一種高通量篩選具有Nrf2激活活性的化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高通量篩選具有Nrf2激活活性的化合 物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Nrf2蛋白是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，控制基因的表達(dá)。Nrf2在細(xì)胞受到外界有 害刺激后被激活，激活的Nrf2增加多種細(xì)胞內(nèi)保護(hù)因子的基因表達(dá)水平，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)效 應(yīng)，抑制細(xì)胞的損傷。
[0003] 利用小分子化合物（藥物）作為Nrf2的激活劑，在沒(méi)有外界有害刺激的情況下通 過(guò)藥物作用激活Nrf2,起到細(xì)胞保護(hù)作用，是目前新藥研發(fā)的一個(gè)方向。目前國(guó)外開(kāi)發(fā)的小 分子Nrf2激活劑有些已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。
[0004] 在新藥開(kāi)發(fā)的前期階段，需要從眾多的化合物中篩選具有Nrf2激活作用的化合 物。目前常用的研究方法包括：
[0005] (1)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)Nrf2靶基因的表達(dá)水平（如：TanKP，YangM，Ito S:Activationofnuclearfactor(erythroid-2like)factor2bytoxicbileacids provokesadaptivedefenseresponsestoenhancecellsurvivalattheemergence ofoxidativestress.MolPharmacol2007, 72 (5) :1380-1390.)D 主要缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟復(fù) 雜，無(wú)法滿足高通量（高效率）篩選的需要；結(jié)果隨機(jī)誤差大。
[0006] (2)用生物化學(xué)方法檢測(cè)Nrf2靶基因（主要是NAD(P)H:醌氧化還原 酶-1)的功能活性（如：Dinkova-KostovaAT，LibyKT，StephensonKK，Holtzclaw WD，GaoX,SuhN,WilliamsC，RisingsongR，HondaT，GribbleGffetal:Extremely potenttriterpenoidinducersofthephase2response:correlationsof protectionagainstoxidantandinflammatorystress.ProcNatlAcadSciUSA 2005, 102(12) :4584-4589.)。主要缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能直接反映Nrf2的功能活性，特異性 較差；較難實(shí)現(xiàn)高通量篩選。
[0007] (3)用生物化學(xué)的方法檢測(cè)Nrf2蛋白在細(xì)胞中的積累水平（如：Wondrak GTjCabelloCM,VilleneuveNFjZhangS,LeyS,LiY,SunZ，ZhangDD:Cinnamoyl-based Nrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadic BiolMed2008, 45(4) :385-395.)。主要缺點(diǎn)：無(wú)法滿足高通量篩選的需要D
[0008] (4)在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)帶有Nrf2結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因，檢測(cè)Nrf2增強(qiáng)基因表達(dá) 的功能水平（WondrakGT，CabelloCM，VilleneuveNF，ZhangS，LeyS，LiY，SunZ，Zhang DD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidative stress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。此方法與其他方法相比主要的優(yōu) 點(diǎn)是檢測(cè)數(shù)據(jù)能夠直接反映Nrf2的轉(zhuǎn)錄因子功能活性。主要缺點(diǎn)：無(wú)法滿足高通量篩選的 需要D

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的就是提供一種高通量篩選具有Nrf2激活活性的化合物的方法。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] -種高通量篩選具有Nrf2激活活性的化合物的方法，步驟如下：
[0012] (1)構(gòu)建含有3個(gè)Nrf2結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因；
[0013] ⑵將報(bào)告基因插入到pGL4. 26[luc2/minP/Hygro]質(zhì)粒當(dāng)中，得到報(bào)告基因質(zhì) 粒；
[0014] (3)用大腸桿菌（或感受態(tài)DH5a菌株）將報(bào)告基因質(zhì)粒擴(kuò)增并提純質(zhì)粒；
[0015] (4)用提純的報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。
[0016] 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后是否能得到反應(yīng)性良好的細(xì)胞株取決于所用的報(bào)告基因DNA序列，所 用的質(zhì)粒系統(tǒng)和所用的細(xì)胞之間的組合效果，最終的結(jié)果無(wú)法預(yù)測(cè)，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最 終產(chǎn)品是否可用。本發(fā)明用pGL4. 26[luc2/minP/Hygro]質(zhì)粒和HeLa細(xì)胞搭配制備得到的 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)用已知的Nrf2激活物刺激細(xì)胞和用Nrf2基因沉默（抑制原有Nrf2 的活性）正反兩種方法，均證實(shí)具有能滿足試驗(yàn)需要的敏感性和特異性。
[0017] 所述步驟⑷中還包括用已知的Nrf2激活劑鑒定各細(xì)胞株的反應(yīng)性，選取反應(yīng)性 良好（即：藥物Sulforaphane或Tert-butylhydroquinone誘導(dǎo)的Luciferase活性與對(duì)照 (相應(yīng)濃度的藥物溶劑，如DMS0)處理相比增加2倍以上）的細(xì)胞株。
[0018] 上述的方法在新藥研發(fā)中的應(yīng)用。
[0019] 上述的方法篩選得到的化合物，所述的化合物在制備具有Nrf2激活活性藥物中 的應(yīng)用
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 高通量是制藥企業(yè)研發(fā)所需要的，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后是否能得到反應(yīng)性良好的細(xì)胞株取 決于所用的報(bào)告基因DNA序列和所用的細(xì)胞之間的組合效果，最終結(jié)果無(wú)法預(yù)測(cè)，只能通 過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，這是成功與否的難點(diǎn)之一。
[0022] 本發(fā)明改進(jìn)了原有的檢測(cè)Nrf2激活作用的方法，使其能夠適應(yīng)新藥前期開(kāi)發(fā)階 段高通量篩選的需求。原有方法完成一次檢測(cè)通常需要半天到兩天不等，而一次實(shí)驗(yàn)所能 檢測(cè)的樣品數(shù)量不超過(guò)十幾個(gè)。使用本發(fā)明的方法，每個(gè)96孔板可檢測(cè)至少10個(gè)樣品，完 成一個(gè)96孔板檢測(cè)的時(shí)間少于30分鐘。
[0023] 本發(fā)明采用新一代的含抗生素抗性基因的質(zhì)粒系統(tǒng)，不但克服了無(wú)法進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染的缺陷，而且新一代質(zhì)粒在報(bào)告基因末端增加了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，更加優(yōu)化了在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)的敏感性和特異性。高通量檢測(cè)技術(shù)是以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為 基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè) 儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)數(shù)以千萬(wàn)的樣品，并 以得到的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系，它具有微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是當(dāng)今 制藥企業(yè)在新藥研發(fā)初始階段必不可少的工具。針對(duì)不同的生物分子靶點(diǎn)或不同類別的化 合物，必須有現(xiàn)成的分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法才能完成篩選工作，我們的方法即是 建立了針對(duì)"Nrf2"的分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法，是針對(duì)Nrf2為生物靶點(diǎn)的新藥研 制高通量篩選流程的基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明流程圖；
[0025] 圖2為HygromycinB篩選后光鏡下見(jiàn)到的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆的形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0027] 如圖1所示，一種高通量篩選具有Nrf2激活活性的化合物的方法，包括以下步 驟：
[0028] (1)人工構(gòu)建含有3個(gè)Nrf2結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因
[0029] (i)人工合成單鏈DNA片段I(78個(gè)堿基）；序列如SEQIDNo. 1，
[0030] 5 'CCCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCCAGTCACAGTGACT CAGCAGAATCGTAA3'
[0031] (ii)人工合成單鏈DNA片段II(86個(gè)堿基）；序列如SEQIDNo. 2，
[0032]