未受刺激；黑色 柱）、以PHA刺激（白色柱）、或以抗-⑶3/28活化珠粒處理（灰色柱），且以MSC-CM處理或 否；或第7D圖：重組人類HGF(rhHGF) ;n = 15。將經(jīng)刺激之外周血白細(xì)胞之增殖作用設(shè)定 為100 %，其定義為以流式細(xì)胞儀分析經(jīng)CFSE染色之外周血白細(xì)胞有>90 %產(chǎn)生細(xì)胞分裂； 于第7A圖：a，p〈0. 01及b，p〈0. 05與對(duì)照組相較；c，p〈0. 05與經(jīng)PHA活化之外周血白細(xì)胞 并以MSC-CM處理。于第7D圖：a，p〈0. 05 ;b，p〈0. 05與經(jīng)PHA活化之外周血白細(xì)胞并以HGF 處理。第7B圖：細(xì)胞因子之細(xì)胞因子定量陣列檢測(cè)，產(chǎn)自間充質(zhì)干細(xì)胞（黑色柱）、外周血 白細(xì)胞（白色柱）、外周血白細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)（灰色柱）、經(jīng)抗-CD3/28活化之 外周血白細(xì)胞（斜線柱）、及經(jīng)抗-CD3/28活化之外周血白細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)（斑 點(diǎn)柱），培養(yǎng)3天，n = 1。第7C圖：間充質(zhì)干細(xì)胞之細(xì)胞因子及基質(zhì)相關(guān)因子分泌之細(xì)胞 因子定量陣列檢測(cè)。第7E圖：于間充質(zhì)干細(xì)胞、以HGF-siRNA處理之間充質(zhì)干細(xì)胞、以無標(biāo) 的siRNA處理之間充質(zhì)干細(xì)胞之條件培養(yǎng)基中之HGF生成之ELISA測(cè)定結(jié)果，n = 10。第 7F圖：經(jīng)抗-⑶3/28活化之外周血白細(xì)胞之增殖，單獨(dú)培養(yǎng)或與經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染之間充質(zhì)干 細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)，以流式細(xì)胞儀分析CFSE，n = 9 ;a，p〈0. 05與經(jīng)抗-⑶3/28活化之外 周血白細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)者比較。除非另有說明，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)之平均，并以平均值土SEM表示；t, P〈〇. 〇1 ;*，P〈〇. 〇〇1，除非另行說明，否則均與對(duì)照 組比較。
[0021] 第8圖顯示⑶14+單核細(xì)胞為HGF對(duì)T淋巴細(xì)胞功能之免疫調(diào)節(jié)作用所必須。 第8A&8B圖：c-Met之表達(dá)，于T淋巴細(xì)胞株（Jurkat)、單核細(xì)胞株（U937)、及從外周血白 細(xì)胞所純化之初級(jí)⑶14+細(xì)胞（B ;n = 7) ;MFI，熒光強(qiáng)度平均值。第8C圖：外周血白細(xì) 胞（白色柱）或去除⑶14+細(xì)胞之外周血白細(xì)胞（黑色柱）單獨(dú)培養(yǎng)或經(jīng)抗-⑶3/28珠 粒刺激，經(jīng)rhHGF處理或否；n = 15。經(jīng)rhHGF處理之外周血白細(xì)胞之增殖程度，以對(duì)經(jīng) 抗-⑶3/28-活化之外周血白細(xì)胞或去除⑶14+細(xì)胞之外周血白細(xì)胞之相對(duì)百分比呈現(xiàn)； a, p〈0. 01 ;b，p〈0. 05與以HGF處理之經(jīng)抗-⑶3/28-活化之外周血白細(xì)胞相較。第8D圖： ⑶4+T細(xì)胞之增殖，單獨(dú)培養(yǎng)或經(jīng)抗-⑶3/28珠粒刺激，經(jīng)rhHGF處理之⑶14+細(xì)胞處理或 否，培養(yǎng)72小時(shí)（⑶14+與⑶4+T細(xì)胞之比例：1/10、1/5、1/2、1/1)。將經(jīng)刺激之⑶4+T細(xì)胞 之增殖作用設(shè)定為100 %，其定義為以流式細(xì)胞儀分析經(jīng)CFSE染色之⑶4+T細(xì)胞有>90 % 產(chǎn)生細(xì)胞分裂；a, p〈0. 05線性趨勢(shì)。第8E圖：與經(jīng)rhHGF處理之⑶14+細(xì)胞共培養(yǎng)與否之 經(jīng)抗-⑶3/28-活化之⑶4+T細(xì)胞之IFN-y、IL-4及IL-13之胞內(nèi)生成。T細(xì)胞之總數(shù)設(shè)為 100%。除非另有說明，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之平均，并以平均值土SEM表示； #，p〈0. 05 ;*，p〈0. 001，除非另行說明，否則均與對(duì)照組比較。
[0022] 第9A圖顯示⑶14+細(xì)胞上表達(dá)之樹突細(xì)胞（DC) -及巨噬細(xì)胞-相關(guān)之表面分子， 以rhHGF處理（灰色及斜線柱）、未以rhHGF處理（黑色柱），以流式細(xì)胞儀分析72小時(shí)培 養(yǎng)物。同位素對(duì)照組（白色柱）之MFI表達(dá)量設(shè)為1。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 之平均，并以平均值土SEM表示。第9B圖顯示外周血白細(xì)胞上之⑶14及⑶16之表達(dá)，以 rhHGF處理或否，以流式細(xì)胞儀分析，n = 8。
[0023] 第10圖顯示HGF系增加單核細(xì)胞中IL-10生成量。第10A圖：Thl/2之細(xì)胞因 子圖譜，CD14+細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)3日（白色柱）、與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)3日（黑色柱），以細(xì) 胞因子定量陣列檢測(cè)（n = 1)。第10B圖：⑶14+細(xì)胞之IL-10生成量，以rhHGF、MSC-CM、 siHGF-MSC-CM處理或否，以ELISA測(cè)量。第10C圖：接受rmHGF注射之小鼠之骨髓及脾細(xì) 胞之產(chǎn)生IL-10之單核細(xì)胞群（IL10+⑶llb+細(xì)胞）。細(xì)胞總數(shù)設(shè)為100%。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 均來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之平均，并以平均值土SEM表示；#，p〈0. 05 ;除非另行說明，否則均與 對(duì)照組比較。
[0024] 第11圖顯示⑶14+單核細(xì)胞經(jīng)HGF誘導(dǎo)之IL-10生成系經(jīng)由ERK1/2途徑所調(diào) 控。第11A圖：以RT-PCR于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)經(jīng)rhHGF處理之U937細(xì)胞之IL-10表達(dá)，并以 0-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照組。第11B圖：以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)經(jīng)rhHGF處理之U937細(xì)胞 之磷酸化之（P_) ERK1/2、p-STAT3、p-p38、及 p-AKT 之表達(dá)，并以 ERK1/2、STAT3、p38、AKT、 及a-微管蛋白作為內(nèi)部對(duì)照組。第11C圖：經(jīng)rhHGF處理，并以ERK1/2抑制劑U0126、 P38MAPK抑制劑SB203580、或STAT3抑制劑cpdl88預(yù)處理之U937細(xì)胞之IL-10基因表達(dá)， 以RT-PCR檢測(cè)。第11D圖：以抑制劑U0126或SB203580預(yù)處理，并以rhHGF處理（黑色 柱）或未以rhHGF處理（白色柱）之U937細(xì)胞之IL-10蛋白質(zhì)表達(dá)；n = 3 ;數(shù)據(jù)以平均值 土SEM表現(xiàn)；卞，p〈0. 01 ;*，p〈0. 001，與對(duì)照組相較。
[0025] 第12圖顯示HGF在⑶14+單核細(xì)胞中誘發(fā)IL-10生成之機(jī)制。
[0026] 發(fā)明詳述
[0027] 本發(fā)明系提供一種產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之方法，包括：以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)處 理外周單個(gè)核細(xì)胞，以誘發(fā)該外周單個(gè)核細(xì)胞分化成免疫調(diào)節(jié)性白細(xì)胞。
[0028] 該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)可為重組蛋白質(zhì)，亦可為天然蛋白質(zhì)，例如由間充質(zhì)干 細(xì)胞或其它細(xì)胞系所產(chǎn)生。于一實(shí)施例中，HGF來自間充質(zhì)干細(xì)胞，HGF為一種來自間充質(zhì) 干細(xì)胞之分泌蛋白質(zhì)。于一實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，舉例但非限制，例如： 人、猴、大鼠、小鼠、豬、兔、狗、貓等。
[0029] 于本發(fā)明之方法中，可藉由提供HGF或提供間充質(zhì)干細(xì)胞與外周單個(gè)核細(xì)胞接觸 而達(dá)成HGF療法。于一實(shí)施例中，該外周單個(gè)核細(xì)胞可與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，間充質(zhì)干 細(xì)胞產(chǎn)生HGF并將其分泌至環(huán)境。
[0030] 用于誘導(dǎo)之HGF之濃度可為，舉例但非限制，例如每毫升培養(yǎng)基中為3-40納克 (ng)。于一實(shí)施例中，HGF 之濃度可為 5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ ml、40ng/ml或介于上述任兩數(shù)值之間。于一實(shí)施例中，以5_30ng/ml為佳，以10_30ng/ml 為較佳。
[0031] 于本發(fā)明中，該外周單個(gè)核細(xì)胞意指具有圓形細(xì)胞核之任何血液細(xì)胞。該外周單 個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性球、及樹突細(xì)胞。該淋巴細(xì)胞由T細(xì) 胞、B細(xì)胞及天然殺傷淋巴細(xì)胞所組成。于一實(shí)施例中，該外周單個(gè)核細(xì)胞來自一哺乳動(dòng)物。
[0032] HGF可誘導(dǎo)該外周單個(gè)核細(xì)胞分化成免疫調(diào)節(jié)性白細(xì)胞，例如骨髓衍生的抑制 細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，以下有時(shí)簡(jiǎn)稱MDSC或MDSC)、單核細(xì)胞等。 于一實(shí)施例中，該免疫調(diào)節(jié)性白細(xì)胞可抑制經(jīng)活化之同種異體淋巴細(xì)胞（allogeneic lymphocyte)之增殖。
[0033] 該骨髓衍生的抑制細(xì)胞具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，包含例如產(chǎn)生精氨酸酶、產(chǎn)生一 氧化氮合酶、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞等。于一實(shí)施例中，MDSC可表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記⑶lib及⑶33,且 不表達(dá)⑶14 ;亦即，該骨髓衍生的抑制細(xì)胞表現(xiàn)為⑶14_CD1 lb+⑶33+。于一實(shí)施例中，藉由 應(yīng)用本發(fā)明之方法，MDSC之量可增加約1. 5至5倍。于一實(shí)施例中，在未經(jīng)處理之外周單 個(gè)核細(xì)胞中存在微量MDSC，例如約1%，而經(jīng)HGF處理后可擴(kuò)增至約3%以上。于一實(shí)施例 中，MDSC可擴(kuò)增成該外周單個(gè)核細(xì)胞之約3-10%，以約3-5 %為較佳。
[0034] 該單核細(xì)胞具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，包含例如產(chǎn)生IL-10、產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因 子、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，使其傾向Th2優(yōu)勢(shì)型反應(yīng)（Th2-dominant response)等。尤其是， 藉由應(yīng)用本發(fā)明之方法，可誘導(dǎo)該單核細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-10(亦即，IL10+)。于一實(shí)施 例中，經(jīng)誘導(dǎo)之單核細(xì)胞亦可表達(dá)⑶14,而不表達(dá)⑶16;亦即，該經(jīng)誘導(dǎo)之單核細(xì)胞表 現(xiàn)為CD14+CD16_IL10+。于一實(shí)施例中，藉由本發(fā)明之方法所產(chǎn)生的CD14+CD16_IL10+單 核細(xì)胞可占外周單個(gè)核細(xì)胞之約3%以上，而在未經(jīng)處理之外周單個(gè)核細(xì)胞中則不存在 ⑶14+CD16_IL10+，僅有⑶14+CD16_IL10_單核細(xì)胞存在。于一較佳實(shí)施例中，以該外周單個(gè)核 細(xì)胞總量為基礎(chǔ)計(jì)算，該⑶14+⑶16_IL10+單核細(xì)胞為約5%。
[0035] 本發(fā)明亦提供一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，系依據(jù)前述方法所制備。該免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞 衍生自外周單個(gè)核細(xì)胞，藉由將該外周單個(gè)核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)、及/或以 間充質(zhì)干細(xì)胞分泌之HGF處理，藉此可誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用。于一實(shí)施例中，該免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞為⑶14_CDllb+⑶33+骨髓衍生的抑制細(xì)胞。于另一實(shí)施例中，該免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞為 ⑶14+CD161L10+單核細(xì)胞。
[0036] 本發(fā)明系提供一種可簡(jiǎn)單、直接且迅速地由外周單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之 方法。該方法可進(jìn)一步應(yīng)用于產(chǎn)生可臨床應(yīng)用于自體免疫疾病及器官移植之移植物排斥的 免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療由異常免疫反應(yīng)所致疾病之方法。該由異常免 疫反應(yīng)所致疾病，例如：器官移植之移植物排斥、或自體免疫疾病，包括：系統(tǒng)性紅斑 狼瘡（system lupus erythematosus)、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis)、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis)、1型糖尿?。╰ypeldiabetes mellitus)、乳糜瀉 (coeliac disease)、干燥綜合征（Sjdgren'Ssyndrome)、橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis)、葛瑞夫茲氏癥（Graves' disease)、特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura)等。
[0038] 于此治療方法中，對(duì)患有該疾病之患者施用HGF。該患者可為哺乳動(dòng)物。于一實(shí)施 例中，所施用之HGF為蛋白質(zhì)型式，以間充質(zhì)干細(xì)胞分泌之HGF為佳，以人類來源之間充質(zhì) 干細(xì)胞分泌之HGF為更佳。于另一實(shí)施例中，亦可提供一間充質(zhì)干細(xì)胞，其