產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之方法、依該方法所制備之細(xì)胞及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之方法、依該方法所制備之細(xì)胞及其應(yīng) 用
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年9月10日提交的美國(guó)申請(qǐng)13/607976的優(yōu)先權(quán)。以磁盤(pán)提交 的序列表
[0003] 序列表是依照37C. F. R § 1. 823 (a)以紙件形式提交的說(shuō)明書(shū)的一部分。
【背景技術(shù)】
[0004] 本發(fā)明關(guān)于一種制備具有特定功能之細(xì)胞之方法，特別系關(guān)于一種制備免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞（immunomodulatory cells)之方法。
[0005] 自體免疫疾病系由不正常的免疫反應(yīng)所致，此種免疫反應(yīng)會(huì)針對(duì)正常存在于人體 中之物質(zhì)或組織；換言之，免疫系統(tǒng)將身體某部分誤認(rèn)為病原體并因而攻擊自身細(xì)胞。移植 物排斥則是不欲之免疫反應(yīng)所造成的另一個(gè)問(wèn)題，所謂移植，系將細(xì)胞、組織或器官由一處 移往另一處之行為。雖然移植已成為一種例行的醫(yī)療手段，但免疫系統(tǒng)仍然是最難以克服 的障礙。
[0006] 免疫抑制藥物可降低免疫反應(yīng)，通常可用于治療/預(yù)防自體免疫疾病及移植物排 斥。免疫抑制藥物會(huì)伴隨不同的副作用，包括抑制整體免疫系統(tǒng)、造成患者易受感染等。生 物制劑亦可用于該治療，包括例如抗細(xì)胞因子療法（anti-cytokine therapy)、T細(xì)胞清除 療法、B細(xì)胞清除療法、及耐受性誘發(fā)療法。近來(lái)，細(xì)胞療法（例如被動(dòng)給予T細(xì)胞（adoptive T-cell)或干細(xì)胞）成為治療或預(yù)防自體免疫疾病及移植物排斥之新選擇，但此療法仍在 發(fā)展中。
[0007] 人類間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC)為一種多元性前體細(xì) 胞（multilineage progenitor cells)之細(xì)胞群，具有分化成多種間充質(zhì)細(xì)胞系之能 力。間充質(zhì)干細(xì)胞可由骨髓及其它幾種器官，例如脂肪組織、胎盤(pán)、羊水、及胎兒組織， 如胎兒的肺及血液，分離出。由于間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離、且已報(bào)導(dǎo)可分化成中胚層 之外（extra-mesodermal)的細(xì)胞類型，因此使得此種出生后前體細(xì)胞（post-natal progenitors)成為多種疾病之細(xì)胞療法之熱門(mén)選擇。
[0008] 除了多元性分化能力以外，骨髓及胎兒之間充質(zhì)干細(xì)胞已被報(bào)導(dǎo)具有免疫調(diào)節(jié)效 果。此項(xiàng)功能牽涉到調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生之樹(shù)突細(xì)胞（DC)、及天然殺傷淋巴 細(xì)胞（NK)之增殖能力及效應(yīng)功能。人類間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的效用，主要經(jīng)由非細(xì)胞 接觸過(guò)程而進(jìn)行調(diào)控，但確切機(jī)制仍為未知。
[0009] 日漸增多的研宄顯示了免疫調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的重要性。直到最近才知道有許多 白細(xì)胞亞群可產(chǎn)生免疫抑制效果，包括調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、II型巨噬細(xì)胞、及未成熟樹(shù)突細(xì) 胞。然而，幾乎沒(méi)有針對(duì)調(diào)節(jié)性單核細(xì)胞之資料。
[0010] 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，以下有時(shí)簡(jiǎn)稱HGF)已知為有絲分 裂促進(jìn)劑，且為發(fā)展上重要的分子。亦已知為細(xì)胞擴(kuò)散因子（scatter factor)，HGF不僅提 供強(qiáng)力生長(zhǎng)訊號(hào)，亦可誘導(dǎo)細(xì)胞迀移，因此，HGF在癌細(xì)胞生長(zhǎng)及擴(kuò)散的角色已被充分研宄； 但關(guān)于HGF在非有絲分裂之功效上則所知不多。HGF由中葉細(xì)胞分泌，并主要作用于上皮細(xì) 胞及內(nèi)皮細(xì)胞，但亦可作用于造血性前體細(xì)胞。HGF已被顯示在胚胎器官發(fā)展、成人器官再 生、及傷口愈合上扮演重要角色。HGF及TGF-0已被報(bào)導(dǎo)可于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中作為抑 制T細(xì)胞增殖之調(diào)控者，此可藉由給予針對(duì)HGF及TGF-0之中和性抗體后，T細(xì)胞增殖作用 會(huì)重新恢復(fù)而證明Nicola et al.，Blood 2002;99:3838-3843)。然而，也有報(bào)告顯示 了不同結(jié)論，該等因子系與間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于T細(xì)胞受有絲分裂促進(jìn)劑刺激之抑制作用無(wú) 關(guān)，因而提出與前述不同的刺激物依賴性機(jī)制（Le Blanc et al.，Scand J Immunol 2004; 60:307-315 ;Rasmusson I et al.，Exp Cell Res 2005;305:33-41)。綜上述，HGF 與免疫 系統(tǒng)間的功能及交互作用仍為未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明系提供一種產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之方法，包括：以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)處 理外周單個(gè)核細(xì)胞（peripheral mononuclear cell)，以誘發(fā)該外周單個(gè)核細(xì)胞分化成免 疫調(diào)節(jié)性白細(xì)胞（immunomodulatory leukocyte)。
[0012] 本發(fā)明亦提供一種以前述方法所制備之免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明另提供一種治療由異常免疫反應(yīng)所致疾病之方法，包括：對(duì)患有該疾病之 患者施用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF);誘發(fā)該患者之外周單個(gè)核細(xì)胞分化成免疫調(diào)節(jié)性白細(xì) 胞；及調(diào)節(jié)該異常免疫反應(yīng)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 第1圖顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC)及胎盤(pán)衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（P-MSC)之 特征，第1A圖：表面標(biāo)記；第1B圖：BM-MSC及P-MSC之三譜系分化表型，Osteo :成骨系、 Chondro :成軟骨系、Adipo :成脂系；比例尺：200mm。
[0015] 第2圖系顯示在異體外周血白細(xì)胞（PBLs)中，間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增了功能性 ⑶14XD1 lb+⑶33+骨髓衍生的抑制細(xì)胞（MDSC)數(shù)量。第2A圖：藉由間充質(zhì)干細(xì)胞， CD14XDllb+CD33+細(xì)胞自外周血白細(xì)胞中增加，同種異體之外周血白細(xì)胞（30位提供者） 單獨(dú)培養(yǎng)或與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)（BM-間充質(zhì)干細(xì)胞及P-間充質(zhì)干細(xì)胞各有三位提 供者）。第2B圖：外周血白細(xì)胞之⑶llb+或⑶14TDllb+CD33+細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共 培養(yǎng)后之定量百分比，與外周血白細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比較之P〈〇. 05。第2C圖：間充質(zhì)干 細(xì)胞誘發(fā)之骨髓衍生的抑制細(xì)胞之抑制功能，同種異體外周血白細(xì)胞（T，標(biāo)的細(xì)胞）以 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)染色以評(píng)估細(xì)胞分裂，并在添加或不添 加間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增之骨髓衍生的抑制細(xì)胞（E，作用細(xì)胞）下，以抗-CD3/28(a-CD3/28)刺 激，其中該添加以不同E:T比例進(jìn)行。以流式細(xì)胞分析評(píng)估PBL細(xì)胞分裂，右圖為量化結(jié)果， p〈0. 05。第2D圖：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS)之表達(dá)，第2E圖：MSC-擴(kuò)增之骨髓衍生的 抑制細(xì)胞之精氨酸酶-1 (ARG1)之表達(dá)，由PBL負(fù)面選擇CDlf細(xì)胞，單獨(dú)培養(yǎng)或與間充質(zhì) 干細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)一步以⑶11b、⑶33、及iNOS(第2D圖）或ARG1(第2E圖）染色。第2F 圖：藉由MSC-擴(kuò)增之骨髓衍生的抑制細(xì)胞而增加⑶4+⑶25 mgh調(diào)控性T細(xì)胞（T ,egs)，將表現(xiàn) ⑶14_CDllb+⑶33+之MSC-擴(kuò)增之骨髓衍生的抑制細(xì)胞分出（FACS)，并與經(jīng)抗-⑶3/28刺 激之異體PBL以不同比例共培養(yǎng)，并評(píng)估高表現(xiàn)CD4+CD25之T細(xì)胞之誘導(dǎo)作用，右圖為量 化結(jié)果，與PBL/a-CD3/28相較之p〈0. 05。
[0016] 第3圖顯示骨髓衍生的抑制細(xì)胞之間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增作用系經(jīng)由分泌之肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子（HGF)所調(diào)控。第3A圖：骨髓衍生的抑制細(xì)胞受間充質(zhì)干細(xì)胞誘發(fā)之?dāng)U增作用系 經(jīng)分泌因子所調(diào)控。異體PBL與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，無(wú)論是直接接觸（MSC)或由培養(yǎng)盤(pán) 分隔（TW)者，均產(chǎn)生⑶14TDllb+⑶33+骨髓衍生的抑制細(xì)胞之?dāng)U增作用；*，p〈0.05與PBL 單獨(dú)培養(yǎng)者比較；n. s.:不顯著。第3B圖：以細(xì)胞因子定量陣列分析間充質(zhì)干細(xì)胞之高量分 泌因子；IL :間白素、LAP :潛伏型勝肽、SDF :基質(zhì)衍生因子。第3C圖：添加外源性重組HGF 至PBL可增加骨髓衍生的抑制細(xì)胞數(shù)量（*，p〈0. 05線性趨勢(shì)）。第3D圖：經(jīng)HGF-擴(kuò)增之 骨髓衍生的抑制細(xì)胞中iNOS (上行）及ARG1 (下行）表達(dá)之測(cè)試。第3E圖：經(jīng)HGF-擴(kuò)增 之骨髓衍生的抑制細(xì)胞對(duì)于經(jīng)抗-CD3/28刺激之PBL增殖之抑制作用，以CFSE對(duì)細(xì)胞分裂 進(jìn)行染色，并以流式細(xì)胞儀分析。第3F圖：以HGF專一性小片段干擾RNA(siRNA)抑制間充 質(zhì)干細(xì)胞之HGF分泌，會(huì)使骨髓衍生的抑制細(xì)胞擴(kuò)增作用消失。異體外周血白細(xì)胞與間充 質(zhì)干細(xì)胞（來(lái)自3位提供者）共培養(yǎng)，并經(jīng)無(wú)標(biāo)的小片段干擾RNA (siRNA Ctrl)或HGF專 一性siRNA(siHGF)轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行⑶14TDllb+CD33+細(xì)胞之評(píng)估；*，p〈0. 05與間充質(zhì)干細(xì)胞 (左圖）或PBL單獨(dú)培養(yǎng)（右圖）相較。
[0017] 第4圖顯示癌細(xì)胞分泌之HGF及小鼠體內(nèi)施用HGF可增加骨髓衍生的抑制細(xì)胞之 數(shù)量。第4A圖：間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌之HGF之量，MG63 (骨肉瘤細(xì)胞系）、胚胎干細(xì)胞衍生 之間充質(zhì)前體細(xì)胞（EMP)、及JEG-3(絨毛膜癌細(xì)胞系）；第4B圖：四種細(xì)胞類型及PBL共培 養(yǎng)后之骨髓衍生的抑制細(xì)胞之倍數(shù)增生；*，P〈〇. 05線性趨勢(shì)。第4C圖：將重組HGF(lOOng) 以尾靜脈注射至C57BL/6小鼠，并于注射后一天及三天評(píng)估其外周血、脾臟及骨髓中之 CDllb+Grl+細(xì)胞；*，p〈0. 05 與 PBS 相較。
[0018] 第5圖顯示由HGF擴(kuò)增之骨髓衍生的抑制細(xì)胞經(jīng)其受體c-met及增加STAT3磷酸 化所調(diào)控。第5A圖：以流式細(xì)胞儀分析骨髓衍生的抑制細(xì)胞上之c-met表達(dá)（12位提供 者），并提供量化之平均熒光強(qiáng)度（MFI)之圖表；*，p〈0. 05與同型免疫球蛋白對(duì)照組相較 (Ctrl)。第5B圖：c-met與HGF調(diào)控之骨髓衍生的抑制細(xì)胞擴(kuò)增之關(guān)聯(lián)。以同型免疫球蛋 白（IsoAb)或c-met阻斷抗體（anti-c-Met)阻斷外周血白細(xì)胞，以重組HGF(20ng/ml)處 理，并評(píng)估CD14TDllb+CD33+細(xì)胞之增加。第5C圖：STAT3與HGF調(diào)控之骨髓衍生的抑制細(xì) 胞擴(kuò)增之關(guān)聯(lián)。將重組HGF (20ng/ml)添加至⑶14_白細(xì)胞中，并對(duì)⑶1 lb、⑶33、及經(jīng)磷酸化 之STAT3 (pSTAT3)進(jìn)行染色，以流式細(xì)胞儀評(píng)估（右上角數(shù)值為MFI)，一并提供量化之MFI 之圖表；*，p〈0. 05線性趨勢(shì)。第?圖：將重組HGF(20ng/ml)及不同劑量之cpdl88(STAT3 抑制劑）添加至PBL中，并對(duì)⑶11b、⑶33、及經(jīng)磷酸化之STAT3 (pSTAT3)進(jìn)行染色，以流式 細(xì)胞儀評(píng)估，一并提供量化之⑶14TD1 lb+CD33+pSTAT3+細(xì)胞所占比例；a，p〈0. 05與PBL單 獨(dú)培養(yǎng)相較；b，p〈0. 05線性趨勢(shì)。
[0019] 第6圖顯示HGF所調(diào)控之骨髓衍生的抑制細(xì)胞擴(kuò)增之機(jī)制。
[0020] 第7圖顯示胎盤(pán)衍生之間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌之HGF對(duì)于經(jīng)抗-⑶3/28-活化之同 種異體外周血白細(xì)胞增殖之抑制作用。第7A圖：外周血白細(xì)胞，單獨(dú)培養(yǎng)（