一種克雷伯氏肺炎桿菌及其應用和一種生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體地，涉及一種克雷伯氏肺炎桿菌及其應用和一 種生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，可用作溶劑、抗凍劑、合成聚酯的單體以及合 成其他化學品的原料，特別是用作合成聚對苯二甲酸丙二酯的單體，其中，聚對苯二甲酸丙 二酯是一種性能優(yōu)良的聚酯材料，有著廣闊的應用前景。目前1，3-丙二醇的生產(chǎn)成本相對 較高，限制了聚對苯二甲酸丙二酯的推廣應用，且1，3-丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用化學 合成法。近年來已研發(fā)了通過生物法合成1，3-丙二醇的技術(shù)，其中，生物法合成1，3-丙二 醇利用甘油等可再生資源，具有綠色環(huán)保等優(yōu)勢，為1，3-丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種 新的選擇。
[0003] 美國杜邦公司開發(fā)了一種利用大腸桿菌工程菌株以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn) 1，3-丙二醇的方法。將來源于酵母的甘油合成途徑與來源于克雷伯氏肺炎桿菌的1，3-丙 二醇合成途徑轉(zhuǎn)入大腸桿菌，該工程菌株利用葡萄糖為原料，可以直接合成1，3-丙二醇， 并利用生產(chǎn)的1，3-丙二醇合成聚對苯二甲酸丙二酯，該技術(shù)獲得2003年美國總統(tǒng)綠色化 學獎。
[0004]自然界中很多野生微生物利用甘油為原料可以發(fā)酵合成1，3-丙二醇，包括丁酸 梭菌、梓檬酸菌、克雷伯氏肺炎桿菌、克雷伯氏產(chǎn)酸桿菌等。由于克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn) 1，3-丙二醇具有產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)強度大等優(yōu)點，是廣泛關(guān)注的一種1，3-丙二醇生產(chǎn)菌 株。但是克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油發(fā)酵合成1，3-丙二醇的過程中，還同時合成琥珀酸、 乳酸、乙酸、2, 3- 丁二醇、乙醇等副產(chǎn)物，影響甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度，同 時也為1，3-丙二醇的分離提取帶來負擔。利用現(xiàn)有技術(shù)中已有的克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵 合成1，3-丙二醇時，甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率一般僅為0. 30-0.42g/g，生產(chǎn)強度一般僅 為1. 0-1. 8gAL ? h)，甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度都有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種克雷伯氏肺炎桿菌及 其應用和一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，采用本發(fā)明的克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵合成1，3-丙 二醇時，能夠明顯降低副產(chǎn)物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率和 生產(chǎn)強度。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進行了大量的篩選實驗，結(jié)果篩選到一株在 發(fā)酵合成1，3-丙二醇時，能夠明顯降低副產(chǎn)物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙 二醇的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度的克雷伯氏肺炎桿菌，因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種克雷伯 氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，所述克雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2015108。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了上述克雷伯氏肺炎桿菌在生產(chǎn)1，3-丙二醇中的應用。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：將上述克 雷伯氏肺炎桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)以產(chǎn)生1，3-丙二醇。
[0009] 利用本發(fā)明的保藏號為CCTCC NO :M 2015108的克雷伯氏肺炎桿菌，以甘油為 原料生產(chǎn)1，3-丙二醇時，甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率可高達0. 54g/g，生產(chǎn)強度可高達 2. 59gAL ? h)，能夠明顯降低副產(chǎn)物乳酸和乙醇的濃度，明顯提高甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn) 化率和生產(chǎn)強度，且能夠大大降低分離提取1，3-丙二醇的負擔。
[0010] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0011] 生物保藏
[0012] 本發(fā)明的克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)于2015年3月13日被 保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（縮寫為CCTCC，地址：湖北省武漢市洪山區(qū)八一路武漢大 學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，郵政編碼：430072)，保藏編號為CCTCC NO :M 2015108。
【具體實施方式】
[0013] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0014] 第一方面，本發(fā)明提供了一種克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，該克 雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2015108。
[0015] 其中，本發(fā)明的克雷伯氏肺炎桿菌的分離過程可以包括：采集江蘇省張家港市水 稻種植田地表以下20厘米處的土壤樣品50-60g，用200-250ml蒸餾水懸浮混勾，將混合樣 品自然沉降1-2小時，然后取上清液100_150ml，在4000-6000rpm下離心20-30分鐘，倒去 上清液，用5-10ml無菌水重懸沉淀。將沉淀懸液涂布于固體培養(yǎng)基，在30-37°C培養(yǎng)24小 時。
[0016] 對于固體培養(yǎng)基的組成沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種固體培養(yǎng)基， 優(yōu)選情況下，以1L固體培養(yǎng)基計，所述固體培養(yǎng)基組成為：甘油40g，K 2HP04 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，檸檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和瓊脂粉20g。
[0017] 培養(yǎng)24小時后，挑選20-30個無絨毛、透亮、直徑為l-2mm的菌落。挑取各菌落并 分別接入至500ml錐形瓶中進行培養(yǎng)，每個錐形瓶中均裝有100-150ml發(fā)酵培養(yǎng)基，且均加 有0. 5-lg無菌碳酸鈣。培養(yǎng)時，恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速為150-250rpm，溫度為30-37°C，發(fā)酵培養(yǎng) 12小時后，通過氣相色譜儀和液相色譜儀對每個錐形瓶中的發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行 分析。
[0018] 其中，以1L發(fā)酵培養(yǎng)基計，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油40g，K2HP0 4 ? 3H20 3. 20g， KH2P04 1. 20g，NH4C1 2. 85g，Na2S04 0? 28g，MgS04 ? 7H20 0? 10g，檸檬酸 0? 42g，酵母膏 2. OOg 和微量元素〇. 3mL，其中，以1L微量元素計，微量元素的組成為：ZnCl2 7. 56g，F(xiàn)eCl3 ? 6H20 15. 65g，MnCl2 ? 4H20 6. 28g，CuC12 ? 2H20 1. 32g，CoC12 ? 6H20 6. 42g，H3B03 0? 48g 和 Na2Mo04 ? 2H20 3. 22g〇
[0019] 其中，氣相色譜儀（型號為GC-2014C，購自日本島津公司），色譜柱采用毛細管 柱AT. SE-54(30mX0. 53mmX1.0ym)，F(xiàn)ID檢測器，N2載氣，柱溫為120°C，檢測器溫度為 250 °C〇
[0020] 液相色譜儀（型號為LC-20A，購自日本島津公司），色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-Aq(4. 6mmX 150mmX5 y m)，流動相為 0? 005mol/L H2S04,流速為 1.0ml/min，柱溫箱為 65°C〇
[0021] 其中，一個錐形瓶中的發(fā)酵液的檢測結(jié)果為：甘油為11. lg/L，l，3-丙二醇為 16. 3g/L，2, 3- 丁二醇為0. 4g/L，乙醇為0. lg/L，乳酸為0. 4g/L，乙酸為0. 5g/L，琥珀酸為 0. lg/L。原料甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率為0. 56g/g。甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率的計 算公式為：
[0022] 發(fā)酵結(jié)束時1，3 -丙二醇的最終濃度Q /乃x發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液的體積U) 發(fā)酵過程中消耗的甘油總量(g) °
[0023] 將該菌落提取菌株總DNA，進行16sRNA基因序列分析，其16sRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示，結(jié)果表明該菌為克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae)，命名為克雷 伯氏肺炎桿菌HM-B2。將該克雷伯氏肺炎桿菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為 CCTCC NO :M 2015108。
[0024] 第二方面，本發(fā)明提供了上述克雷伯氏肺炎桿菌在生產(chǎn)1，3-丙二醇中的應用。
[0025] 第三方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：將上述克 雷伯氏肺炎桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)以產(chǎn)生1，3-丙二醇。
[0026] 本發(fā)明的生產(chǎn)1