肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法及所用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法及所用引物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎克雷伯氏菌(K.pnenmoniae)是一種G-桿菌,屬于腸桿菌科,條件性致病菌。肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌在普通的營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基上具有極高的相似性，細菌的形態(tài)、顏色、氣味都很相近，革蘭氏染色鏡撿中都是短小的G-小桿菌。在常規(guī)的細菌培養(yǎng)中很難將肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌區(qū)別開來，而做細菌的生化鑒定和16sRNA鑒定需要比較長的時間，約3-4天的時間。如果做16sRNA鑒定還需要進行測序，成本比較高。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然簡化了操作過程，縮短了檢測的時間，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，一般的實驗室不配備。另外，毛皮動物克雷伯氏菌病以支氣管炎、肺炎，敗血癥，腦膜炎，腹膜炎，腹瀉等為主要癥狀；與綠膿桿菌也引起的肺炎的癥狀相同。每年綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌引發(fā)的水貂肺炎不計其數(shù)，在獸醫(yī)臨床中十分常見?？梢姼涌焖俚膶⒎窝卓死撞暇c大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開是十分重要的。所以，目前急需要一種比較簡單可行的實驗室檢測的方法將肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開來。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明通過創(chuàng)造勞動獲取了兩對引物(人工合成基因序列)，采用該引物對肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物為肺炎克雷伯氏菌的特異性序列；從而能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c大腸桿菌和綠膿桿菌區(qū)分開。
[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于PCR擴增、能將肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開的引物。
[0005]一種用于鑒定肺炎克雷伯氏菌的引物，包含引物對Kl或/和引物對K2 ；
其中，Kl包括Kl-F和Kl-R，K2包括K2-F和K2-R ；
所述Kl-F、Kl-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分別為序列表中的SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4。
[0006]Kl-F 為:5- CGATGCTACTTATCCCGACA- 3，如 SEQ ID N0.1 所示，
Kl-R 為:5- ACCACCAGCAGACGAACTT- 3，如 SEQ ID N0.2 所示；
K2-F 為:5- CGGAGCGTTTTTCAATCGG- 3，如 SEQ ID N0.3 所示，
K2-R 為:5- TGAGCGGGTAATAAATGCGG- 3，如 SEQ ID N0.4 所示。
[0007]所述引物對Kl和所述引物對K2可獨立包裝，也可混合之后包裝。
[0008]用上述引物對待測樣品進行PCR擴增，得到、且唯一得到大小為303bp的PCR擴增產(chǎn)物，測序結(jié)果如SEQ ID N0.5所示。經(jīng)研究比對發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物為肺炎克雷伯氏菌溶血蛋白基因序列中的其中一段。雖然，溶血蛋白基因序列通常不具備特異性，但是將本發(fā)明的擴增產(chǎn)物與大腸桿菌、綠膿桿菌的基因序列對比發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物相對于大腸桿菌、綠膿桿菌的基因序列具備特異性，能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開。
[0009]本發(fā)明的第二個目的是提供一種能將肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開的檢測試劑。
[0010]本發(fā)明的檢測試劑，包含上述引物；還包含PCR試劑。
[0011]所述PCR試劑是指在聚合酶鏈式反應(yīng)中所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCljP PCR反應(yīng)緩沖液等。
[0012]肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法，用上述引物或檢測試劑對待測樣品進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；用瓊脂糖凝膠電泳或測序法檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0013]具體的為:取4yL待測樣品、4yL引物對Kl或/和引物對K2(上下引物各2yL)和25 μ L PCR試劑，用滅菌雙蒸水補充至50 μ L ;第一步，94°C預(yù)變性5min ;第二步，94°C變性30s ;第三步，58°C退火30s ;第四步，72°C延伸Imin ;第二步到第四步共進行35個循環(huán)；第五步，72°C終延伸7min，得PCR擴增產(chǎn)物；取5ul擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。如果在300bp左右出現(xiàn)清晰的條帶，則說明待測樣品中含有肺炎克雷伯氏菌。
[0014]本方法用于非診斷和治療目的。
[0015]有益效果
本發(fā)明的引物，相對于大腸桿菌、綠膿桿菌的基因序列的特異性強，能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開；
本發(fā)明引物在用于鑒定是否存在肺炎克雷伯氏菌時，靈敏度高，所能檢測到肺炎克雷伯氏菌的最低濃度為0.0OOlMcf ；
本發(fā)明的鑒定方法，從PCR擴增開始到瓊脂糖凝膠電泳，時間大約為3個小時，大大節(jié)省了時間，并且試驗步驟簡單易操作，提高了檢測效率。
【附圖說明】
[0016]圖1，本發(fā)明引物對肺炎克雷伯菌PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M =DNAmaker DL2000,1-7泳道和9_15泳道為肺炎克雷伯氏菌的擴增產(chǎn)物，8和16泳道為陰性對照；1_8泳道第一對引物，9-16泳道第二對引物；
圖2，本發(fā)明引物對大腸桿菌PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，Ml, M2 =DNAmaker DL2000 ；1-10泳道和12-21泳道為10株大腸桿菌的擴增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對照；1_11泳道是第一對引物；2_22泳道是第二對引物；
圖3，本發(fā)明引物對綠膿桿菌PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，Ml, M2 =DNAmaker DL2000 ；1-10泳道和12-21泳道為10株大腸桿菌的擴增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對照；1_11泳道是第一對引物；2_22泳道是第二對引物；
圖4，本發(fā)明引物對肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和綠膿桿菌混合菌液的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M:DNA maker DL2000 ;1_3泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；4_6泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；7_9泳道為第一對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；10泳道為陽性對照，檢測肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；11泳道為陰性對照；12-14泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；15-17泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；18-20泳道為第二對引物檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；21泳道為陽性對照，檢測肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；22泳道為陰性對照；
圖5，引物對肺炎克雷伯菌(單個菌落)的敏感性試驗結(jié)果；圖中，M: DNA makerDL2000,1-7泳道、9-15泳道為肺炎克雷伯，大小為300bp，8和16泳道為陰性對照。1_8泳道第一對引物，9-16泳道第二對引物；
圖6，引物對Kl對肺炎克雷伯菌的敏感性試驗結(jié)果；圖中，M:DNA maker DL2000，1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf, 3、4泳道菌液模版濃度為0.0OlMcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0OOlMcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽性對照，8泳道為陰性對照；
圖7，引物對K2對肺炎克雷伯菌的敏感性試驗結(jié)果；圖中，M:DNA maker DL2000，1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf, 3、4泳道菌液模版濃度為0.0OlMcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0OOlMcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽性對照，8泳道為陰性對照；
圖1-7中，M泳道，從上至下條帶的長度分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、10bp ;陰性對照指的是模版為蒸餾水。
【具體實施方式】
[0017]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0019]下述實施例中，本實驗室保存的七株肺炎克雷伯菌(K.pnenmoniae),記載于2012年I月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動物(主要是水貂)中分離得到的；現(xiàn)保存在