專利名稱：一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其在產(chǎn)生物電中的應(yīng)用的制作方法
一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其在產(chǎn)生物電中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物處理和生物能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其產(chǎn)生物電的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，微生物燃料電池(Microbial Fuel Cell, MFC)技術(shù)作為一種新興的廢水處理及污染修復(fù)技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注。它直接借助微生物將燃料中有機(jī)物或者無機(jī)物氧化并產(chǎn)生電子和質(zhì)子，產(chǎn)生的質(zhì)子和電子分別經(jīng)質(zhì)子交換膜和外電路傳遞至陰極，與最終電子受體反應(yīng)產(chǎn)生水，最終將燃料中有機(jī)物或者無機(jī)物的化學(xué)能并轉(zhuǎn)化電能。該技術(shù)將污染的生物處理與生物能源回收相結(jié)合，在處理污水的同時，還能獲得電能。
在微生物燃料電池中，產(chǎn)電微生物(Exoelectrogens)發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。產(chǎn)電微生物是那些能夠進(jìn)行胞外電子傳遞的微生物，它們會在陽極富集形成生物膜，可通過新陳代謝作用降解有機(jī)物，同時產(chǎn)生電子并傳遞至胞外，再直接或間接地將其傳遞到電極上，從而實(shí)現(xiàn)生物催化并驅(qū)動MFC的運(yùn)行。隨著產(chǎn)電微生物種類的不同，其產(chǎn)生電子和傳遞電子的機(jī)制也不同，表現(xiàn)出的電化學(xué)活性存在明顯差異。
目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)電微生物多集中在變形菌門，也有少量的位于厚壁菌門、酸桿菌門和擬桿菌門的微生物被證實(shí)可以產(chǎn)電。但是總體而言，已知的產(chǎn)電微生物種類仍然非常有限。同時，在產(chǎn)電特性方面，已知的大部分產(chǎn)電菌仍存在產(chǎn)電性能較低、利用底物類型比較單一等缺陷，不能滿足修復(fù)多種類型的環(huán)境污染。因此，有必要篩選更加高效的產(chǎn)電微生物。
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)屬于Y _變形菌綱，不運(yùn)動,有莢膜，是一種革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧的鐵還原菌。關(guān)于Klebsiella sp.細(xì)菌在MFC中催化有機(jī)物產(chǎn)電的已有若干報(bào)道。從土壤中分離到的Klebsiella pneumoniae菌株L17和水稻土中分離到的Klebsiella sp.ME17先后都被在MFC中測試其利用葡萄糖產(chǎn)電性能。其中，Klebsiella sp.ME17 的 16S rDNA 序列與 Klebsiella trevisanii ATCC33558T (AF129444)和Klebsiella planticolaATCC33531T(Y17659)最為接近，但生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其為克雷伯氏菌的新種。從上述報(bào)道看，已報(bào)道的克雷伯氏菌屬細(xì)菌Klebsiella pneumoniaL17和Klebsiella sp.ME17分別是從土壤和水稻土中分離所得，經(jīng)MFC測試顯示其具有電化學(xué)活性，同時，測試的底物類型僅為葡萄糖。可以看出，到目前為止，還沒有直接從富集的MFC陽極生物膜中分離 到Klebsiella sp.產(chǎn)電細(xì)菌的詳細(xì)報(bào)道，利用不同電子供體產(chǎn)電特性有待探明。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了上述缺陷，提供一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其產(chǎn)生物電的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌，來源于廣州西朗污水處理廠二沉池的泥水混合物，經(jīng)微生物燃料電池的電化學(xué)富集培養(yǎng)、人工分離純化得到，該菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) Z6,由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,簡稱CCTCC,保藏編號為:CCTCC N0:M 2012446，保藏日期為2012年11月6日，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。該菌在檸檬酸鐵培養(yǎng)基上的菌落為圓形、黑色、邊緣光滑有光澤，直徑約2_。透射電鏡下觀察該菌的形態(tài)為桿狀，寬度為0.5 μ m-0.7 μ m,長度為0.6 μ m-1.7 μ m，周生鞭毛，生長對數(shù)期為2 20h。生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陰性，兼性厭氧，具有鐵還原性，可利用檸檬酸三鈉、葡萄糖、丙三醇、乳酸鈉、谷氨酸。該菌可在厭氧條件下傳遞電子至胞外電子受體。菌株Z6的16S rDNA的登錄號為JX185133。
上述菌株在產(chǎn)生物電中的應(yīng)用，具體包括如下步驟:
(I)將權(quán)利要求1所述的菌株接種至檸檬酸鐵培養(yǎng)基中，30±5°C厭氧培養(yǎng)；取對數(shù)期生長中期的菌液，離心，棄上清液，添加PBS緩沖液搖勻，按上述步驟將所得菌懸液再次離心,如此反復(fù)清洗2次，添加PBS緩沖液制成菌懸液；
(2)啟動單室空氣陰極微生物燃料電池，將步驟(I)中獲得的菌懸液與營養(yǎng)液混合后接種于微生物燃料電池，在步驟(I)的培養(yǎng)溫度下恒溫運(yùn)行即可。當(dāng)MFC的輸出電壓達(dá)到IOOmV以上，視為啟動成功，此后，僅更換含電子供體的營養(yǎng)液。
優(yōu)選地，步驟(I)所述檸檬酸鐵培養(yǎng)基組分如下:胰蛋白胨IOg.L—1，酵母提取物5g.L_\氯化鈉IOg.L_\添加20mmol.Γ1的檸檬酸鐵為電子供體；步驟(2)所述營養(yǎng)液成分為30mmol.Γ1的電子供體，50mmol.T1PBS緩沖液以及少量維生素和微量元素。
優(yōu)選地，所述營養(yǎng)液中電子供體為檸檬酸鹽、葡萄糖、丙三醇、乳酸鈉和谷氨酸中的一種或幾種；所述PBS緩沖液的配方為NH4Cl 0.31g. Λ NaH2PO4.H2O 2.452g. ΛNa2HPO4 4.576g. Λ KCl 0.13g. Λ pH 7.0。
優(yōu)選地，所述制成的菌懸液的OD6tltl為0.6 ;所述培養(yǎng)基和營養(yǎng)液的pH為7.0 7.4。
優(yōu)選地，步驟(2)中所述微生物燃料電池為圓柱形(截面直徑為2cm，有效容積6.28cm3),材質(zhì)為聚碳酸酯。空氣陰極為載鉬碳紙(0.5mg.cm-2),陽極為硝酸改性碳租，陰極內(nèi)側(cè)為一層陽離子交換膜，電極間距為2cm，用鈦絲做電子集流體。硝酸改性碳?xì)值木唧w改性方法為:將預(yù)處理后的碳?xì)钟脻庀跛?65%)浸泡5h，用去離子水反復(fù)沖洗至中性，放入120°C烘箱中烘干2h后，置于 干燥器內(nèi)備用。碳?xì)诸A(yù)處理方法為:用丙酮浸泡3h后，經(jīng)真空泵抽滌，以除去表面的油溶性物質(zhì)；再用去離子水沖洗并浸泡、煮沸，每隔0.5h換水I次，共煮沸3h，將電極材料放入120°C烘箱中烘干2h后，置于干燥器內(nèi)備用。
優(yōu)選地，步驟(2)中所述MFC的輸出電壓(U)采用Keithley 2700采集
優(yōu)選地，步驟(2)中所述陽離子交換膜預(yù)先用5%NaCl浸泡24h。
優(yōu)選地，待步驟(2)電池電壓出現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)周期后，向陽極室中添加外源電子傳遞中間體AQDS。
優(yōu)選地，步驟(I)所述培養(yǎng)溫度為30±1°C，培養(yǎng)時間為16_18h，離心條件為5000r/min離心10分鐘。
優(yōu)選地，所述菌懸液與營養(yǎng)液的體積比為1:5。
所述菌株CCTCC M 2012446在環(huán)境污染生物處理和生物能源技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。以檸檬酸鹽為基質(zhì)時，該菌株構(gòu)建的單室空氣陰極MFC可產(chǎn)生最大輸出電壓0.31V，最大功率密度為287.4mff.πΓ2。除檸檬酸鹽外，該菌還能利用葡萄糖、乳酸鈉、丙三醇、谷氨酸產(chǎn)電。這說明菌株Klebsiella oxytoca Z6不僅具有較強(qiáng)的電化學(xué)活性,還能利用多種類型的有機(jī)物作為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)電。添加外源電子傳遞中間體(AQDS)對該菌株的產(chǎn)電過程具有一定的促進(jìn)作用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)是該菌株CCTCC M 2012446表現(xiàn)出較強(qiáng)的電化學(xué)活性，與其他菌株相比，可以產(chǎn)生較為顯著的電能，在以檸檬酸鹽為基質(zhì)時最大功率密度為287.4mW*nT2。該菌株CCTCC M 2012446還可以利用多種類型的有機(jī)物產(chǎn)電，這意味著該菌將在多種工業(yè)廢水處理及環(huán)境污染修復(fù)中發(fā)揮重要作用。同時，該菌株為兼性厭氧型，產(chǎn)電過程中并不需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，減小了實(shí)際應(yīng)用中對廢水及環(huán)境污染處理裝置的要求。


圖1為實(shí)施例1以二沉池泥為接種物的MFC啟動電壓圖。
圖2為實(shí)施例2的菌株循環(huán)伏安曲線圖。
圖3為實(shí)施例3的菌株以多種有機(jī)物為基質(zhì)的MFC電壓、功率密度和庫倫效率圖。
圖4為實(shí)施例4的菌株以檸檬酸鹽為基質(zhì)的MFC電壓(a)、極化曲線(b)和電極電勢圖(C)。
圖5為實(shí)施例4中MFC陽極及生物膜顯微觀察圖，(a)為空白陽極，X500倍；(b)為陽極生物膜，X500倍；(c)為陽極生物膜，X5000倍；(d)為附著在單個碳纖維上的菌體，X 40000 倍。
圖6為實(shí)施例5中MFC陽極的原位循環(huán)伏安曲線圖，Ca)為不同時期示意圖，(b)為不同時期的CV曲線。
圖7為實(shí)施例6中添加外源AQDS對MFC輸出電壓的影響曲線圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中所用生化池泥來自廣州市西朗污水處理廠。
實(shí)施例1
菌株CCTCC M 2 012446的篩選及分離
取污水處理廠二沉池泥300mL轉(zhuǎn)移到500mL燒杯中，加入葡萄糖營養(yǎng)液200mL，攪拌均勻，用NaHCO3溶液調(diào)整pH值到7.0左右(6.7-7.2)，置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I天。測定PH值，并適時用NaHCO3溶液調(diào)整pH值到6.7-7.2，攪拌均勻，待其沉淀后，棄去上清液。如此重復(fù)培養(yǎng)3天備用。
啟動單室空氣陰極微生物燃料電池，所述的MFC為長方體(長X寬X高=8.5X7X6.5cm3，有效容積200mL)，材質(zhì)為0.5cm的有機(jī)玻璃，一端以盲板封閉，另一端用夾板放置陰極?？諝怅帢O為載鉬碳紙(0.5mg.αιΓ2),陽極為硝酸改性碳租(BET 1200m2 *g_1,2mm),電極間距為3cm，用鈦絲做電子集流體。啟動時，取預(yù)培養(yǎng)后的污泥，與營養(yǎng)液按1:1的比例混合后接種MFC，外阻為1000Ω，在(30±1)°C恒溫條件下運(yùn)行。營養(yǎng)液為含Ig -Γ1葡萄糖的PBS(pH 7.0)以及少量維生素和微量元素，1211:滅菌201^11后使用。當(dāng)MFC的輸出電壓達(dá)到IOOmV以上，視為啟動成功。此后，僅更換含電子供體的營養(yǎng)液。通過Keithley2700采集MFC的輸出電壓(U)。結(jié)果如圖1所示，電池啟動180小時候輸出電壓基本達(dá)到穩(wěn)定，最大輸出電壓為0.37V。在MFC陽極表面可以觀察到一層生物膜。
待該MFC穩(wěn)定運(yùn)行I個月后，取出長有生物膜的陽極，用刀片刮下陽極生物膜若干，接種檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基，置于(30±1) 1:條件下厭氧培養(yǎng)I天。然后，取培養(yǎng)物涂布檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)一天后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明性等特征，挑取表面特征差異明顯的菌落，分別接種至檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。如此反復(fù)傳代7-8次，得到多株純培養(yǎng)菌株。將純菌進(jìn)行循環(huán)伏安分析驗(yàn)證其電化學(xué)活性，最后得到一株電化學(xué)活性菌Z6。經(jīng)分子鑒定、形態(tài)觀察和碳源利用分析,該菌鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。所述液體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨IOg L—1,酵母提取物5g Ι/1,氯化鈉IOg檸檬酸鐵20mmol.L_\ pH為7.4 ;所述固體培養(yǎng)基配方為液體培養(yǎng)基加入23g.Γ1瓊脂粉。
實(shí)施例2
菌株CCTCC M 2012446的循環(huán)伏安分析
將Klebsiella oxytoca Z6接種至朽1檬酸鐵培養(yǎng)基中(胰蛋白胨IOg.I71,酵母提取物58. Λ氯化鈉IOg.L—1，檸檬酸鐵20mmol.L-1，pH為7.4)，(30± I) °C厭氧培養(yǎng)18h。取對數(shù)期生長中期的菌液，5000r/min離心10分鐘，棄上清液，添加PBS緩沖液搖勻，按上述步驟將所得菌懸液再次離心，如此反復(fù)清洗2次，添加PBS緩沖液制成菌懸液，OD600為0.6左右。用電化學(xué)工作站對所得菌懸液做循環(huán)伏安測試，測試采用三電極體系，以玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉬片為對電極，掃速為IOOmV.s—1，掃描范圍為-0.8V 0.8V。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，菌株Klebsiella oxytoca Z6在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)Id后,得到的的循環(huán)伏安曲線有一對明顯的氧化還原峰,其中氧化峰位于_50mV 130mV之間，還原峰位于21OmV 360mV之間。
本實(shí)施例說明分離所得到的菌株CCTCC M 2012446能夠進(jìn)行胞外電子傳遞，具有較強(qiáng)的電化學(xué)活性。
實(shí)施例3
菌株CCTCC M 2012446在處理多種人工廢水中的應(yīng)用
將所述菌株CCTCC M 2012446接種至LB培養(yǎng)基，(30± I) 1:厭氧培養(yǎng)18h。取對數(shù)期生長中期的菌液，5000r/min離心10分鐘，棄上清液，添加PBS緩沖液搖勻，按上述步驟將所得菌懸液再次離心，如此反復(fù)清洗2次，添加PBS緩沖液制成菌懸液，OD600為0.6左右。
啟動單室空氣陰極微生物燃料電池，所述微生物燃料電池為圓柱形(截面直徑為2cm,有效容積6.28cm3),材質(zhì)為聚碳酸酯?？諝怅帢O為載鉬碳紙(0.5mg.cm-2),陽極為硝酸改性碳?xì)?，陰極內(nèi)側(cè)為一層陽離子交換膜，電極間距為2cm，用鈦絲做電子集流體。啟動時，取對數(shù)期生長中期的菌液，與營養(yǎng)液按1:5的比例混合后接種MFC，外阻為1000Ω，在(30±1) °C恒溫條件下運(yùn)行。所述營養(yǎng)液成分為:30mmol.L—1電子供體(檸檬酸鹽、葡萄糖、丙三醇、乳酸鈉或谷氨酸)、50mmol.L’BS緩沖液以及少量維生素和微量元素，121°C滅菌20min后使用。當(dāng)MFC的輸出電壓達(dá)到IOOmV以上，視為啟動成功。此后，僅更換含電子供體的營養(yǎng)液。MFC的輸出電壓(U)采用Keithley 2700采集；庫倫效率CE按照公式
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌,其特征在于,該菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)Z6，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為:CCTCC N0:M 2012446，保藏日期為2012年11月6日。
2.權(quán)利要求1所述菌株在產(chǎn)生物電中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: (O將權(quán)利要求1所述菌株接種至檸檬酸鐵培養(yǎng)基中，30±5°c厭氧培養(yǎng)；取對數(shù)期生長中期的菌液，離心，棄上清液，添加PBS緩沖液搖勻，按上述步驟將所得菌懸液再次離心，如此反復(fù)清洗2次，添加PBS緩沖液制成菌懸液； (2)啟動單室空氣陰極微生物燃料電池，將步驟(I)中獲得的菌懸液與營養(yǎng)液混合后接種于微生物燃料電池，在步驟(I)的培養(yǎng)溫度下恒溫運(yùn)行即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(I)所述檸檬酸鐵培養(yǎng)基組分如下:胰蛋白胨IOg.L_S酵母提取物5g.L_\氯化鈉IOg.L_S添加20mmol.L—1的朽1檬酸鐵為電子供體；步驟(2)所述營養(yǎng)液成分為30mmol.Γ1的電子供體，50mmol.T1PBS緩沖液以及少量維生素和微量元素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用 ，其特征在于，所述營養(yǎng)液中電子供體為檸檬酸鹽、葡萄糖、丙三醇、乳酸鈉和谷氨酸中的一種或幾種；所述PBS緩沖液的配方為NH4Cl 0.31g.Γ1，NaH2PO4.H2O 2.452g. Λ Na2HPO4 4.576g. Λ KCl 0.13g. Λ pH 7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制成的菌懸液的0D_為0.6;所述培養(yǎng)基和營養(yǎng)液的pH為7.0 7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述微生物燃料電池為圓柱形，材質(zhì)為聚碳酸酯；空氣陰極為載鉬碳紙，陽極為硝酸改性碳?xì)?，陰極內(nèi)側(cè)為一層陽離子交換膜，電極間距為2cm，用鈦絲做電子集流體。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，待步驟(2)電池電壓出現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)周期后，向陽極室中添加外源電子傳遞中間體AQDS。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(I)所述培養(yǎng)溫度為30±1°C，培養(yǎng)時間為16-18h，離心條件為5000r/min離心10分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述菌懸液與營養(yǎng)液的體積比為 1:5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其在產(chǎn)生物電中的應(yīng)用，其特征在于，該菌是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)Z6，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M 2012446，保藏日期為2012年11月6日。該菌可在厭氧條件下傳遞電子至胞外電子受體，接種至微生物燃料電池中可以在降解有機(jī)物的同時產(chǎn)生電能。與其他菌株相比，菌株Klebsiella oxytoca Z6不僅具有很強(qiáng)的電化學(xué)活性，還能利用多種類型的有機(jī)物作為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)電?；谏鲜鎏匦?，該菌在環(huán)境污染修復(fù)及生物能源回收中具有很好的應(yīng)用。
文檔編號H01M8/16GK103215201SQ201310089320
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者朱能武, 彭月, 吳平霄 申請人:華南理工大學(xué)