用于體細(xì)胞核重編程的先天免疫激活的制作方法
【專利說明】用于體細(xì)胞核重編程的先天免疫激活
[0001]政府權(quán)利
[0002]本發(fā)明是在政府支持下根據(jù)國家衛(wèi)生研宄所授予的合同HL100397和HL103400完成的。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
[0003]發(fā)明背景
[0004]Yamanaka和同事進(jìn)行的開創(chuàng)性研宄顯示某些轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)可能會誘導(dǎo)體細(xì)胞的多能性。這些誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)自我更新并且分化成多種細(xì)胞類型，從而使其成為用于疾病和患者特定性再生醫(yī)學(xué)療法的一種有吸引力的選擇。它們已被用于成功地模型化人類疾病并且具有極大的用于藥物篩選和患者特定性細(xì)胞療法的潛能。此外，從患病細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC可充當(dāng)適用于研宄疾病機(jī)制和潛在療法的工具。然而，仍應(yīng)對有關(guān)體細(xì)胞重編程為iPSC的潛在機(jī)制有更多了解，并且要關(guān)注在沒有機(jī)制性深入理解的情況下的潛在臨床應(yīng)用。
[0005]用于重編程為多能細(xì)胞的因子(RF)組包括0ct3/4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28和Nanog。0ct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)細(xì)胞中保持多能性的轉(zhuǎn)錄因子，而Klf4和c-Myc被認(rèn)為是提高iPSC產(chǎn)生效率的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)信轉(zhuǎn)錄因子c-Myc修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以允許0ct3/4和Sox2較有效地接近為重編程所必需的基因，而Klf4通過0ct3/4和Sox2增強(qiáng)某些基因的激活。Nanog(像0ct3/4和Sox2 —樣)是在ES細(xì)胞中保持多能性的轉(zhuǎn)錄因子，而Lin28是被認(rèn)為影響在分化期間特異性mRNA的轉(zhuǎn)譯或穩(wěn)定性的mRNA結(jié)合蛋白。最近，已證實0ct3/4和Sox2的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)與丙戊酸、染色質(zhì)去穩(wěn)定劑和組蛋白脫乙?；敢种苿┑墓彩┯靡黄鹱阋允钩衫w維細(xì)胞重編程為iPSC。
[0006]為從體細(xì)胞產(chǎn)生iPSC，已使用病毒載體或質(zhì)粒來過表達(dá)這些重編程因子的一些組合。然而，這些方法產(chǎn)生低重編程效率并且未能提供對重編程過程的精確控制。此外，這些用于核重編程的方法固有地引起關(guān)于由DNA整合所引起的潛在致瘤性和基因沉默突變的擔(dān)憂。因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染造成的外來DNA整合到宿主基因組中引起對外來DNA可使必需基因沉默或誘導(dǎo)這些基因調(diào)節(jié)異常的擔(dān)憂。雖然Cre-LoxP位點基因遞送或PiggyBac轉(zhuǎn)座子途徑已用于在基因遞送之后從宿主基因組上去除外來DNA，但沒有一種策略消除誘變的危險，因為其留下小的殘余外來DNA插入物。
[0007]作為基因修飾的替代方案，已產(chǎn)生用于無整合核重編程的細(xì)胞穿透蛋白(CPP)，其中重編程因子融合到為蛋白質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)胶酥卸峁┑慕Y(jié)構(gòu)域中。已通過使用純化重組蛋白在鼠胚胎成纖維細(xì)胞中實現(xiàn)成功重編程為多能細(xì)胞。盡管已使用來自胚胎干細(xì)胞(ESC)以及過表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞提取物重編程人類細(xì)胞，但尚未使用純化CPP重編程人類細(xì)胞。并且甚至在小鼠細(xì)胞情況下，使用CPP的重編程效率(約0.001%)比使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體實現(xiàn)的重編程效率(0.1% -1% )低大于10倍。
[0008]用于iPSC產(chǎn)生或轉(zhuǎn)分化成不同體細(xì)胞類型的基于CPP和/或小分子的途徑避免了關(guān)于外來DNA整合的所有擔(dān)憂，并且提供對濃度、時間和因子刺激順序的較大控制，然而此類方法在實際操作中仍存在重大問題。本發(fā)明解決了這個問題。
[0009]發(fā)明概述
[0010]提供用于使用非整合方法有效產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的組合物和方法。在本發(fā)明的方法中，需要重編程為多能細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化的體細(xì)胞與有效劑量的toll樣受體(TLR)激動劑接觸，所述TLR包括但不限于TLR3。接觸步驟可在細(xì)胞與非整合重編程因子接觸之前、與其同時或在其之后進(jìn)行，通常同時進(jìn)行。非整合重編程因子是核作用多肽或改變轉(zhuǎn)錄的小分子，并且其可誘導(dǎo)靶細(xì)胞重編程。在一些實施方案中，重編程因子是融合到多肽穿透結(jié)構(gòu)域中的多肽，例如如本領(lǐng)域中已知的九精氨酸、tat等。在一些實施方案中，重編程因子是0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。
[0011]在一些實施方案中，提供重編程細(xì)胞群，其中初始體細(xì)胞群重編程為誘導(dǎo)性多能或轉(zhuǎn)分化細(xì)胞群。此類細(xì)胞在本領(lǐng)域中已知的各種方法(包括藥物篩選、自體或異體移植治療性細(xì)胞施用等)中獲得應(yīng)用。重編程細(xì)胞群因不存在整合遺傳因子而提供優(yōu)勢。
[0012]在其它實施方案中，提供用于體細(xì)胞核重編程的試劑盒。此類試劑盒可包含先天免疫激活劑，例如一種或多種TLR激動劑，包括但不限于雙鏈核酸，諸如聚1:C。此類試劑盒可進(jìn)一步包含用于多能細(xì)胞的非整合誘導(dǎo)的試劑，例如一種細(xì)胞穿透蛋白(例如S0X2、0CT4、Nanog、KLF4、cMYC等)或其混合物。此類試劑盒可作為另外一種選擇或以組合形式提供一種適用于將細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為所關(guān)注譜系的因子或其混合物。舉例來說，內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化試劑盒可包含BMP4、VEGF, bFGF、8_Br_cAMP、SB431542等中的一者或多者。此類試劑盒可進(jìn)一步包含為進(jìn)行本發(fā)明方法所必需的適合的緩沖劑、細(xì)胞生長培養(yǎng)基、說明書等。
[0013]還提供用于體內(nèi)使用本發(fā)明方法的試劑盒和方法，其中治療劑包含先天免疫激活劑，并且體內(nèi)施用一種或多種細(xì)胞穿透肽和/或小分子用于治療性調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或組織表型。
[0014]附圖簡述
[0015]圖1:由病毒載體表達(dá)或以細(xì)胞穿透肽形式遞送的重編程因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)的不同模式:(A)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(紅線)或細(xì)胞穿透肽(藍(lán)線)感染之后Nanog的倍數(shù)表達(dá)。與病毒載體pMX-Sox2相比，細(xì)胞穿透CPP-S0X2引起下游目標(biāo)和多能性基因的遲延表達(dá)?；虮磉_(dá)的相對倍數(shù)變化是在每天用200nM CPPS0X2處理之后或在第O天單一pMXSox2感染之后測定。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。(B)因為各處理條件下所選基因(Jarid2、Zic2、bMyb、0ct4、Sox2和Nanog)的時間表達(dá)模式顯著類似，所以其隨時間推移的倍數(shù)表達(dá)的變化以所有六種基因的平均倍數(shù)增加顯示。注意到與Sox2以CPP形式存在時相比，當(dāng)Sox2以病毒載體形式存在時，目標(biāo)基因表達(dá)快速增加。(C)與病毒載體pMX0ct4相比，細(xì)胞穿透CPP0CT4引起下游目標(biāo)和多能性基因的遲延表達(dá)。Nanog基因表達(dá)是此不同基因時間表達(dá)模式的代表。基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化是在每天用200nM CPP0CT4處理之后或在第O天單一 pM0ct4感染之后測定。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005o (D)顯示各條件下所選基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和0ct4)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。注意到與0ct4以CPP形式存在時相比，當(dāng)0ct4以病毒載體形式存在時，目標(biāo)基因表達(dá)快速增加。
[0016]圖2:不相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體促進(jìn)CPP誘導(dǎo)的基因表達(dá):(A)在pMX-Sox2 (紅線)、CPP-S0X2 (藍(lán)線)或pMX-GFP+CPP-S0X2 (綠線)處理之后，Nanog基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(B)顯示各條件下所選基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、0ct4、Sox2和Nanog)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。當(dāng)Sox2以CPP形式提供時，下游目標(biāo)基因的激活延遲。然而，在不相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在下，目標(biāo)基因表達(dá)快速增加，并且與pMX-Sox2相似。(C)在pMX-0ct4、CPP-0CT4或pMX_GFP+CPP_0CT4處理之后Nanog的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(D)顯示各條件下所選基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和0ct4)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0017]圖3:TLR3途徑的基因敲低抑制編碼0ct4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的作用:(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制劑-TRIF)處理的成纖維細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后，0ct4的基因表達(dá)降低。下方圖顯示在四種條件下，所選多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后0ct4的基因表達(dá)降低。下方圖顯示在四種條件下，所選多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。(C)在TLR3shRNA-基因敲低成纖維細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒_0ct4 (pMX_0ct4)感染之后0ct4的基因表達(dá)降低。下方圖(D-F)顯示在四種條件下，所選多能基因(0ct4、Sox2和Nanog)隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0018]圖4:TLR3_TRIF基因敲低成纖維細(xì)胞展現(xiàn)削弱的核重編程:(Α)用于使用以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體形式遞送的重編程因子產(chǎn)生iPSC的方案。(B)在錯義、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒核重編程起始之后第30天iPSC的代表性圖像。在TLR3信號傳導(dǎo)途徑的元件被基因敲低的成纖維細(xì)胞(即TRIF shRNA或TLR3shRNA細(xì)胞系)中，人類iPSC集落的發(fā)展顯著延遲。相比之下，在所有其它TLR的銜接子被基因敲低的成纖維細(xì)胞(MyD88shRNA)中，或在用錯義shRNA處理的成纖維細(xì)胞中，未注意到hiPSC發(fā)展延遲。(C)在由通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染遞送的重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的錯義、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞系中，第35天hiPSC集落的總數(shù)目。hiPSC集落的產(chǎn)量因TLR3信號傳導(dǎo)途徑的基因敲低元件而降低。*P〈0.05 ;錯義細(xì)胞與TRIF或TLR3shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞相比較。(D)第35天在錯義、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞中，0ct4基因表達(dá)的倍數(shù)變化。
[0019]圖5:聚1: C促進(jìn)CPP誘導(dǎo)的目標(biāo)基因表達(dá):(A)在pMX_Sox2 (紅線)、CPP_S0X2 (藍(lán)線)或聚1:C+CPPS0X2(綠線)處理之后Jarid2的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(B)這些所選基因(即Jarid2、Zic2、bMyb, 0ct4、Sox2和Nanog)在各處理之后展現(xiàn)平均基因時間表達(dá)模式的概括圖。聚1:C使CPPS0X2對下游基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)。(C)在pMX-0ct4、CPP0CT4或聚1:C+CPP0CT4處理之后Nanog的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(D)這些所選基因(即Tcf4、Gap43、Nanog, Sox2和0ct4)在各處理之后展現(xiàn)基因時間表達(dá)模式的概括圖。聚1:C使CPP0ct4對下游基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，η = 3，*Ρ〈0.005。
[0020]圖6.TLR3激活使強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型系統(tǒng)中的重編程增強(qiáng):(A)在暴露于強(qiáng)力霉素4周后，顯示從表達(dá)編碼四種重編程因子的dox誘導(dǎo)型多順反子轉(zhuǎn)基因構(gòu)筑體的MEF衍生的iPSC集落的SSEA-1活染。在一些孔中，MEF還暴露于編碼GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)筑體或聚I:C? (B)顯示第2周和第3周原始培養(yǎng)板中的SSEA-1+集落的直方圖。聚1:C或編碼GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)筑體的共施用使強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的重編程的產(chǎn)量顯著增加。(C)聚1:C或編碼GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)筑體的共施用促進(jìn)0ct4和Sox2的基因表達(dá)。
[0021]圖7.TLR3激活刺激CPP誘導(dǎo)的人類成纖維細(xì)胞重編程:(A)用于使用四種CPP-TF(0CT4-Rll、S0X2-Rll、KLF4-Rll*cMYC-Rll)產(chǎn)生人類 iPSC 的方案。(B)在第 30-45天，聚1:C的共施用使0ct4的基因表達(dá)增加。(C)在第30天和第40天，在存在和不存在聚1:C的情況下數(shù)到的TRA-1-81陽性集落。聚1:C的共施用使CPP誘導(dǎo)的重編程的產(chǎn)量顯著增加。(D)CPP誘導(dǎo)的反式激活在第32天的ES樣集落形成(10倍)
[0022]圖8.由從病毒載體表達(dá)或以細(xì)胞穿透肽形式遞送的個別重編程因子誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)模式的差異:(A)顯示與媒介物相比，在逆轉(zhuǎn)錄病毒或CPP-S0X2處理之后，所選多能基因(Sox2、0ct4、Nanog)和 Sox2 相關(guān)基因(Jarid2、Zic2、bMyb)隨時間推移(第 0_6天)的表達(dá)強(qiáng)度的熱圖。媒介物或不相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)筑體(pMX-GFP)對基因表達(dá)無影響。逆轉(zhuǎn)錄病毒Sox2使得六種基因中每一者的表達(dá)早期增加隨后降低。CPP-S0X2使得基因表達(dá)增加延遲。(B)顯示所選多能基因(Sox2、0ct4、Nanog)和0ct4相關(guān)基因(Tcf4、GAP43)隨時間推移(第0-6天)的表達(dá)強(qiáng)度的熱圖。
[0023]圖9.不相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體促進(jìn)CPP誘導(dǎo)的基因表達(dá):(A-B)在pMX_Sox2 (紅線)、CPP-S0X2 (藍(lán)線)或pMX-GFP+CPP-S0X2 (綠線)處理之后，Jarid2和Zic2的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(C)顯示在各條件下所選基因隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。(D-E)在 pMX-0ct4、CPP-0CT4 或 pMX-GFP+CPP_0CT4 處理之后，Tcf4 和 GAP43 的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。
[0024]圖10.非整合pMX-GFP促進(jìn)CPP-0CT4誘導(dǎo)的基因表達(dá):(A)經(jīng)pMX_GFP突變體(上)或pMX-GFP wt (下)感染的BJ成纖維細(xì)胞的免疫熒光圖像。(B-E)在pMX-GFP (紅線)，pMX-GFP+CPP-0CT4 (藍(lán)線)，pMX-GFP 突變體(綠線)或 pMX-GFP 突變體 +CPP-0CT4 (紫線)處理之后，0ct4、Sox2、Nanog和TLR3的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。
[0025]圖11.逆轉(zhuǎn)錄病毒GFP/0CT4/S0X2感染刺激先天免疫。在pMX_0ct4、pMX_Sox2、pMX-GFP、pMX-GFP+CPP-0CT4、pMX_GFP+CPP_S0X2、CPP-0CT4 或 CPP-S0X2 之后，先天免疫相關(guān)基因STAT1、STAT2、IFN β、NF- κ B、TLR3和TLR4的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。
[0026]圖12.TLR3信號傳導(dǎo)的基因敲低使多能基因表達(dá)降低(與圖3相關(guān)):㈧在用TRIF-抑制肽(肽抑制劑-TRIF)處理的成纖維細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒-0ct4(pMX-0ct4)感染之后，Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表達(dá)降低。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞中，在pMX-0ct4感染之后，Tcf4、NF-KB或TLR3的基因表達(dá)降低。(C)在TLR3shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞中，在pMX-0ct4感染之后，Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表達(dá)降低。
[0027]圖13.MyD88的抑制不影響pMX_0ct4誘導(dǎo)的基因表達(dá):(A)在用MyD88_抑制肽(肽抑制劑_MyD88)處理的成纖維細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒_0ct4 (pMX-0ct4)感染之后，0ct4、Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表達(dá)保持不變。(B)在MyD88 shRNA基因敲低成纖維細(xì)胞中，在pMX-0ct4感染之后，0ct4、Tcf4、NF- κ B或TLR3的基因表達(dá)保持不變。
[0028]圖14.聚1:C使先天免疫基因的表達(dá)增強(qiáng)。在聚1:C、聚1:C+CPP-0CT4或聚1: C+CPP-S0X2 之后，先天免疫相關(guān)基因 STAT1、STAT2、IFN β、NF_k B、TLR3 和 TLR4 的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。
[0029]圖15.聚1: C通過TLR3使CPP誘導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng):(A-B)在pMX_Sox2 (紅線)、CPP-S0X2 (藍(lán)線)或聚1:C+CPP-S0X2 (綠線)處理之后，Zic2和Nanog的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。(C)顯示在各條件下所選基因隨時間推移的平均倍數(shù)變化的概括圖。(D、E)在pMX-0ct4、CPP0CT4或聚1: C+CPP-0CT4處理之后，Tcf4和GAP43的基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)變化。
[0030]圖16.在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的次級MEF系統(tǒng)中的重編程。強(qiáng)力霉素處理的MEF的形態(tài)變化。聚1:c以及pMX-GFP促進(jìn)在第3天孔中聚集小而緊密的圓形細(xì)胞的變化。用pMX-GFP感染促進(jìn)集落形成，因為在病毒粒子感染組中第7天觀察到許多小集落。在第14天，典型mES樣集落出現(xiàn)，其中許多具有激活的SSEA-1。
[0031]圖17.聚1:C/病毒粒子早期促進(jìn)表觀遺傳修飾(第2天):(A)用于評估在暴露于各種處理條件第2天0ct4啟動子的H3K4me3的芯片分析。用pMX-GFP或用聚1:C刺激TLR3沒有效果，CPP-S0X2也沒有效果。然而，與pMX-GFP或與聚1: C組合，細(xì)胞穿透肽CPP-S0X2與逆轉(zhuǎn)錄病毒Sox2 (pMX-Sox2)的效果相似。(B)用于評估在暴露于各種處理條件的第2天