組織工程表皮質(zhì)量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種組織工程表皮質(zhì)量檢測(cè)方法，尤其涉及一種黑色素和角質(zhì)細(xì)胞均 勻度、以及安全性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 創(chuàng)面是機(jī)體由于內(nèi)在或外在的因素導(dǎo)致皮膚完整性的喪失，其修復(fù)一直以來是臨 床中的主要問題，臨床按時(shí)間可分為急性創(chuàng)面及慢性創(chuàng)面。急性創(chuàng)面包括燒傷、創(chuàng)傷等重大 疾病或者瘢痕、皮膚色素性疾病、良惡性腫瘤等手術(shù)切除后形成的皮膚缺損；而慢性創(chuàng)面包 括外傷性潰瘍、糖尿病型潰瘍、血管性潰瘍、壓力性潰瘍、放射性潰瘍、腫瘤性潰瘍、瘢痕性 潰瘍等等。
[0003] 目前修復(fù)皮膚缺損最有效的方法是自體皮膚移植，但大面積燒傷自體皮源常常不 能滿足治療需要，且這種方法在供皮區(qū)會(huì)造成新的損傷。同種異體皮、異種皮作為暫時(shí)性皮 膚替代物雖然可以用于治療皮膚缺損創(chuàng)面，但由于免疫排斥等因素?zé)o法達(dá)到自體皮一樣的 效果，而僅僅能起到覆蓋保護(hù)創(chuàng)面的作用。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程皮膚作為永 久性皮膚替代物，其研究得到了很大的發(fā)展。
[0004] 表皮細(xì)胞是皮膚表層的上皮細(xì)胞，主要由角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞及麥 克爾細(xì)胞組成，其在創(chuàng)傷愈合中起至關(guān)重要的作用。其中基底層黑色素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的 含量比為1:5~1:100。最早獲得美國(guó)FDA認(rèn)證的皮膚和真皮組織的產(chǎn)品，包括Apligraf、 Integraf和Dermagraf三種產(chǎn)品。現(xiàn)今，組織工程皮片在臨床上使用越來越多，其質(zhì)量和安 全性檢測(cè)則尤為重要，傳統(tǒng)檢測(cè)方法有單獨(dú)運(yùn)用D0PA染液染色來進(jìn)行黑色素細(xì)胞的鑒定， 蘇木精對(duì)一般細(xì)胞的細(xì)胞核染色，以及生物安全性如無菌性、支原體和內(nèi)毒素的檢測(cè)，但是 目前我國(guó)對(duì)于臨床用組織工程表皮還沒有完整獨(dú)立的質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)目前缺乏系統(tǒng)的組織工程表皮質(zhì)量和安全性檢測(cè)方法的問題，本發(fā)明提供了 一種組織工程表皮檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的組織工程表皮檢測(cè)方法，步驟包括：
[0007] 組織工程表皮從培養(yǎng)基中分離，進(jìn)行D0PA染色和蘇木素染色檢測(cè)；
[0008] 取培養(yǎng)基在36_38°C進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌性檢測(cè)；
[0009] 取培養(yǎng)組織工程表皮的最后一次培養(yǎng)的培養(yǎng)基，進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)；
[0010] 取培養(yǎng)組織工程表皮的最后一次培養(yǎng)的培養(yǎng)基，采用鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測(cè)。
[0011] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述組織工程皮膚在染色前，進(jìn)行預(yù)處理的步驟，所述 預(yù)處理包括甲醛固定、漂洗步驟。
[0012] 其中，所述甲醛可以是源自甲醛、多聚甲醛、或其溶液中的任意一種或幾種，并優(yōu) 選為甲醛溶液、多聚甲醛溶液中的任意一種或幾種。
[0013] 其中，以甲醛計(jì)，所述甲醛溶液、多聚甲醛溶液中的任意一種或幾種的質(zhì)量濃度優(yōu) 選為1-10 %，更優(yōu)選為2-8 %，更優(yōu)選為4-6 %。
[0014] 其中，所述甲醛固定的時(shí)間優(yōu)選為1-30分鐘，更優(yōu)選為2-25分鐘，更優(yōu)選為5-20 分鐘，更優(yōu)選為1〇 _15分鐘。
[0015] 其中，所述漂洗優(yōu)選為采用磷酸緩沖液漂洗。
[0016] 其中，所述磷酸緩沖液pH值優(yōu)選為7. 0-7. 6,更優(yōu)選為7. 2-7. 6。
[0017] 其中，漂洗后還包括干燥的步驟，所述干燥優(yōu)選為在5_35°C條件下干燥，更優(yōu)選為 10-25°C條件下干燥，更優(yōu)選為15-20°C條件下干燥。
[0018] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述D0PA染色和蘇木素染色順序優(yōu)選為：D0PA染色， 然后蘇木素染色。
[0019] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述D0PA染色優(yōu)選為在36-38°C條件下進(jìn)行，更優(yōu)選 為36.5-37°C條件下進(jìn)行。
[0020] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述D0PA染色過程中，優(yōu)選地染色時(shí)間為1-12小時(shí)， 更優(yōu)選為2-10小時(shí)，更優(yōu)選為3-8小時(shí)，更優(yōu)選為5-6小時(shí)。
[0021] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述D0PA染色過程中，D0PA染液優(yōu)選為至少包括D0PA 和磷酸緩沖液。所述磷酸緩沖液pH值優(yōu)選為7. 0-7. 6,更優(yōu)選為7. 2-7. 6。
[0022] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，D0PA染液質(zhì)量濃度優(yōu)選為0. 01-1 %，更優(yōu)選為 0. 05-0. 5 %，更優(yōu)選為 0. 1-0. 2 %。
[0023] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述蘇木素染色過程中，優(yōu)選地染色時(shí)間為1-10分 鐘，更優(yōu)選為2-8分鐘，更優(yōu)選為3-5分鐘。
[0024] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述無菌性檢測(cè)前，培養(yǎng)基優(yōu)選為培養(yǎng)時(shí)間為12-48 小時(shí)，更優(yōu)選為18-36小時(shí)，更優(yōu)選為24-30小時(shí)。
[0025] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述無菌性檢測(cè)前，培養(yǎng)基優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為 36. 5-37。。。
[0026] 本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述內(nèi)毒素檢測(cè)可以是選自：鱟試劑凝膠法、鱟試劑動(dòng) 態(tài)濁度法、鱟試劑終點(diǎn)濁度法、鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法和鱟試劑終點(diǎn)顯色法中的任意一種或幾 種。
[0027] 所述鱟試劑可以是美洲鱟試劑、東方鱟試劑中的任意一種或幾種。
[0028] 本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述組織工程表皮中，黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞比例優(yōu)選為 1: (1-150)，更優(yōu)選為 1: (5-100)，更優(yōu)選為 1: (10-80)。
[0029] 本發(fā)明提供了一種能夠檢測(cè)臨床用組織工程皮片的基底層黑色素細(xì)胞含量、皮片 的均勻度及安全性的方法，包括：黑色素細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)（D0PA染色和蘇木素染色 檢測(cè)）和無菌性檢測(cè)、支原體檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)。通過對(duì)黑色素細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核的染 色可以看出黑色素細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞的分布，從而看出黑素細(xì)胞的均勻度、皮片的均勻度及 基底層黑色細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的比例；通過無菌性檢測(cè)、支原體檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)等方法檢測(cè) 組織工程表皮的生物安全性。
[0030] 因此，本發(fā)明作為一種臨床用組織工程皮片的質(zhì)量檢測(cè)方法，能夠?qū)M織工程皮 片的質(zhì)量有較全面的監(jiān)控，確保為患者提供的是合格安全的皮片。
【附圖說明】
[0031] 圖1為實(shí)施例1中D0PA和蘇木素染色鏡檢結(jié)果；
[0032] 圖2為實(shí)施例1中支原體PCR檢測(cè)電泳分析圖；
[0033] 圖3為實(shí)施例2中D0PA和蘇木素染色鏡檢結(jié)果；
[0034] 圖4為實(shí)施例2中支原體PCR檢測(cè)電泳分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 此：
[0036] 實(shí)施例1 :
[0037] 取（人）健康男性包皮環(huán)切手術(shù)后的包皮皮膚，用面積為2cm2左右的皮膚樣本提 取角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞并培養(yǎng)，此批組織工程皮片分別是在4個(gè)0100的表皿中成皮。隨 機(jī)抽取一塊皮片進(jìn)行黑色素細(xì)胞及皮片均勻度的檢測(cè)，所有皮片均進(jìn)行生物安全性檢測(cè)。 實(shí)施方法及結(jié)果如下：
[0038] (1)D0PA染液的配制
[0039] 用pH為7. 2-7. 6的磷酸緩沖液，將D0PA粉末配制成終濃度為0. 1 %，室溫下在磁 力攪拌器上攪拌30min溶解既得。
[0040] (2) D0PA 染色
[0041] 從培養(yǎng)的組織工程表皮中隨機(jī)抽取一塊，用4%的甲醛固定皮片10分鐘，用pH為 7. 2-7. 6的磷酸緩沖液進(jìn)行