻蛀莖葉蛾(Sesamia inferens)，稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocismedinalis)，Marasmia patnalis，Marasmia exigua，Marasmia ruralis，Scirpophaga innotata，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所定義的Cry2A蛋白質(zhì)，優(yōu)選這里所定義的Cry2Ae蛋白質(zhì)(即，通過種植本發(fā)明cry2A基因轉(zhuǎn)化的水稻植物，或噴霧含有本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的組合物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)在抵抗鱗翅目水稻昆蟲害蟲以最小化水稻植物損失中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及控制鱗翅目棉花昆蟲害蟲的方法，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所定義的Cry2A蛋白質(zhì)，優(yōu)選這里所定義的Cry2Ae蛋白質(zhì)(即，通過種植本發(fā)明cry2A基因轉(zhuǎn)化的水稻植物，或噴霧含有本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的組合物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)在抵抗鱗翅目水稻昆蟲害蟲以最小化水稻植物損失中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及控制鱗翅目水稻昆蟲害蟲，特別是鱗翅目二化螟，稻苞蟲，稻切根蟲，稻葉夜蛾，稻縱縱卷葉螟或美洲弄蝶的方法，優(yōu)選昆蟲選自二化螟(Chilo suppressalis)，Chilo partellus，一點(diǎn)螟(Scirpophagaincertulas)，稻蛀莖葉蛾(Sesamia inferens)，稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocismedinalis)，Marasmia patnalis，Marasmia exigua，Marasmia ruralis，Scirpophaga innotata，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所定義的Cry2A蛋白質(zhì)，優(yōu)選這里所定義的Cry2Ae蛋白質(zhì)(即，通過種植本發(fā)明cry2A基因轉(zhuǎn)化的水稻植物，或噴霧含有本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)的組合物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)在抵抗鱗翅目水稻昆蟲害蟲以最小化水稻植物損失中的用途。
為了獲得Cry毒素原或毒素，可以通過常規(guī)方法在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達(dá)Cry蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞，然后用常規(guī)方法如酶降解或去污劑等將其裂解。然后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如層析法，提取，電泳或類似的技術(shù)分離和純化毒素原。然后，通過毒素原的胰蛋白酶消化可以得到毒素。
在權(quán)利要求書的表述中反映了構(gòu)成了本發(fā)明說明書部分的本發(fā)明的這些和/或其它實(shí)施方案。
下面的實(shí)施例示例了本發(fā)明，這些實(shí)施例對本發(fā)明或其尋求的保護(hù)范圍沒有提供限制。在實(shí)施例，權(quán)利要求書和說明書中提到的序列表如下序列表SEQ ID No.1-Cry2Ae蛋白質(zhì)和DNA的氨基酸序列和DNA序列；SEQ ID No.2-Cry2Ae蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID No.3-Cry2Af蛋白質(zhì)和DNA的氨基酸序列和DNA序列；SEQ ID No.4-Cry2Af蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID No.5-Cry2Ag蛋白質(zhì)和DNA的氨基酸序列和DNA序列；SEQ ID No.6-Cry2Ag蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID No.7-用于棉花中表達(dá)的人工cry2Ae DNA序列；SEQ ID No.8-SEQ ID No.7的DNA編碼的Cry2Ae蛋白質(zhì)的氨基酸序列；SEQ ID No.9-用于玉米中表達(dá)的人工cry2Ae DNA序列；除了在實(shí)施例中另外說明外，用Sambrook等，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)，和Ausubel等，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和卷2所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)生和操作重組DNA的所有的程序。由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications(UK)共同出版的R.R.D.Croy的Plant MolecularBiology Labfax(1993)描述了用于植物分子生物學(xué)工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法。在M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White編輯的“PCRprotocolsa guide to methods and applications”，(Academic Press，Inc.，1990)中可以發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)的程序。
實(shí)施例實(shí)施例1株系的表征從菲律賓(South Tagalog)和比利時(shí)(Deerlijk)收集的谷物粒(grain dust)中分別分離到BTS02761A和BTS01099E株系。
可以在常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，優(yōu)選T3培養(yǎng)基(胰蛋白胨3g/l，胰蛋白 2g/l，酵母提取物1.5g/l，5mg MnCl2，0.05M Na2HPO4.2H2O，0.05MNaH2PO4.H2O，pH6.8和1.5％瓊脂)上，優(yōu)選在28℃培養(yǎng)每個(gè)株系。為了長期貯藏，優(yōu)選將等體積的孢子晶體懸液和等體積的50％甘油混合并在-70℃貯藏，或凍干孢子晶體懸浮液。對于孢子形成，優(yōu)選在28℃，在T3培養(yǎng)基上生長72小時(shí)，隨后在4℃貯藏。在孢子形成期間株系產(chǎn)生的晶體蛋白質(zhì)包裹在晶體中。
實(shí)施例2BTS02761A和BTS01099E株系對選擇的鱗翅目昆蟲種的殺昆蟲活性將獲自BTS01099E或BTS02761A的孢子晶體混合物的未稀釋堿性(pH12)提取物鋪在人工飼料上，在飼喂該人工飼料的玉米穗蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴實(shí)夜蛾(Helicoverpa armigera)，煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和西非蛀莖夜蛾(Sesamia nonagrioides)的新生幼蟲上進(jìn)行毒性測定。
在Costar 48-孔板的孔中分配人工飼料(Vanderzant，1962)．飼料表面加上25微升提取物，在層流空氣中干燥。每個(gè)孔中放入一只幼蟲，每個(gè)樣品用18只幼蟲。在第7天計(jì)算死亡和活著的幼蟲。死亡幼蟲的百分?jǐn)?shù)如下表I所示。
在生物測定中檢測來自于株系BTS02761A和BTS01099E的孢子/晶體的混合物，得到如下結(jié)果
表I

*生長稍微受影響的存活幼蟲；陰性對照(標(biāo)準(zhǔn)飼料)Hz6％M，Hv17％M，Sf0％M。Hz玉米穗蟲(Helicoverpa zea)；Hv煙芽夜蛾(Heliothis virescens)；Sf草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；On玉米螟(Ostrinianubilalis)；Sn西非蛀莖夜蛾(Sesamia nonagroides)(NT表示沒有檢測)。
實(shí)施例3來自Bt株系BTS01099E和BTS02761A的新cry2A基因的鑒定和表征用適合的引物，擴(kuò)增BTS02761A和BTS01099E株系的cry2A基因的部分；隨后，用限制酶消化這些擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得消化樣式。對來自含有已知cry2A基因的株系的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行上述消化時(shí)，也獲得消化樣式，比較這兩種樣式。根據(jù)限制消化的樣式，株系BTS02761A和BTS01099E的cry2A基因看起來是新的。因此，測序擴(kuò)增產(chǎn)物。測序證實(shí)了擴(kuò)增的片段來源于新的cry2A基因株系BTS02761A含有一個(gè)新的cry2A-樣基因，而株系1099E含有兩個(gè)新的cry2A-樣基因。
用Sau3A處理株系BTS02761A和BTS01099E的總DNA，大小分級分離后將7到10kb片段連入pUC19I(pUC19的衍生物)中，pUC19I已用BamHI切割和TsAP(熱穩(wěn)定堿性磷酸酶)處理過。通過電穿孔將連接混合物導(dǎo)入大腸桿菌XL1 Blue中。
用DIG-標(biāo)記的PCR片段做探針進(jìn)行菌落雜交鑒定陽性克隆。在2000年10月6日將重組大腸桿菌株系保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，比利時(shí))(以下縮寫為“BCCM-LMBP”)，保藏號為BCCM-LMBP 4247，表示株系XL1Blue:pUC1099E/cry2clone1，該株系編碼名稱為Cry2Af的蛋白質(zhì)；及BCCM-LMBP 4248，表示株系XL1Blue:pUC1099E/cry2clone7，其編碼名稱為Cry2Ae的蛋白質(zhì)；和BCCM-LMBP 4249，表示株系XL1Blue:pUC2761A/cry2clone141，其編碼名稱為Cry2Ag的蛋白質(zhì)。通過NotI-FseI消化，從這些保藏的克隆中可以分離到這些基因。
將這些克隆的插入物亞克隆到穿梭載體pSL40I中。首先將由此得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌GM2163中。然后，將得自該株系的質(zhì)粒制備物電穿孔到晶體負(fù)型蘇云金芽孢桿菌種berliner 1715株系中。
然后，從得自重組Bt株系的孢子/晶體混合物制備堿性提取物，在生物測定中利用其來評估新的Cry2A蛋白質(zhì)的毒性。在如上述實(shí)施例1所述的測定中檢測該提取物。結(jié)果如表II所示表II

“Conc.”用Bradford方法測定的株系提取物的總蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)；“Ha”棉鈴實(shí)夜蛾(Heliothis armigera)，其它縮寫如上面表I所用；包括的對照(正常的飼料，添加PBS-BSA或未轉(zhuǎn)化的晶體負(fù)型Bt株系1715)沒有顯示顯著的死亡率。
當(dāng)在選定的鱗翅目昆蟲上檢測時(shí)，表達(dá)Cry2Af蛋白質(zhì)的重組克隆也顯示了顯著的死亡率。
此外，我們進(jìn)行了分析以確定重組產(chǎn)生的Cry2Ae蛋白質(zhì)的LC50和LC90值，并與已知的Cry2Aa和Cry2Ab蛋白質(zhì)相比較。
為了進(jìn)行這個(gè)檢測，在Costar 24孔板的孔中分配昆蟲特異的人工飼料。在飼料表面施用50微升源于XL1Blue:pUC1099Eclone7含有cry2Ae基因的重組Bt株系的孢子晶體混合物的堿性(pH12)提取物，層流空氣干燥。用于草地貪夜蛾和玉米螟(O.nubilalis)的飼料含有1000ml水；瓊脂20g；玉米面112g；麥胚28g；酵母30g；抗壞血酸4.8g；苯甲酸1.2g；對羥苯甲酸甲酯1g；金霉素0.06g；制霉菌素0.03g。煙芽夜蛾(H.virescens)和玉米穗蟲(H.zea)的飼料含有1000ml水；瓊脂20g；豆粉81g；麥胚36g；蔗糖14.7g；玉米油5ml；Wesson鹽混合物10g；Vanderzant維生素混合物9.5g；山梨酸1.1g；對羥苯甲酸甲酯1g；金霉素0.34g；制霉菌素0.06g。檢測不同的蛋白質(zhì)濃度以確定LC50值。對于在玉米穗蟲(H.zea)、煙芽夜蛾(H.virescens)和草地貪夜蛾(S.frugiperda)上的檢測，每孔中放入一只幼蟲，每個(gè)樣品用20只幼蟲。對于在玉米螟(O.nubilalis)上的檢測，每個(gè)孔中放入二只幼蟲，每個(gè)樣品用24只幼蟲。在第7天(對于S.frugiperda是第6天，對于玉米螟(O.nubilalis)是第5天)計(jì)算死亡和活的幼蟲。用概率單位分析(POLO程序，LeOra軟件，1987，POLO-PC.概率單位分析或邏輯分析用戶指南，Berkeley，California)計(jì)算LC50和LC90值。結(jié)果示于下表III。
表III

NT沒有檢測；Conc.在產(chǎn)生相關(guān)蛋白質(zhì)的Bt重組株系的堿性提取物中的總蛋白質(zhì)濃度，單位mg/ml；星號表示對于玉米螟(O.nubilalis)，用具有不同蛋白質(zhì)濃度(在列“Conc.”下面，括號之間顯示)的不同批提取物得到的結(jié)果；對照(正常飼料，加PBS-BSA或晶體負(fù)型對照Bt株系)產(chǎn)生不超過0-5％的死亡率。
對于用純化的Cry2Ae蛋白質(zhì)抗藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定與上述用于玉米螟(O.nubilalis)的相同(檢測20個(gè)孔，每個(gè)濃度檢測1只幼蟲)，發(fā)現(xiàn)了這種蛋白質(zhì)對這種重要大豆昆蟲害蟲有高的活性。發(fā)現(xiàn)純化的Cry2Ae蛋白質(zhì)對這種昆蟲的LC50值是0.44ng/cm2(95％的置信水平；該LC50值是不同生物批純化蛋白質(zhì)的2次測定的平均值)，發(fā)現(xiàn)LC90值是7.79ng/cm2(95％的置信水平；該LC90值是不同生物批純化蛋白質(zhì)的2次測定的平均值)。用與上述玉米螟(O.nubilalis)相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)定和純化的Cry2Ae蛋白質(zhì)，證實(shí)了該蛋白質(zhì)對玉米穗蟲(HelicoverpaZea)和玉米螟(Ostrinia Nubilalis)有顯著的毒性(發(fā)現(xiàn)對于這些昆蟲LC50值分別是145.1和48.31ng/cm2(95％的置信水平；這些LC50值是分別在每種昆蟲上不同生物批純化蛋白質(zhì)的2次測定的平均值))。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的新Cry蛋白質(zhì)，特別是Cry2Ae蛋白質(zhì)是對相關(guān)鱗翅目昆蟲害蟲，尤其是Heliothis zea、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、黎豆夜蛾和玉米穗蟲(Helicoverpa zea)具有高活性的有用蛋白質(zhì)，而這些昆蟲害蟲是造成植物，如大豆，棉花和玉米的商業(yè)損失的昆蟲害蟲。
在所附序列表中顯示了本發(fā)明分離的cry2A基因的測定的序列，及測定的氨基酸序列。用GCG的Wisconsin包中GAP程序進(jìn)行的成對對齊表明了與其它Cry2A序列(對于已知Cry2A蛋白質(zhì)和DNA的序列，參見Crickmore等，(1998)和上述網(wǎng)站)的序列同一性水平，見表IVA和IVB中所示(在GAP程序中用GCG缺省值；對于氨基酸序列比較，用blosum62記分矩陣，對于DNA序列比較，用nwsgapdna記分矩陣)。
表IVA.蛋白質(zhì)水平上的序列同一性百分?jǐn)?shù)

表IV.B.DNA水平上的序列同一性百分?jǐn)?shù)

實(shí)施例4在轉(zhuǎn)化植物中新的Cry蛋白質(zhì)的產(chǎn)生用熟知的程序，用啟動(dòng)子如CaMV 35S(Hul和Howell，1987)和泛素(Christensen等，1992)啟動(dòng)子，產(chǎn)生各編碼Cry2Ae，Cry2Af和Cry2Ag蛋白質(zhì)的嵌合基因。優(yōu)選地，如公布的PCT專利申請WO 94/12264所述，使開放可讀框的密碼子使用適應(yīng)宿主植物的密碼子使用，以優(yōu)化表達(dá)效率。而且，在一些嵌合基團(tuán)中包括了編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列(如說明書中所述)以引導(dǎo)本發(fā)明Cry2A蛋白質(zhì)達(dá)到植物葉綠體。
為了用編碼Cry2Ae蛋白質(zhì)的嵌合基因轉(zhuǎn)化玉米和棉花，將幾個(gè)嵌合基因構(gòu)建體插入農(nóng)桿菌株系質(zhì)粒中。這些構(gòu)建體包括構(gòu)建體pACS9和pACS11，其中SEQ ID No.7的cry2Ae編碼序列功能性地與花椰菜花葉病毒35S2啟動(dòng)子(Odell等，1985)、矮牽牛葉綠體a/b結(jié)合蛋白質(zhì)基因的前導(dǎo)序列(Harpster等，1988)及花椰菜花葉病毒35S基因的3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化區(qū)(Sanfacon等，1991)連接；和構(gòu)建體pACS12和pACS13，它們除了在cry2Ae編碼區(qū)的5’末端插入了編碼允許靶向葉綠體的TpssuAt轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列(Krebbers等，1988)外，具有相同的調(diào)節(jié)區(qū)和相同的cry2Ae編碼區(qū)，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合蛋白質(zhì)。這些構(gòu)建體也包括在木薯脈花葉病毒CsVMV啟動(dòng)子(Verdaguer等，1996，1998)和胭脂堿合成酶基因的3′轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化區(qū)(Depicker等，1982)控制下的作為選擇標(biāo)志的編碼草甘膦除草劑抗性蛋白質(zhì)的DNA序列(在公布的PCT專利申請WO97/04103中描述的，與優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(美國專利5,635,618)連接)或編碼草銨膦除草劑抗性蛋白質(zhì)的DNA序列(Thompson等，1987)。
如并入為參考文獻(xiàn)的美國專利6,140,553所述，通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用pACS9，pACS11，pACS12和pACS13構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞。用這里并入為參考文獻(xiàn)的PCT專利公布WO 00/71733中所述的轉(zhuǎn)化方法，用pACS9，pACS11，pACS12和pACS13構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞。用公布的PCT專利申請WO 92/09696中所述的方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞?；旧先鏓P專利0 116 718或Deblaere等(1987)所述用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，用pACS11和pACS12構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。
在含有選擇性試劑膦絲菌素或草甘磷的培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)化細(xì)胞和由此再生的小植物，這樣，即使不是所有再生植物，也是大多數(shù)再生植物將是轉(zhuǎn)化的。
通過Cry2A ELISA，Northern和Southern印跡及根據(jù)殺昆蟲效力和農(nóng)學(xué)特征篩選再生轉(zhuǎn)化的煙草、玉米、棉花和水稻植物。與非轉(zhuǎn)化對照植物比較，含有嵌合cry2A基因的子代植物顯示了對昆蟲改進(jìn)的抗性，其中昆蟲抗性和轉(zhuǎn)化表型有適當(dāng)?shù)姆蛛x。蛋白質(zhì)和RNA檢測表明具有增加的昆蟲抗性的植物在它們的細(xì)胞中有較高的新Cry2A蛋白質(zhì)的表達(dá)。
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gttcgtgcca actaacctcc cacccatcta ctgagctagc 1910
權(quán)利要求
1.編碼殺昆蟲Cry2Ae蛋白質(zhì)的核酸序列，其中，所述殺昆蟲Cry2Ae蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4248的cry2Ae基因編碼的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，b)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，c)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)中氨基酸位置1到氨基酸位置625的氨基酸序列，和d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP 4248的cry2Ae編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述DNA與SEQ ID No.1的編碼序列有至少93％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
2.編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，其中，所述蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4247的cry2Af基因編碼的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，b)SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲片段的氨基酸序列，c)SEQ ID No.4中氨基酸位置1到氨基酸位置625的氨基酸序列，和d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP 4247的cry2Af編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述DNA與SEQ ID No.3的編碼序列有至少95％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
3.編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，其中，所述蛋白質(zhì)包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4249的cry2Ag基因編碼的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，b)SEQ ID No.6的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲片段的氨基酸序列，c)SEQ ID No.6的蛋白質(zhì)中氨基酸位置1到氨基酸位置620的氨基酸序列，和d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP 4249的cry2Ag編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述DNA與SEQ ID No.5的編碼序列有至少95％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述核酸序列是DNA。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其包含與天然存在的DNA序列相比，有不同密碼子使用但是編碼相同蛋白質(zhì)或其殺昆蟲片段的人工DNA序列。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸序列，其是SEQ ID No.7或9的DNA序列。
7.蛋白質(zhì)，其包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4248的cry2Ae基因編碼的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，b)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，c)包含SEQ ID No.2中氨基酸位置1到氨基酸位置625的氨基酸的氨基酸序列，或d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP4248的cry2Ae編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中所述殺昆蟲蛋白質(zhì)與SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)有至少92％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
8.蛋白質(zhì)，其包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4247的cry2Af基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，b)SEQID No.4的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，c)包含SEQ ID No.4中氨基酸位置1到氨基酸位置625的氨基酸的氨基酸序列，或d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP 4247的cry2Af編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)有至少95％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
9.蛋白質(zhì)，其包含選自下面的氨基酸序列a)保藏在BCCM-LMBP、保藏號為LMBP 4249的cry2Ag基因編碼的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，b)SEQ ID No.6的蛋白質(zhì)或其殺昆蟲部分的氨基酸序列，c)SEQ IDNo.6的蛋白質(zhì)中氨基酸位置1到氨基酸位置620的氨基酸序列，或d)在嚴(yán)格雜交條件下可以與保藏在BCCM-LMBP保藏號為LMBP 4249的cry2Ag編碼序列雜交的DNA所編碼的殺昆蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID No.6的蛋白質(zhì)有至少95％，尤其是至少98％，優(yōu)選至少99％的序列同一性。
10.包含權(quán)利要求4的核酸序列的嵌合基因，其受植物可表達(dá)的啟動(dòng)子的控制。
11.包含權(quán)利要求5或6的核酸序列的嵌合基因，其受植物可表達(dá)的啟動(dòng)子的控制。
12.權(quán)利要求10的嵌合基因，其進(jìn)一步包含編碼用于靶向液泡、線粒體、葉綠體、質(zhì)體或用于分泌的導(dǎo)向肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。
13.權(quán)利要求11的嵌合基因，其進(jìn)一步包含編碼用于靶向液泡、線粒體、葉綠體、質(zhì)體或用于分泌的導(dǎo)向肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。
14.植物細(xì)胞、植物或種子，其通過轉(zhuǎn)化而包含有權(quán)利要求10或12的嵌合基因。
15.植物細(xì)胞、植物或種子，其通過轉(zhuǎn)化而包含有權(quán)利要求11或13的嵌合基因。
16.如權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞、植物或種子，其選自玉米、棉花、水稻、煙草、油籽油菜、蕓苔屬種、茄子、大豆、馬鈴薯、向日葵、番茄、甘蔗、茶、豆、煙草、草莓、苜蓿、黃瓜、西瓜、胡椒、燕麥、大麥、小麥、大麗花、唐菖蒲、菊花、甜菜、高梁、紫花苜蓿和花生。
17.如權(quán)利要求15所述的植物細(xì)胞、植物或種子，其選自玉米、棉花、水稻、煙草、油籽油菜、蕓苔屬種、茄子、大豆、馬鈴薯、向日葵、番茄、甘蔗、茶、豆、煙草、草莓、苜蓿、黃瓜、西瓜、胡椒、燕麥、大麥、小麥、大麗花、唐菖蒲、菊花、甜菜、高梁、紫花苜蓿和花生的植物細(xì)胞、植物或種子。
18.微生物，其通過轉(zhuǎn)化而包含有權(quán)利要求1至6之任一項(xiàng)的核酸序列。
19.使植物抗昆蟲的方法，其包括用權(quán)利要求10或11的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及從抗昆蟲的該細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
20.使植物抗昆蟲的方法，其包括用權(quán)利要求12或13的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及從抗昆蟲的該細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述的昆蟲選自煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，玉米穗蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴實(shí)夜蛾(Helicoverpa armigera)，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)和玉米螟(Ostrinia nubilalis)，二化螟(Chilo suppressalis)，Chilo partellus，一點(diǎn)螟(Scirpophaga incertulas)，稻蛀莖夜蛾(Sesamia inferens)，稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocis medinalis)，Marasmia patnalis，Marasmiaexigua，Marasmia ruralis和Scirpophaga innotata。
22.權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在昆蟲控制中的用途，所述昆蟲選自煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，玉米穗蟲(Helicoverpa zea)，棉鈴實(shí)夜蛾(Helicoverpa armigera)，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)和玉米螟(Ostrinia nubilalis)，二化螟(Chilo suppressalis)，Chilo partellus，一點(diǎn)螟(Scirpophaga incertulas)，稻蛀莖夜蛾(Sesamia inferens)，稻縱卷葉野螟(Cnaphalocrocis medinalis)，Marasmia patnalis，Marasmiaexigua，Marasmia ruralis和Scirpophaga innotata。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于蘇云金芽孢桿菌株系的殺昆蟲化合物。提供了命名為Cry2Ae，Cry2Af，和Cry2Ag的蛋白質(zhì)和其變異體，及編碼這些蛋白質(zhì)或其變異體的DNA序列。還提供了表達(dá)這些蛋白質(zhì)的重組宿主，特別是植物細(xì)胞和植物。
文檔編號C12N15/32GK1484702SQ02803567
公開日2004年3月24日 申請日期2002年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月9日
發(fā)明者G·阿爾諾, A·伯茨, S·瓦納斯特, J·范里, S·范霍德特, G 阿爾諾, 傷固, 艫綠 申請人:拜爾生物科學(xué)公司