一種只有35bpfrt位點序列的重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域，可用于轉(zhuǎn)基因的定向插入和多基因的 定向疊加。更具體地講，本發(fā)明涉及一種含有35bpfrt特異性重組位點的表達載體，同時 涉及到含有frt特異性重組位點表達載體的構(gòu)建方法，以及該發(fā)明在植物轉(zhuǎn)基因和基因工 程中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母FLP/Frt位點特異性重組系統(tǒng)為雙組份系統(tǒng)，F(xiàn)LP重組酶是酵母2ym質(zhì)粒編 碼的特異性蛋白，可特異識別Frt位點DNA序列，F(xiàn)rt位點DNA序列包含長度為13bp的三個 重復(fù)單元，其中一個重復(fù)單元是其它兩個重復(fù)單元的反向重復(fù)，兩個反向重復(fù)單元間有8bp 的間隔序列，間隔序列的方向決定了Frt位點的方向（FutcherAB1988The2microncircle plasmidofSaccharomycescerevisiae.YeastAdT-A(X)c3FLP重組酶可與Frt位點三個重 復(fù)序列結(jié)合，并在間隔序列的邊界切割DNA，引起同一DNA分子上兩個Frt位點間的DNA片 段發(fā)生倒位或剔除（SenecoffJF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseofthe yeast2-micronplasmidcharacterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl. Acad.Sci. 82 :7270-7274.;AndrewsBJ，ProteauGA，BeattyLG，SadowskiPD1985The FLPrecombinaseofthe2microncircleDNAofyeast:interactionwithitstarget sequences.Cell40 :795-803.)，或者引起不同DNA分子上的DNA片段在Frt位點發(fā)生整合 (HuangLC，WoodEA，CoxMM1991Abacterialmodelsystemforchromosomaltargeting. NucleicAcidsResl9 :443-448.)D
[0003]在植物基因組中，引入的FLP/Frt位點特異性重組系統(tǒng)已被證實同樣能發(fā) 揮其功能，這些功能已在水稻和玉米（LyznikLA，MitchellJC，HiyaramaL，Hodges TK1993ActivityofyeastFLPrecombinaseinmaizeandriceprotoplasts.Nucleic AcidsRes21 :969-975.)、煙草（LloydAM，DavisRW1994Functionalexpressionofthe yeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGen Genet242 :653-657.)、擬南芥（KilbyNJ，DaviesGJ，SnaithMR，MurrayJAH1995FLP recombinaseintransgenicplants:constitutiveactivityinstablytransformed tobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ8 :637-652.) 等植物中進行了廣泛的驗證。
[0004] 為了提高植物轉(zhuǎn)基因安全性，可利用FLP/Frt位點特異性重組系統(tǒng)刪除植物基因 組中的外源選擇標記基因和報告基因。當(dāng)兩個Frt位點在同一DNA分子且方向相同時，F(xiàn)LP酶可將兩個Frt位點間的基因刪除。人們利用FLP/Frt重組系統(tǒng)已成功在煙草中刪除了抗 除草劑的乙酰乳酸合成酶als基因（單曉映，李蓓，張舉仁2006利用FLP/frt重組系統(tǒng)產(chǎn) 生無選擇標記的轉(zhuǎn)基因煙草植株.生物工程學(xué)報，22 :744-750.)、刪除了gus報告基因及 發(fā)狀根形成rolC基因（GidoniD，BarM，GilboaN2001FLP/FRT_mediatedrestoration of normal phenotypes and clonal sectors formation in rolC transgenic tobacco. Transgenic ResearchlO:317-328.)〇
[0005] 除了利用FLP/Frt重組系統(tǒng)刪除植物外源基因外，有時需要利用該系統(tǒng)進行外源 基因在受體植物基因組中進行定向疊加，達到在特定位點轉(zhuǎn)化多基因的目的，此時，就需要 構(gòu)建含單個Frt位點的載體。單個野生型Frt位點全長為48bp，F(xiàn)LP重組酶可與Frt位 點三個重復(fù)序列結(jié)合（FutcherAB1988The2microncircleplasmidofSaccharomyces cerevisiae.Yeast4 :27-40.)。已有充分的實驗證據(jù)表明，F(xiàn)rt位點只有8bp的間隔序列 及其兩側(cè)兩個反向重復(fù)序列時，F(xiàn)rt位點介導(dǎo)的重組效率沒有明顯的改變，甚至當(dāng)一個或兩 個反向重復(fù)遠離間隔序列的一端缺失3bp序列時依然具有幾乎同樣的重組效率（Senecoff JF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseoftheyeast2_micronplasmid： characterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl.Acad.Sci. 82 :7270-7274.)〇 據(jù)此，有學(xué)者已創(chuàng)建了截短的Frt位點，該位點長度39bp，包含I段8bp間隔序列、2段13bp 反向重復(fù)序列及與之相鄰的5bp保護序列（李蓓，單曉映，尹小燕，張舉仁2006單子葉植物 的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)的構(gòu)建.山東大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版）41:149-156.)。本發(fā)明 設(shè)計的frt位點包括1段Sbp間隔序列、1段Ilbp重復(fù)序列、1段13bp反向重復(fù)序列及與 之相鄰的3bp保護序列，Ilbp重復(fù)序列遠離間隔序列的一端去掉了 2bp的GA堿基，這樣的 Frt位點具有同樣的重組功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種可用于基因重組或基因疊加的含單個縮減的Frt 位點的表達載體，該載體含有無啟動子的綠色熒光蛋白（GFP)及可表達的(6-葡糖醛酸酶 (GUS)報告基因，此發(fā)明為未來進行植物多基因的遺傳轉(zhuǎn)化、定向重組或疊加奠定了基礎(chǔ)。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了 一種可用于基因重組或基因疊加的 pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos載體的構(gòu)建方法，方法簡便易行，試驗操作方便。
[0008] 本發(fā)明的再一個目的是在于提供了pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos表達載體 在油菜中的轉(zhuǎn)化方法和應(yīng)用。
[0009] -種只有35bpfrt位點序列的重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，包括以下步驟：
[0010] 質(zhì)粒PBI-GFP的構(gòu)建：利用BamHI和SacI內(nèi)切酶切除PBI121載體中的⑶S基因， 同時在GFP兩端加上BamHI和SacI酶切位點，再將GFP插入pBI121載體構(gòu)建成pBI-GFP 載體；
[0011] DNA片段Frt-GFP-Tnos的獲得：以Frtm-HindIII-GFP(5'-TGCAAGCTT AGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3' ）和 Tnos-HindIII-3'（5'-TGCAAGCTTCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3'）為一對引物，利用 LA-Taq酶擴增pBI-GFP，由于引物Frtm-HindIII-GFP含有Frt位點，通過PCR將Frt位點 加在GFP-Tnos之前，獲得Frt-GFP-Tnos片段。frtm代表了一種縮減的Frt位點，此位點只 包含了核心序列，具有完整Frt位點的作用；
[0012] 質(zhì)粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的構(gòu)建：將DNA片段Frt-GFP-Tnos插入 PBI121載體的HindIII位點，構(gòu)建含有Frt特異性重組位點的表達載體T18，T18的結(jié)構(gòu)為 pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明方法易行，操作方便，該載體在轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0014] 為了更清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將對本發(fā)明描述中所需要使用的附圖 作簡單地介紹。
[0015] 圖 1 片段Frt-GFP-Tnos的獲得，
[0016] 圖2表達載體T18和T20克隆的篩選，
[0017] 圖3陽性克隆的酶切鑒定，
[0018] 圖4Frt-GFP-Tnos片段在pBI121載體中的插入方向，
[0019] 圖5表達載體T18質(zhì)粒圖譜，
[0020] 圖6T18轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測，其中M:DL2000Marker;1-7 :轉(zhuǎn)基因植株；8 :質(zhì)粒 陽性對照，
[0021] 圖7frt位點重組功能驗證。
【具體實施方式】
[0022] 1材料與方法
[0023] I. 1試驗材料
[0024] I.I. 1供試油菜品種
[0025] 甘藍型油菜品種中油821，該品種油菜及其轉(zhuǎn)基因植株種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油 料作物研究所網(wǎng)室。
[0026] I. 1. 2 菌株
[0027] 大腸桿菌（Escherichiacoli)DH5a、農(nóng)桿菌菌株EHA105及LBA4404由本實驗室 保存。
[0028] I.L3 載體
[0029] pMD18-T載體；
[0030] pBI121，pBI-GFP載體。
[0031] 1.1. 4主要試劑
[0032] dNTP、TaqDNA聚合酶和LA-Taq酶；
[0033] 限制性內(nèi)切酶；
[0034] T4-DNA連接酶；
[0035] CTAB等；
[0036] 抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）；
[0037]PCR引物；
[0038] 測序；
[0039] 文中提及的其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
[0040] MS培養(yǎng)基配方：
[0041 ]
[0042] 以上溶液均配成IOOX的母液。
[0043]篩選培養(yǎng)基：MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+13mg/L卡 那霉素。
[0044] 生根培養(yǎng)基：MS+0. 2mg/LNAA+400