對克雷伯菌k44，k59，k61和k63特異的核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型特異的核苷酸，尤其涉及對克 雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型K抗原基因簇中單個基因特異的核苷酸及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 克雷伯氏菌為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，在人類呼吸道、腸道、動 物腸道中最為常見。常常引起人類的多種疾病，尤其是肺炎克雷伯氏菌；也是自然界水和土 壤中的機(jī)會致病菌。其中肺炎克雷伯氏菌（又稱肺炎桿菌）、臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬結(jié)克雷 伯氏菌與人類關(guān)系最為密切，尤其是肺炎克雷伯氏菌，它們所導(dǎo)致的疾病占所有克雷伯氏 菌屬感染的95%以上。
[0003] 細(xì)菌分型與鑒定方法主要有傳統(tǒng)的表型方法、血清學(xué)方法以及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型這 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，不 同的K抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清 鑒定方法成為發(fā)展方向。
[0004] 克雷伯氏菌的表面抗原，既有0抗原也有K抗原，但是主要用K抗原進(jìn)行分型，并 且K抗原研究的比較透徹。在克雷伯氏菌所有K抗原中，共描述了82種，但是只有77種組 成了國際上識別莢膜抗原機(jī)制的基礎(chǔ)。盡管克雷伯氏菌也有12種0抗原，但是因?yàn)槟蜔岬?莢膜多糖的存在，很難測定它們的結(jié)構(gòu)并加以區(qū)分。相反，K抗原產(chǎn)量高，并且可以區(qū)分大 部分的臨床分離菌株。由于高度的可區(qū)分性以及重復(fù)性，這種分類方法一直是研究菌株間 流行病學(xué)關(guān)系的首選方法，并且在比對來自不同地方不同時間的菌株方面尤為有用。對于 其分子鑒定也越來越受到人們的重視，分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有速度快且易于大規(guī)模使用 的優(yōu)點(diǎn)，是目前國際上公認(rèn)的致病菌檢測的發(fā)展方向。
[0005] 近年來，越來越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)（ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態(tài)性（RFLP)分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于克雷伯菌的快速血清分型篩查，穩(wěn)定的 鑒定結(jié)果可以彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PCR)的分子檢測技術(shù)，不需要經(jīng)過病原菌的分離、純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈 敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術(shù)）作為微生物 檢測技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備 細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過程僅需1個半小時。這對檢驗(yàn)檢疫部 門和臨床檢驗(yàn)無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了本發(fā)明涉及對克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特異 的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1)SEQIDN0:1-8所示的核苷酸中的至少一種； 2) 與SEQIDN0:1-8所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種；所述的SEQIDN0:1-8 如下：
本發(fā)明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDN0:1-4所示的核苷酸中的至少一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mMdNTP30y1 ; 10X酶特異性反應(yīng)緩沖液50y1 ;5U/y1耐熱DNA聚合酶5y1 ;引物混合 物10y1 ;陽性對照品10y1;陰性對照品10y1 ;ddH2〇 5ml。
[0008] 其中所述的PCR引物優(yōu)選為所述如SEQIDNO: 1-14所示的核苷酸中的至少一種。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了對克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型特異的SEQID NO: 1-14核苷酸在制備用于檢測克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型的PCR試劑盒。
[0010] 本發(fā)明所述克雷伯菌指的是取樣于腹瀉大便、尿道感染、傷口和腦膜炎標(biāo)本培養(yǎng) 物的粗提液或是克雷伯菌的純培養(yǎng)物的粗提液。收集克雷伯菌提取基因組是采用常規(guī)方法 制備獲得。
[0011] 針對克雷伯菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預(yù)處理一擴(kuò)增一電泳檢測結(jié) 果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理后的樣 本加入擴(kuò)增管啟動擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡單快速的完成檢測工作。
[0012] 本發(fā)明還提供一種液相檢測芯片，包括液相磁珠和連接在液相磁珠上的寡核苷酸 探針，以及相應(yīng)探針?biāo)谄嗡鶎?yīng)的相應(yīng)引物；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQIDN0:1-8 所示的核苷酸。
[0013] 本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ IDN0:1-8所示的核苷酸。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了對克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特異的核苷酸在制備 用于檢測克雷伯菌PCR試劑盒、檢測克雷伯菌的基因芯片方面、檢測克雷伯菌微陣列方面 的應(yīng)用。所述的檢測克雷伯菌指的是檢測引起支氣管炎、重癥肺炎、泌尿系和創(chuàng)傷感染、敗 血癥、腦膜炎、腹膜炎的細(xì)菌。
[0015] 本發(fā)明公開的對克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特異的核苷酸與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)實(shí)用性強(qiáng) 本發(fā)明建立的一種PCR反應(yīng)體系，可檢測克雷伯菌，提供血清分型檢測所用到的特異 引物，利用該P(yáng)CR方法可以對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。
[0016] (2)準(zhǔn)確性高 本發(fā)明通過對克雷伯菌的各血清型特異的基因的PCR反應(yīng)，每個樣品得到一條目的條 帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可以得到克雷伯菌所屬的血清型。
[0017] (3)檢測成本相對較低 可以推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測、尚品監(jiān)測檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致 病菌檢測組合提供技術(shù)模式。
[0018]
【附圖說明】： 圖1表示本發(fā)明K44血清型特異引物檢測克雷伯菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，rzj基因P1和P2目的條帶為180bp，其余的血清型沒有任何條帶，具體菌株信息見表2; 圖2表示本發(fā)明K44血清型特異引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢測了 6株弧 菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發(fā)明K59血清型wzy基因P3和P4引物檢測克雷伯菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌 株電泳結(jié)果圖，wzy基因P4和P5篩選，目的條帶為140bp，其余血清型沒有任何條帶，具體 菌株信息見表2 ; 圖4表示本發(fā)K59血清型wzy基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中檢 測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表； 圖5表示本發(fā)K61血清型r幻基因P5和P6引物檢測克雷伯菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株電 泳結(jié)果圖，r幻基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為156bp，其余的血清型沒有任何條帶， 具體菌株信息見表2 ; 圖6表示本發(fā)明K61血清型r幻基因P5和P6引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖7表示本發(fā)明K63血清型r幻基因P7和P8引物檢測克雷伯菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株 電泳結(jié)果圖，目的條帶為191bp，其余的血清型沒有任何條帶；具體菌株信息見表2 圖8表示本發(fā)明K63血清型r幻基因P7和P8引物種特異性的鑒定電泳結(jié)果圖，其中 檢測了 6株弧菌以及1株沙門菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶；具體菌株信息見表2。
[0019] 圖9表示分別用K44,K59,K61和K63特異引物擴(kuò)增對應(yīng)血清型的電泳結(jié)果圖，具 體菌株信息見表2 ; 其中：K44,K59,K61和K63表示相應(yīng)血清型引物擴(kuò)增結(jié)果，第一個泳道H是2000bp laddermarker〇
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件。其中克雷伯菌來源于澳大利亞是有澳大利亞悉尼大學(xué)Peter 教授提供。
[0021] 實(shí)施例1:基_組的提取 37°C營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)克雷伯菌，收集細(xì)菌，提取基因組具體步驟如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和 10ul0. 4MEDTA重懸細(xì)胞，37°C溫育 20 分鐘，然 后加入10ul10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3ul10mg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酚 抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清 液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中。基因組DNA通過0. 4%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
[0022] 實(shí)施例2:序列破譯 提取克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組，通過Solexapair-end測 序技術(shù)對克雷伯菌各個血清型基因組進(jìn)行全基因組測序獲得該血清型的序列，運(yùn)用Blast 及PSI-Blast進(jìn)行序列比對，采用TMHMM2. 0program進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，運(yùn)用ClustalW program進(jìn)行序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得克雷伯菌各個血清型的K抗 原基因簇序列及破譯結(jié)果。
[0023] 實(shí)施例3:引物設(shè)計(jì) 根據(jù)基因簇破譯情況，我們發(fā)現(xiàn)wzy和wzx基因確實(shí)是血清型特異的基因，所以選取該 基因特異區(qū)段設(shè)計(jì)特異引物。由于wzy更加特異，所以主要以wzy基因?yàn)榘谢颉?br>[0024] 引物設(shè)計(jì)是該發(fā)明的核心部分。設(shè)計(jì)引物根據(jù)文獻(xiàn)中敘述的特異基因來設(shè)計(jì)。w