用于間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的組合物和治療方法
【專利說明】用于間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的組合物和治療方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求提交于2012年3月30日的第一署名發(fā)明人/申請人姓名為Songtao Shi的題為"用于間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的組合物和治療方法"的美國臨時專利申請 第61/618636號的權(quán)益，通過援引將其全部內(nèi)容整體并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研宄或開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明根據(jù)R01DE017449、R01DE019932和R01DE019413號合約在國家牙科和顱面 科研宄所（National Institute of Dental and Craniofacial Research)、國家衛(wèi)生研宄 院（National Institutes of Health)和衛(wèi)生與公眾服務(wù)部（Department of Health and Human Services)的政府資助下完成的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及用于間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的組合物和治療方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 包括骨髓在內(nèi)的各種組織含有用于非造血細(xì)胞的干樣前體，例如，成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞（Owen等，1988, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium 136,Chichester, UK, 42-60 頁； Caplan, 1991，J. Orthop. Res 9:641-650 ;Prockop, 1997, Science 276:71-74)。這些各種 組織的非造血性前體細(xì)胞稱作間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)。在體內(nèi)，MSC多種多樣且是表達(dá)各種 不同的蛋白和表面抗原的組的子群。MSC通過抑制數(shù)種主要免疫細(xì)胞如樹突細(xì)胞、T淋巴 細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞以及自然殺傷（NK)細(xì)胞的增殖和功能而展現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)（Nauta 和 Fibbe, 2007 ;Uccelli 等，2007, 2008 ;Aggarwal 和 Pittenger, 2005)。這些性質(zhì)促使研 宄人員去研宄MSC減輕各種各樣的免疫病癥的機(jī)理（Nauta和Fibbe, 2007 ;Bernardo等， 2009)。事實(shí)上，基于MSC的療法已成功應(yīng)用于各種人類疾病，包括移植物抗宿主病（GvHD)、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性腦脊髓炎、炎性腸疾病和 多發(fā)性硬化（Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Le Blanc 等，2004 ;Chen 等，2006 ;Polchert 等，2008 ;Sun 等，2009 ;Lee 等，2006 ;Augello 等，2007 ;Parekkadan 等，2008 ;Zappia 等， 2005 ;Gonzalez等，2009 ;Liang等，2009)。MSC的免疫抑制性質(zhì)與細(xì)胞因子諸如白細(xì)胞介 素10 (IL10)、一氧化氮（NO)、吲哚胺2, 3-二氧合酶（IDO)、前列腺素（PG) E2和TSG-6的 生成相關(guān)（Batten 等，2006 ;Zhang 等，2010 ;Ren 等，2008, Sato 等，2007 ;Meisel 等，2004 ; Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Choi 等，2011 ;Roddy 等，2011 ;Nemeth 等，2009)。另外，MSC 誘導(dǎo)的免疫耐受性涉及到⑶4+CD25+F〇Xp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)的上調(diào)以及促炎性T輔助 17(Thl7)細(xì)胞的下調(diào)（Sun 等，2009;Gonzalez 等，2009;Park 等，2011)。然而，基于 MSC 的 免疫療法的詳細(xì)機(jī)理尚未得到完全理解。在本研宄中，發(fā)明人顯示了 MSC誘導(dǎo)的通過Fas 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡是對于小鼠中的SS和實(shí)驗性結(jié)腸炎的MSC介導(dǎo)的治療性效果所需 的。
[0007] 基于MSC的免疫療法已被廣泛用于臨床前動物模型和臨床中以試圖治愈多種 免疫相關(guān)疾?。↘ikuiri 等，2010 ;Schurgers 等，2010 ;Park 等，2011 ;Liang 等，2010 和 2011 ;Wang等，2011 ;Zhou等，2008)。已經(jīng)報道了許多有助于基于MSC的免疫療法的因素 (Augello 等，2005 ;Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Selmani 等，2008 ;Nasef 等，2008 ;Ren 等，2010 ;Choi等，2011 ;Roddy等，2011)。然而，決定基于MSC的免疫療法的效力的詳細(xì)機(jī) 理尚未得到充分理解。據(jù)提出，MSC對T細(xì)胞增殖的抑制效果是由于對T細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)， 這與色氨酸被吲哚胺2, 3-二氧合酶轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸有關(guān)（Plumas等，2005)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)、優(yōu)選源自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC)的系統(tǒng)性注輸顯示 出對多種自身免疫疾病的治療性效果，但基于MSC的免疫調(diào)節(jié)的根本機(jī)理尚未得到完全理 解。此處，發(fā)明人展示出BMMSC的系統(tǒng)性注輸通過Fas配體（FasL)依賴性Fas途徑誘導(dǎo)了 瞬時的T細(xì)胞凋亡，由此微纖維蛋白-1突變的系統(tǒng)性硬化癥（SS)和葡聚糖硫酸酯鈉誘導(dǎo) 的實(shí)驗性結(jié)腸炎小鼠中的病變表型得到減輕。另一方面，F(xiàn)asL+BMMSC沒有誘導(dǎo)接受體中 的T細(xì)胞凋亡，并因此無法減輕SS和結(jié)腸炎，而FasL+BMMSC中FasL的過表達(dá)挽救了這些 表型。出人預(yù)料的是，具有正常FasL表達(dá)的Fas+BMMSC也沒能對SS和結(jié)腸炎小鼠誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡和提供治療效果。機(jī)理性研宄揭示，BMMSC中的受Fas調(diào)節(jié)的單核細(xì)胞趨化蛋白 I (MCP-I)的分泌在將T細(xì)胞募集至BMMSC以進(jìn)行FasL介導(dǎo)的凋亡中起著至關(guān)重要的作用。 凋亡T細(xì)胞隨后觸發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β )，后者又導(dǎo)致Treg的 上調(diào)并最終導(dǎo)致對于BMMSC介導(dǎo)的免疫療法的免疫耐受性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了在基于BMMSC 的免疫療法中BMMSC通過Fas和FasL的偶聯(lián)效應(yīng)而與T細(xì)胞凋亡相關(guān)的此前未被認(rèn)知的 作用。
[0009] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：受Fas調(diào)節(jié)的單核細(xì)胞趨化蛋白I (MCP-I) 在MSC、優(yōu)選BMMSC中的分泌在將T細(xì)胞募集至MSC、優(yōu)選BMMSC以進(jìn)行FasL介導(dǎo)的凋亡中 起著至關(guān)重要的作用。
[0010] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的基于MSC、優(yōu)選 BMMSC的免疫療法中需要FasL。
[0011] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：出人預(yù)料地，表達(dá)Fas和FasL的MSC、優(yōu)選 BMMSC比不表達(dá)這兩種蛋白的MSC、優(yōu)選BMMSC對于誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡和使Treg水平上調(diào)而 言更為有效。
[0012] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：凋亡的T細(xì)胞隨后觸發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水 平的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，后者又導(dǎo)致Treg的上調(diào)并最終導(dǎo)致對于BMMSC介導(dǎo)的免疫 療法的免疫耐受性。
[0013] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：用表達(dá)Fas和FasL并分泌MCP-I的MSC、 優(yōu)選BMMSC來治療罹患系統(tǒng)性硬化癥的受試對象有效地減輕和/或改善了該疾病的癥狀。
[0014] 本發(fā)明的一個實(shí)施方式涉及以下發(fā)現(xiàn)：用表達(dá)Fas和FasL并分泌MCP-I的MSC、 優(yōu)選BMMSC來治療罹患結(jié)腸炎的受試對象有效地減輕和/或改善了該疾病的癥狀。
【附圖說明】
[0015] 圖I. BMMSC通過Fas配體（FasL)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。⑷BMMSC移植程序概圖。將 1父106個8麗5(：(11 = 5)、卩&81//>1(18麗5(：(11 = 4)或卩&814專染的81(18麗5(：$&81^1(18麗5(：，11 =4)經(jīng)尾靜脈注輸于C57BL6小鼠內(nèi)。在指定時間點(diǎn)將各組處死以進(jìn)行樣品收集。0小 時表示在BMMSC注射后立即將小鼠處死。（B~E)在指定的時間點(diǎn)，BMMSC移植（BMMSC) 誘導(dǎo)了 CD3+T細(xì)胞數(shù)量的瞬時減少并增加了外周血單個核細(xì)胞（PBMNC ;B、C)和骨髓單 核細(xì)胞（PBMNC ;D、E)中的膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡CD3 +T細(xì)胞，而來自gld小鼠的 Fas+BMMSCfeldBMMSC)未能減少CD3+T細(xì)胞或使提高周血（B、C)和骨髓（D、E)中的CD3+T 細(xì)胞凋亡。FasL轉(zhuǎn)染的gldBMMSC移植（FasL+gldBMMSC)部分地挽回了在外周血（B、C) 和骨髓（D、E)中減少⑶3+T細(xì)胞數(shù)量并誘導(dǎo)⑶3+T細(xì)胞凋亡的能力。*P〈0. 05 ;#P〈0. 01 ; ***Ρ〈0· 001，相對于 gldBMMSC ;#Ρ〈0· 05 ;###Ρ〈0· 001，相對于 FasL+gldBMMSC ;$Ρ〈0· 05 ; $$$P〈0. 001相對于gldBMMSC。（F)當(dāng)BMMSC注輸給小鼠后，TUNEL和免疫組織化學(xué)染色顯示 出，骨髓中的BMMSC注射組比對照組的⑶3陽性T細(xì)胞（紫色，黃色箭頭）中的TUNEL陽 性凋亡細(xì)胞（棕色，白色箭頭）的數(shù)量更高。（G)當(dāng)將BMMSC與T細(xì)胞共培養(yǎng)時，與IgG抗 體對照組相比，抗FasL中和抗體（1 μ g/mL)明顯阻斷了 BMMSC誘導(dǎo)的膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙 陽性凋亡T細(xì)胞。（H) TUNEL和免疫組織化學(xué)染色顯示，當(dāng)⑶3T細(xì)胞（紫色，黃色箭頭）與 BMMSC在體外共培養(yǎng)時，在CD3T細(xì)胞中觀察到TUNEL陽性凋亡T細(xì)胞（棕色，白色箭頭）。 在抗FasL中和抗體（FasL Ab)的存在下，TUNEL陽性細(xì)胞百分比顯著低于未經(jīng)處理的對照 組。⑴另外，BMMSC誘導(dǎo)的膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡T細(xì)胞的數(shù)量通過半胱天冬酶3、8 和9抑制劑處理而被顯著阻斷。結(jié)果是三次獨(dú)立實(shí)驗的代表性結(jié)果。（J)表明BMMSC誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡的Schematic圖表（*P〈0. 05 ;#P〈0. 01 ;#*P〈0. 001。條形圖表示平均值土SD)。
[0016] 圖2. BMMSC誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)的上調(diào)需要 FasL。（A、B)BMMSC移植（BMMSC，n-5)誘導(dǎo)了外周血中⑶3+T細(xì)胞數(shù)量的瞬時減少（A)和膜 聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡CD3+細(xì)胞的升高（B)。FasL敲減的BMMSC(FasL siRNA BMMSC，n =3)的移植未能在外周血中減少CD3+T細(xì)胞（A)或增加 CD3+凋亡T細(xì)胞的數(shù)量（B)。（C，D) BMMSC移植（BMMSC，n = 5)顯示出骨髓中的⑶3+T細(xì)胞的瞬時減少（C)和膜聯(lián)蛋白V+7AAD+ 雙陽性凋亡CD3+T細(xì)胞的增加（D)。FasL敲減的BMMSC (FasL siRNA BMMSC, η = 3)的移植 未能在骨髓中減少CD3+T細(xì)胞（C)或增加 CD3+凋亡T細(xì)胞（D)。（E)BMMSC而非FasL敲減 的FasL的移植在移植至C57BL6小鼠后24小時和72小時顯著地使Treg水平上調(diào)。（F)移 植后24小時和72小時，與gldBMMSC移植組相比，BMMSC移植導(dǎo)致Treg的顯著上調(diào)。FasL 轉(zhuǎn)染的gldBMMSC移植（FasL+gldBMMSC)部分地挽回了 BMMSC誘導(dǎo)的Treg上調(diào)。（G)移植 后24小時，BMMSC和FasL+gldBMMSC中的外周血TGF-β水平均顯著增加。FasL+gldBMMSC 移植未能上調(diào)TGF-β水平。（H)凋亡的泛T細(xì)胞在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞吞噬。綠色指示T細(xì) 胞，而紅色指示⑶Ilb+巨噬細(xì)胞。條形=50 μ m。（I)與對照組（C57BL6)相比，BMMSC移 植組增加了外周血中的CDllb+細(xì)胞數(shù)。如流式細(xì)胞分析所評估，通過氯膦酸鹽-脂質(zhì)體處 理對巨噬細(xì)胞的耗盡顯示出在BMMSC移植組中有效減少⑶Ilb +細(xì)胞（BMMSC+氯膦酸鹽）。 (J)BMMSC移植后外周血中的TGF-β水平顯著增加。氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理阻斷了 BMMSC誘 導(dǎo)的TGF-β上調(diào)（BMMSC+氯膦酸鹽）。（K)與對照組（C57BL6)相比，BMMSC移植使外周血 中的Treg水平上調(diào)。氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理抑制了 BMMSC誘導(dǎo)的Treg上調(diào)（BMMSC+氯膦酸 鹽）。（L)示意圖表明，通過Treg上調(diào)證明，BMMSC誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡導(dǎo)致免疫耐受。結(jié)果 是3次獨(dú)立實(shí)驗的代表（*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001。條形圖表示平均值土 SD)。
[0017] 圖3. BMMSC介導(dǎo)的系統(tǒng)性硬化癥（SS)表型的減輕需要FasL。（A)顯示出BMMSC 移植如何減輕SS表型的圖。（B，C)如流式細(xì)胞分析所評估，BMMSC移植（η = 6)顯示出SS 小鼠中CD3+T細(xì)胞數(shù)的顯著減少（B)和膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡CD3 +T細(xì)胞數(shù)的增加 (C)。然而，F(xiàn)asLfgldBMMSC移植（η = 6)未能減少CD3+T細(xì)胞數(shù)量⑶或增加凋亡CD3+T 細(xì)胞數(shù)量（C)。（D~F)與對照C57BL6小鼠相比，Tsk/+SS小鼠顯示出抗核抗體（ANA，D) 和抗雙鏈DNA抗體IgG(E)和IgM(F)的水平的升高。BMMSC移植減少了 ANA水平⑶和抗 雙鏈DNA抗體IgG(E)和IgM(F)的水平。相比之下，F(xiàn)asL^gldBMMSC移植未能減少抗核抗 體（ANA，D)水平或抗雙鏈DNA抗體IgG(E)和IgM(F)的水平。（G) Tsk/+小鼠中的血清肌 酐水平顯著增加。在BMMSC移植后，肌酐水平顯著降低至在C57BL6小鼠中觀察到的水平。 然而，gldBMMSC移植未能降低肌酐水平。（H)Tsk/+小鼠中的尿蛋白濃度顯著增加 。BMMSC 移植將尿蛋白降至對照水平。gldBMMSC移植未能降低Tsk/+小鼠中的尿蛋白水平。（I)與 C57BL6小鼠相比，Tsk/+小鼠中的Treg水平顯著降低。BMMSC移植后，Treg水平顯著升高， 而gldBMMSC移植未能增加 Tsk/+小鼠中的Treg水平。（J)與C57BL6小鼠相比，Tsk/ +小 鼠中的⑶4+IL17+Thl7細(xì)胞顯著增加。在BMMSC移植組中，升高的Thl7水平被顯著降低，而 gldBMMSC移植未能降低Tsk/+小鼠中的Thl7水平。（K)與對照小鼠（C57BL6, η = 5)相比， Tsk/+小鼠（Tsk/+，η = 5)中的皮下組織厚度（hyperdermal thickness)顯著增加 。BMMSC 而非FasL+gldBMMSC移植減小了皮下組織厚度（*P〈0. 05, **P〈0. 01，***P〈0. 001。條形圖 表示平均值土 SD)。
[0018] 圖4. FasL在針對葡聚糖硫酸鈉（DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗性結(jié)腸炎的BMMSC介導(dǎo)免疫療 法中起著關(guān)鍵作用。（A)顯示在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗性結(jié)腸炎小鼠中移植BMMSC的圖。（B，C) 如流式細(xì)胞分析所評估，結(jié)腸炎小鼠中BMMSC移植（η = 6)顯示出在移植后24小時CD3+T 細(xì)胞數(shù)的顯著減少（B)和移植后24至72小時膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡CD3 +T細(xì)胞的增 加（C)。然而，F(xiàn)asL+gldBMMSCOi = 6)未能減少CD3+T細(xì)胞數(shù)⑶或增加凋亡CD3+T細(xì)胞 (C)。（D)在DSS誘導(dǎo)后5至10天，結(jié)腸炎小鼠（結(jié)腸炎，η = 5)、BMMSC移植組和gldBMMSC 顯示出顯著的體重減少。在DSS誘導(dǎo)后10天，與結(jié)腸炎組和gldBMMSC移植組相比，BMMSC 移植組顯示出對體重減少的抑制。（E)在DSS誘導(dǎo)后5至10天，與C5