一種攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體及其構建方法與應用
【專利說明】一種攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體及其 構建方法與應用 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領域中的載體及其應用，特別是涉及一種攜帶生存素（Survivin， 又稱存活素）抗原基因的重組腺相關病毒載體及其構建方法以及其在制備抗Survivin陽 性的腫瘤藥物中的應用。 【【背景技術】】
[0002] 腺相關病毒（adeno-associatedvirus，AAV)的基因結構已經(jīng)被鑒定。1983年， Samulski等人描述了AAV的末端重復片段（上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associatedvirusfrom recombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV. Cell. 33:135-143. )。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染顆粒（lip)基因和 包膜（cap)基因（HermonatPL,LabowMA，WrightR，BernsKI，MuzyczkaN.Genetics ofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterization ofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P. L. ,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloning vector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:6466-6470.)。1986 年，Labow等人鑒定了位于上 游 5' 端片段和rep基因之間的p5 啟動子（LabowMA，HermonatPL，BernsKl.Positive andnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.J Virol. 160:251-258.)〇
[0003] 1984年，美國PaulL.Hermonat證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療。目前， 主要是歐美國家在進行以AAV為基礎的基因治療人類疾病的臨床試驗。據(jù)美國糧食和藥品 管理局統(tǒng)計，現(xiàn)有十余項以AAV為基礎的基因治療臨床試驗正在進行，主要是將攜帶治療 基因的AAV病毒注入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達治療基因，從而達到治療疾病的目的。主要 針對治療的疾病是帕金森氏綜合癥、風濕性關節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進行性肌萎縮和奧 茲海默綜合癥等非腫瘤性疾病。2012年11月2日歐盟批準UniQure公司的Glybera產(chǎn)品 在歐盟27個成員國使用，這是西方國家第一個獲批準的基因治療藥物，它是利用腺相關病 毒I型（AAV-I)攜帶外源基因用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳?。↙PLD)的基因藥物。
[0004]AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒（如腺病毒）的基因產(chǎn)物輔助， 才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。目前AAV可分為12種血清型（AAV-1~AAV-12)。其 中，2型腺相關病毒載體（AAV-2)因具有無致病性、宿主范圍廣、目的基因長期表達等優(yōu)點 而成為當前基因治療中最有潛力的病毒載體之一。AAV-2基因組全長約4700堿基對（bp)， 兩端為重復末端片段（TR)，中間為病毒的結構基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病 毒自身的不穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因（治療基因）長度有限等方面缺陷，因此有必要對 其進行基因重組形成重組腺相關病毒（recombinantadeno-associatedvirus，rAAV) 〇
[0005] 如何構建可用于制備治療疾病的藥物的重組腺相關病毒及其相關產(chǎn)品是本領域 技術人員努力的方向。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是：彌補上述現(xiàn)有技術的不足，提出一種穩(wěn)定性高、 攜帶生存素（Survivin)抗原基因的重組腺相關病毒（recombinantadeno-associated virus，rAAV)載體及其構建方法與應用。
[0007] 本發(fā)明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：
[0008] -種攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體，將腺相關病毒載體中的腺 相關病毒的結構基因替換為Survivin抗原基因得到的重組腺相關病毒載體。
[0009] 已知的腺相關病毒載體具有p5啟動子，為提高目的基因的轉錄水平，還可進一步 將Survivin抗原基因插入已經(jīng)成功構建的啟動子為巨噬細胞病毒（CMV)啟動子、P-肌動 蛋白啟動子、SV40早期啟動子中的一種的AAV載體中。
[0010] 本發(fā)明還提供攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體的構建方法：在腺 相關病毒載體中，將腺相關病毒的結構基因剔除，在剔除的位置上插入Survivin抗原基 因，得到重組腺相關病毒載體。
[0011] 本發(fā)明所提供的構建方法，是使用基因重組的方法，使用限制性內(nèi)切酶先將AAV 載體骨架DNA切斷，再運用DNA連接技術，將特異抗原基因Survivin與被切斷的AAV載體 DNA進行連接，得到攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體。該rAAV載體的啟動子 為P5啟動子或者下述三種啟動子中的一種：巨噬細胞病毒（CMV)啟動子、(6-肌動蛋白啟 動子、SV40早期啟動子。
[0012] -種與攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產(chǎn)品，包括 Survivin重組腺相關病毒的質粒載體、Survivin重組腺相關病毒的病毒載體、被所述 Survivin重組腺相關病毒的病毒載體感染或轉染的細胞系，所述Survivin重組腺相關病 毒的質粒載體由上述攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體或者上述構建方法制 得的攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體制得；所述Survivin重組腺相關病毒 的病毒載體由所述Survivin重組腺相關病毒的質粒載體進行細胞培養(yǎng)得到。
[0013] -種與攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產(chǎn)品的制備方法， Survivin重組腺相關病毒的質粒載體的制備：將如上述攜帶Survivin抗原基因的重組腺 相關病毒載體或者上述構建方法制得的攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體 導入基因工程大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，用含1〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB平板進行抗 性篩選，挑取白色單菌落，提取質粒并純化，得到Survivin重組腺相關病毒的質粒載體； Survivin重組腺相關病毒的病毒載體的制備：以所述Survivin重組腺相關病毒的質粒載 體和pHelper質粒共轉染AAVp細胞得到Survivin重組腺相關病毒的病毒載體；Survivin 重組腺相關病毒感染或轉染的細胞系的制備：用所述Survivin重組腺相關病毒的病毒載 體感染或轉染單核細胞、樹突狀細胞或T淋巴細胞得到，所述細胞系包括單核細胞-樹突狀 細胞系、T淋巴細胞系。
[0014] -種如上近述的攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關病毒載體或者如上所述的 相關產(chǎn)品在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0015] 具體地，腫瘤為Survivin陽性的惡性腫瘤。所述Survivin陽性的惡性腫瘤包括 但不限于肺癌、腸癌、肝癌、乳腺癌等。藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是 多種多樣的，如細胞培養(yǎng)液（基）、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時候，在上述藥 物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、 吸收促進劑和表面活性劑等。
[0016] 用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內(nèi)的單核細胞，再將AAV/Survivin的病毒載 體感染或轉染患者的單核細胞?；驅⑥D化有Survivin的成熟的樹突狀細胞所刺激產(chǎn)生的 細胞毒性T淋巴細胞回輸腫瘤患者。
[0017] 上述藥物的用量一般為100y1/5XIO6個單核細胞/每次，每月2次，療程通常為 6個月。劑量和療程都可根據(jù)實際情況調整。
[0018] 為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物等進行 組合治療。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因（Survivin)的重組腺相關病毒 (rAAV)載體。在本發(fā)明的重組腺相關病毒（AAV/Survivin)載體可將其攜帶的Survivin抗 原基因輸送入單核細胞-樹突狀細胞系中，存在Survivin抗原基因的細胞被用于刺激免疫 系統(tǒng)的效應細胞（不局限于T淋巴細胞和B淋巴細胞）。實驗證明，被本發(fā)明的rAAV感染 的樹突狀細胞和所誘導的細胞毒性T淋巴細胞在體外和患者體內(nèi)可有效地抑制相關惡性 腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，因而，本發(fā)明的攜帶Survivin抗原基因的重組腺相關 病毒載體或與本發(fā)明重組腺相關病毒載體相關的產(chǎn)品可被用于制備抗Survivin抗原陽性 的惡性腫瘤的細胞免疫治療。本發(fā)明在惡性腫瘤的臨床治療和應用中具有重要的理論和實 際意義，應用前景廣闊。 【【附圖說明】】
[0021] 圖1是本發(fā)明【具體實施方式】的攜帶生存素（Survivin)抗原基因的重組腺相關病 毒載體的結構不意圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明【具體實施方式】的構建攜帶生存素（Survivin)抗原基因的重組腺相 關病毒載體以及制備具有感染性的重組腺相關病毒AAV/Survivin的流程圖；
[0023] 圖3是本發(fā)明【具體實施方式】的重組腺相關病毒（AAV/Survivin)載體的PCR鑒定 結果圖；
[0024] 圖4是本發(fā)明【具體實施方式】的所獲得的Survivin基因序列與美國NCIGeneBank 公布的基因序列的對比圖；
[0025] 圖5是本發(fā)明【具體實施方式】的重組腺相關病毒（AAV/Survivin)的病毒載體的病 毒滴度檢測結果圖；