一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級別細(xì)胞制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及干細(xì)胞的應(yīng)用領(lǐng)域，具體為一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級別 細(xì)胞制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenehymalstemcell,MSC)是來源于早期中胚 層的具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下，可分化為造 血細(xì)胞W外的多種組織細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞 和星形膠質(zhì)細(xì)胞等。近年研究表明，MSC除支持體外造血、促進(jìn)體內(nèi)造血重建外，還具有抑 制同種異體免疫反應(yīng)，降低移植物抗宿主?。℅V皿）的作用。
[0003] 人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞化UCMSC):人廝帶連接于母體和胎兒之間，妊娠期間為 胎兒提供營養(yǎng)，由=部分構(gòu)成：羊膜被覆上皮、廝血管和位于兩者之間被稱為華通氏膠 (Wharton'SJelly)的黏液結(jié)締組織。華通氏膠對廝血管起支撐和保護(hù)作用華通氏膠中存 在著一種成纖維樣細(xì)胞，該細(xì)胞具有自我更新、增殖和多向分化潛能，被稱為人廝帶間充質(zhì) 于細(xì)胞化UCMSC)。
[0004] Toll樣受體（TLRs):在機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫中作為重要的調(diào)節(jié)器對 病原體的識別發(fā)揮著非常重要的作用。化Rs作為一類病原模式識別受體，TLRs信號失調(diào)會 引起多種疾病。TLRs存在于多數(shù)骨髓細(xì)胞（如巨隧細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、中性細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì) 胞）及非骨髓細(xì)胞（如上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞）中，迄今為止已發(fā)現(xiàn)有10種人化Rs(TLRl~ 10)。 陽〇化]混合淋己細(xì)胞培養(yǎng)（MLC):常用于器官移植前的組織配型，W測定受體和供體主 要組織相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋己細(xì)胞接受同種異型抗原的刺 激而發(fā)生活化、增殖，產(chǎn)生種類眾多的細(xì)胞因子，促進(jìn)NK、LAK和CTL等殺傷細(xì)胞的分化，因 此又是免疫調(diào)節(jié)研究中常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>[0006] 免疫調(diào)節(jié)：是指免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞和免疫分子之間，W及與其它系統(tǒng)如神經(jīng) 內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的相互作用，使得免疫應(yīng)答W最恰當(dāng)?shù)男问骄S持在最適當(dāng)?shù)乃?。免疫調(diào) 節(jié)配合好可W識別和清除抗原，對自身成分產(chǎn)生免疫耐受，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。配合差會導(dǎo) 致病原微生物感染、腫瘤、自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反應(yīng)。
[0007] 干細(xì)胞是一群具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，根據(jù)發(fā)育狀態(tài)可W分為胚胎干細(xì) 胞和成體干細(xì)胞。其中間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是一類具有高度自 我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在體外可W分化誘導(dǎo)為骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織細(xì) 胞，具有向受損組織歸巢并且修復(fù)、重建受損或病變組織器官的特點(diǎn)。此外，MSCs還具備免 疫原性低、移植成活率高、細(xì)胞治療效果好等特點(diǎn)，因此成為當(dāng)前干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。
[0008] 根據(jù)國際細(xì)胞療法間充質(zhì)與組織干細(xì)胞委員會制定的最低標(biāo)準(zhǔn)，MSCs需滿足W下條件：1)15〔3在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈貼壁生長；2)15〔3表達(dá)〔0105，〔073和〔090，不表達(dá) CD45,CD34,CD14或CDllb,CD79a或CD19和HLA-DR;3)MSCs在體外至少能向成骨細(xì)胞、月旨 肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。
[0009]目前臨床應(yīng)用MSCs的主要來源為骨髓、廝帶血，但成人骨髓中MSCs數(shù)量較少，病 毒感染率高，免疫原性強(qiáng)，且取材較復(fù)雜，限制其應(yīng)用。近年研究顯示，人廝帶中存在大量的 MSCs,與其他來源相比，廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞化UCMSC)更加易于獲得，對母子均無損傷，且凍 存和復(fù)蘇后細(xì)胞的生物學(xué)性狀無明顯變化，使其成為細(xì)胞治療中的理想細(xì)胞而逐漸替代骨 髓來源MSCs。
[0010] MSCs除具有支持體外造血、促進(jìn)體內(nèi)造血重建、組織損傷修復(fù)外，還具有獨(dú)特的免 疫調(diào)節(jié)作用，而其調(diào)節(jié)作用又WT細(xì)胞為主，在混合淋己細(xì)胞反應(yīng)中，通過周期阻滯抑制T 細(xì)胞增殖，但不引起T細(xì)胞調(diào)亡增加、活化受抑。同時MSCs還能降低反應(yīng)體系中的CD8T細(xì) 胞和Thl細(xì)胞，由Thl極化狀態(tài)向化2漂移，升高化2細(xì)胞，其分泌的IL-4,比-10等細(xì)胞因 子含量明顯增加，從而抑制炎癥反應(yīng)，在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中發(fā)揮治療作用。 W11] 實(shí)驗(yàn)表明，MSCs在體外可抑制T細(xì)胞分泌IFN-丫，促進(jìn)IL-IO的分泌，Treg細(xì)胞 比例增加；NK細(xì)胞IFN-丫分泌減少。運(yùn)一切表明，MSC存在于炎癥環(huán)境中，通過改變DC1、 DC2、Thl、Th2或化eg等分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，最終使炎癥環(huán)境向抗炎性環(huán)境轉(zhuǎn)變。
[0012] 免疫抑制劑在器官移植和自身免疫性疾病的臨床治療中起著舉足輕重的作用。但 是，免疫抑制劑的副作用嚴(yán)重，包括免疫抑制引起的感染、腫瘤發(fā)生率增加等。MSCs的免疫 調(diào)節(jié)及免疫逃避等功能，被廣泛地用來治療由于器官移植造成的移植物抗宿主病（GV皿） 和自身免疫性疾病。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病初期，經(jīng)靜脈輸注MSCs可誘導(dǎo)外周 淋己器官對T細(xì)胞耐受而改善病情。用II型膠原免疫接種小鼠的同時，經(jīng)腹腔內(nèi)注入同種 異體MSCs能有效避免小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)骨與軟骨的破壞；在造模成功小鼠已經(jīng)出現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎癥狀之后，再輸注MSCs同樣能阻止關(guān)節(jié)的嚴(yán)重破壞。此外，向多發(fā)性硬化患者體內(nèi)輸注 WJCMSC，可控制病情。
[0013] 運(yùn)些研究說明，WJCMSC在體內(nèi)、外對T淋己細(xì)胞具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，兼有免疫抑制能 力及誘導(dǎo)免疫耐受的特性，MSCs有可能作為治療GV皿和自身免疫性疾病的新方法。因此， 尋找一種能有效增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級別細(xì)胞制備的方法，是更好地發(fā)揮MSCs 療效的關(guān)鍵。
[0014] 現(xiàn)有技術(shù)中MSCs的制備方法為：
[0015] (1)、將采集的廝帶消毒后，用PBS洗去殘留的血液，分離并去除血管組織，剪碎廝 帶組織至l-3mm3大小，放入T75培養(yǎng)瓶底部，間隔0. 5-1. 0cm。將培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中解育，于第二天添加完全培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清（FB巧的低糖DMEM培養(yǎng)基，W 后隔天觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合度時，將細(xì)胞消化傳代。此為PO代細(xì)胞；
[0016] 似、細(xì)胞傳代
[0017] 應(yīng)用0.25%膜蛋白酶消化5-lOmin，待細(xì)胞和殘余組織塊懸浮后，用2倍體積的完 全培養(yǎng)基終止消化。W1500巧m/min離屯、lOmin，棄去上清。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整 密度為1~5Xl〇5/mU接種在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。此為Pl代細(xì)胞。
[0018] (3)、待Pl代細(xì)胞到達(dá)80-90%融合度時，按照上述方法進(jìn)行消化傳代，命名為P2 代細(xì)胞，W此類推。
[0019] (4)、選取P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀免疫表型的檢測和鑒定。
[0020] 巧）、選取P4或者P5代細(xì)胞進(jìn)行治療。
[0021] 現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)：
[0022] 現(xiàn)有技術(shù)使用含有胎牛血清的培養(yǎng)基，人體可能會產(chǎn)生針對異種蛋白的過敏反 應(yīng)；應(yīng)用組織塊培養(yǎng)方法，在進(jìn)行第一次消化傳代時，殘余的組織塊被廢棄，損失了大量的 間充質(zhì)細(xì)胞，造成產(chǎn)量的降低；通過現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)生的MSCs,雖然具有一定免疫調(diào)節(jié)能力， 但是調(diào)節(jié)能力受限，需要大量輸注才能滿足臨床治療的需要。而大量外源性異體細(xì)胞的輸 注會造成明顯的生物制品輸注反應(yīng)，因此細(xì)胞輸注數(shù)量受限，降低MSCs的免疫調(diào)節(jié)療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中使用含有胎牛血清的培養(yǎng)基，應(yīng)用組 織塊培養(yǎng)的方法造成產(chǎn)量低、免疫調(diào)節(jié)能力有限的缺陷，提供一種增強(qiáng)MSC免疫調(diào)節(jié)功能 的臨床級別細(xì)胞制備方法。
[0024] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[00巧]一種增強(qiáng)MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的臨床級別細(xì)胞制備方法，包括W下幾個步驟： [00%] -、廝帶采集和間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
[0027] (1)、取正常足月產(chǎn)健康新生兒廝帶10~15cm，立即放入加有10~20%質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中；廝帶需要在在8-12h內(nèi)處理完畢；
[0028] (2)、超凈臺內(nèi)取出廝帶，用75%酒精消毒廝帶表面，用生理鹽水充分洗涂殘留的 血液；將廝帶剪成1~2cm小段，再次漂洗；剖開廝帶，提出廝靜脈和廝動脈，將剩余的華通 氏膠廝帶組織剪成1~2mm3大小，接種于T75培養(yǎng)瓶底部，間隔0. 5~1.Ocm,將培養(yǎng)瓶置 于37°C、5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中