T(5g/L)， 37°C放置4h，然后每孔加入150iilDMSO,振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光光度值（OD值，490nm)，WOD值代表細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，繪制生長(zhǎng)曲線。圖6是預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞增殖 的影響，由圖6可知預(yù)處理可W明顯促進(jìn)MSCs的增殖，表現(xiàn)為隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其增殖能力 成對(duì)數(shù)上升。
[0069] (3)、預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響 陽(yáng)070] 選取P3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X105/mレ接種于T25培養(yǎng)瓶中，37°C，5%體積 濃度的C02條件下解育2地。預(yù)處理組在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中添加咪挫哇嘟（Imiquimod)R848 (1-5yg/mL)和重組人干擾素IFN-a-2b(100-200U/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后收集 細(xì)胞，離屯、去上清，70 %乙醇固定后，加入500y1含50yg/mL艦化丙晚（PI)，100yg/mL RNaseA,避光解育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。表1是預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響。 陽(yáng)〇7U 由表1可見(jiàn)，預(yù)處理后的MSCs在S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，說(shuō)明預(yù)處理促進(jìn)更 多的MSCs進(jìn)入S和G2/M期，即DNA合成、分裂期，從而產(chǎn)生大量的增殖細(xì)胞。
[0072] 表1預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞周期的影響
[0073]
[0074] (4)、預(yù)處理對(duì)MSCs抵抗NK細(xì)胞殺傷作用的影響
[00巧]選取P3代細(xì)胞，預(yù)處理組在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中添加咪挫哇嘟（Imiquimod)R848 (1-5yg/mL)和重組人干擾素IFN-a-2b(100-200U/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。純化的外 周血來(lái)源的NK細(xì)胞在體外培養(yǎng)4她，應(yīng)用IL-2使其達(dá)到活化狀態(tài)。收集未處理和處理的 MSCs,用PBS充分洗涂二次。按照效祀比30:1 (NK/MSCs)混合兩種細(xì)胞，采用CCK8試劑盒 進(jìn)行細(xì)胞殺傷的檢測(cè)。圖7顯示了預(yù)處理對(duì)MSCs抵抗NK細(xì)胞殺傷作用的影響。由圖7可 知，預(yù)處理后的MSCs增強(qiáng)了抵抗NK細(xì)胞殺傷作用的能力，表現(xiàn)為較低的死亡率，從而保證 在機(jī)體內(nèi)較長(zhǎng)的存留時(shí)間。
[0076] 立、間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)處理對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響
[0077] 巧）、預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞因子分泌的影響 陽(yáng)07引選取P3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2XIO5/血，接種于6孔板上，37°C，5%體積濃 度的C02條件下解育2地，預(yù)處理組在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中添加咪挫哇嘟（Imiquimod) R848 (1-5yg/mL)和重組人干擾素IFN-a-2b(100-200U/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。收集培養(yǎng) 上清液，離屯、后應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析的方法巧LISA試劑盒）檢測(cè)細(xì)胞因子VEGF，HGF和PGE-2 的表達(dá)。圖8是預(yù)處理對(duì)MSCs細(xì)胞因子分泌的影響，由圖8的化ISA檢測(cè)結(jié)果顯示，和未 處理的MSCs相比，預(yù)處理能夠有效地促進(jìn)MSCs分泌促進(jìn)血管新生和組織再生的細(xì)胞因子， W及降低炎癥反應(yīng)的抑制性細(xì)胞因子。
[0079] 化）、預(yù)處理對(duì)MSCs抑制淋己細(xì)胞增殖能力的影響
[0080] 選取P3代細(xì)胞，預(yù)處理組在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中添加咪挫哇嘟（Imiquimod) R848(l-5iig/mL)和重組人干擾素IFN-a-2b(100-200U/mL)，收集細(xì)胞后洗涂計(jì)數(shù)，W IXIO4個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，解育30min后加入分離的T細(xì)胞（MSCs:T細(xì)胞比為 1:100)，建立混合淋己細(xì)胞培養(yǎng)體系（MLC)，加入20yg/血的PHA。將細(xì)胞置于37°C，5 % C02條件下解育6天。應(yīng)用化加方法測(cè)定淋己細(xì)胞增殖情況。圖9是預(yù)處理對(duì)MSCs抑制 淋己細(xì)胞增殖能力的影響。圖9中可明顯觀察到，預(yù)處理后的MSCs具有更強(qiáng)的抑制淋己細(xì) 胞增殖的能力，表現(xiàn)為在MLC中，淋己細(xì)胞增殖明顯受到抑制。
[0081] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可W對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征在于，包括以下幾個(gè) 步驟： 一、 臍帶采集和間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) (1) 、取正常足月產(chǎn)健康新生兒臍帶10~15cm，立即放入加有10~20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雙 抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中； (2) 、超凈臺(tái)內(nèi)取出臍帶，用75%酒精消毒臍帶表面，用生理鹽水充分洗滌殘留的血液； 將臍帶剪成1~2cm小段，再次漂洗；剖開(kāi)臍帶，提出臍靜脈和臍動(dòng)脈，將剩余的華通氏膠臍 帶組織剪成1~2mm 3大小，接種于T75培養(yǎng)瓶底部，間隔0. 5~I. 0cm，將培養(yǎng)瓶置于37°C、 5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中孵育； (3) 、第二天添加無(wú)血清完全培養(yǎng)基，以后隔天觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合度 時(shí)，將細(xì)胞消化傳代；此為PO代細(xì)胞； (4) 、細(xì)胞傳代 應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 25%的胰蛋白酶消化融合度為80~90%的PO代細(xì)胞5~lOmin， 待細(xì)胞和殘余組織塊懸浮后，加入2倍體積的無(wú)血清培養(yǎng)基中和；以100 ym的濾器過(guò)濾細(xì) 胞，收集濾液，以1500rpm/min離心10min，棄去上清；用無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整 密度為1~5X 105/mL，接種在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；此為Pl代細(xì)胞； (5) 、待Pl代細(xì)胞到達(dá)80-90%融合度時(shí)，應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶消化5~ 10min，待細(xì)胞懸浮后，加入2倍體積的無(wú)血清培養(yǎng)基中和；以1500rpm/min離心10min，棄 去上清；用無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1~5 X IO5AiL,接種在T75培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)；此為P2代細(xì)胞；按照此種方法，將MSCs連續(xù)傳代； (6) 選取P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀免疫表型的檢測(cè)和鑒定； 二、 MSCs的預(yù)處理 選取P3代細(xì)胞，在無(wú)血清完全培養(yǎng)基中添加咪唑喹啉R848 1~5 y g/mL和重組人干 擾素IFN- a -2b 100~200U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)；處理后進(jìn)行繼續(xù)傳代或者用作治 療。2. 如權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征 在于，所述步驟一的（1)中的臍帶需要在在8-12h內(nèi)處理完畢。3. 如權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征 在于，所述步驟一的步驟（2)中的無(wú)血清培養(yǎng)基中含有10-20 yg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子。4. 如權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征 在于，所述步驟一的步驟（2)中收集過(guò)濾后殘余的組織塊，移入新的培養(yǎng)皿，間隔1-5_種 植，待其貼壁后加入無(wú)血清完全培養(yǎng)基；待觀察到有細(xì)胞從組織塊游出后，換液；待細(xì)胞達(dá) 到一定密度后傳代；二次接種法培養(yǎng)。5. 如權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征 在于，所述步驟二中先將P3代細(xì)胞的細(xì)胞的濃度調(diào)整為2 X IO5AiL~1-2 X 104/mL。6. 如權(quán)利要求1所述的一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，其特征 在于，所述的無(wú)血清完全培養(yǎng)基含有病原滅活的血小板裂解液PL。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級(jí)別細(xì)胞制備方法，適用于骨髓、脂肪、臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明采用無(wú)血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行臍帶組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)用二次接種的方法對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了原代細(xì)胞的獲得率；同時(shí)本發(fā)明應(yīng)用咪唑喹啉R848？1～5μg/mL和重組人干擾素IFN-α-2b？100～200U/mL作為預(yù)處理因子，明顯地誘導(dǎo)了MSCs高表達(dá)和分泌細(xì)胞因子VEGF，HGF和PGE-2，使其更好地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)組織再生的能力，可明顯地提高M(jìn)SCs的增殖能力和抵抗NK細(xì)胞殺傷的能力，同時(shí)預(yù)處理后的MSCs具有增強(qiáng)的抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力，更好地應(yīng)用于以T細(xì)胞為主的GVHD和其他自身免疫性疾病的治療。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開(kāi)號(hào)】CN105154395
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510627671
【發(fā)明人】叢秀麗
【申請(qǐng)人】叢秀麗
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月28日