山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心。
[0020]本實(shí)驗(yàn)室保存的10株大腸桿菌(E.coli)，記載于2012年I月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動(dòng)物(主要是水貂)中分離得到的；現(xiàn)保存在山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心。
[0021]本實(shí)驗(yàn)室保存的10株綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa),記載于2012年I月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動(dòng)物(主要是水貂)中分離得到的；現(xiàn)保存在山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心。
[0022]實(shí)施例1
人工合成引物對(duì)K1、K2 ；
Kl:
Kl-F 為:5- CGATGCTACTTATCCCGACA- 3，如 SEQ ID N0.1 所示，
Kl-R 為:5-ACCACCAGCAGACGAACTT- 3，如 SEQ ID N0.2 所示；
K2:
K2-F 為:5- CGGAGCGTTTTTCAATCGG- 3，如 SEQ ID N0.3 所示，
K2-R 為:5-TGAGCGGGTAATAAATGCGG-3，如 SEQ ID N0.4 所示。
[0023]實(shí)施例2
將肺炎克雷伯菌復(fù)蘇于普通營養(yǎng)瓊脂上，挑單個(gè)菌落，搖菌過夜，將菌液當(dāng)作模版進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系:2XTaq PCR MasterMix 25 μ L，K1-F 和 Kl-R (上下引物)各 2μ L(或者K2-F和K2-R各2 μ L )，用菌液做模版4 μ L，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50 μ L。反應(yīng)條件為:第一步，在94°C的溫度條件下預(yù)變性5min ;第二步，在94°C的溫度條件下變性30s ；第三步，在58°C的溫度條件下退火30s ;第四步，在72°C的溫度條件下延伸Imin ;第二步到第四步共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；第五步:在72°C的溫度條件下終延伸7min;PCR擴(kuò)增結(jié)束。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其序列均SEQ ID N0.5所示，為肺炎克雷伯氏菌的特異性基因序列?？梢姡撘锬軐⒎窝卓死撞暇鷻z測(cè)到。其中，2XTaq PCR MasterMix ;包含Taq DNA聚合酶、(1見1^、1%(:12、反應(yīng)緩沖液、？0?反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，濃度為2\ ;購于天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為KT201。
[0024]重復(fù)性試驗(yàn):
對(duì)肺炎克雷伯氏菌的特異性試驗(yàn)
將本實(shí)驗(yàn)室保存的7株肺炎克雷伯氏菌分別采用實(shí)施例2方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(PCR反應(yīng)的模版為單個(gè)菌落)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相；結(jié)果如圖1所示，在303bp處均出現(xiàn)清晰條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其序列均如SEQ ID N0.5所示，為肺炎克雷伯氏菌的特異性基因序列?？梢?，該引物能將肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)到。
[0025]實(shí)施例3
對(duì)大腸桿菌的特異性試驗(yàn)
將本實(shí)驗(yàn)室保存的10株大腸桿菌分別采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(PCR的模版為單個(gè)菌落)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相；結(jié)果如圖2所示，在303bp處沒有出現(xiàn)條帶?？梢姡撘锊荒軐⒋竽c桿菌檢測(cè)到。
[0026]實(shí)施例4
對(duì)綠膿桿菌的特異性試驗(yàn)
將本實(shí)驗(yàn)室保存的10株大腸桿菌分別采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(PCR的模版為單個(gè)菌落)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相；結(jié)果如圖3所示，在303bp處均沒有出現(xiàn)條帶。可見，該引物不能將綠膿桿菌檢測(cè)到。
[0027]實(shí)施例5
將本實(shí)驗(yàn)室保存的肺炎克雷伯氏菌(一株)、大腸桿菌(一株)和大腸桿菌(一株)分別復(fù)蘇于普通營養(yǎng)瓊脂上，挑單個(gè)菌落，搖菌過夜。將三種菌液混合、任意兩種菌液混合之后當(dāng)作模版，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相；結(jié)果如圖4所不。另外的6株肺炎克雷伯氏菌中的任意一株、與另外9株大腸桿菌中的任意一株和9株大腸桿菌，采用上述方式混合后當(dāng)作模版，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相；結(jié)果與圖4相同?？梢?，此兩對(duì)引物對(duì)肺炎克雷伯氏菌具有良好的特異性，能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c混淆程度很大的大腸桿菌和綠膿桿菌區(qū)分開。
[0028]實(shí)施例6 敏感性試驗(yàn):
(I)將肺炎克雷伯氏菌7株劃在普通營養(yǎng)瓊脂上，取單個(gè)菌落作PCR反應(yīng)的模版，其他反應(yīng)體系不變，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50 μ L。反應(yīng)條件同重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)?？梢?，單個(gè)菌落就可以用該引物檢測(cè)到，說明此引物敏感性良好。結(jié)果如圖5 ；
(2)取培養(yǎng)了 12小時(shí)的肺炎克雷伯氏菌的單個(gè)菌落，于3ml 85%Nacl生理鹽水中，將菌液濃度(麥?zhǔn)綕舛?調(diào)整為0.1 Mcf,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行50倍，100倍，1000倍稀釋，即稀釋后的菌液濃度為0.002Mcf,0.0OlMcf, 0.0OOlMcf。各取其4ul做PCR反應(yīng)的模版。其他PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系同實(shí)施例2。其中，引物對(duì)Kl的敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示、引物對(duì)K2的敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示?？梢?，當(dāng)菌液濃度為0.0OOlMcf時(shí)仍可見清晰的條帶，說明該引物的敏感性較高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于鑒定肺炎克雷伯氏菌的引物，其特征在于，包含引物對(duì)Kl或/和引物對(duì)K2 ； 其中，Kl包括Kl-F和Kl-R, K2包括K2-F和K2-R ； 所述Kl-F、Kl-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分別為序列表中的SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4。
2.一種用于鑒定肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)試劑，其特征在于，包含引物對(duì)Kl或/和引物對(duì)K2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，還包含PCR試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑，其特征在于，所述PCR試劑包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCljP PCR反應(yīng)緩沖液。
5.一種肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2、3或4的檢測(cè)試劑對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)序法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，取4μ L待測(cè)樣品、4 μ L引物對(duì)Kl或/和引物對(duì)Κ2和25 μ L PCR試劑，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50 μ L ;第一步，94°C預(yù)變性5min ；第二步，94°C變性30s ;第三步，58°C退火30s ;第四步，72°C延伸Imin ;第二步到第四步共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；第五步，72°C終延伸7min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在B1-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法及所用引物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過創(chuàng)造勞動(dòng)獲取了兩對(duì)引物（人工合成基因序列），采用該引物對(duì)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為肺炎克雷伯氏菌的特異性序列；從而能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c大腸桿菌和綠膿桿菌區(qū)分開來。本發(fā)明的用于鑒定肺炎克雷伯氏菌的引物，包含引物對(duì)K1或/和引物對(duì)K2；其中，K1包括K1-F和K1-R，K2包括K2-F和K2-R；所述K1-F、K1-R、K2-F、K2-R的核苷酸序列分別為序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-22, C12Q1-68, C12Q1-10
【公開號(hào)】CN104531887
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510020845
【發(fā)明人】王貴升, 張婷婷, 田夫林, 王金寶, 單虎
【申請(qǐng)人】山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月15日