專利名稱：用于檢測含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的LSPR傳感芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于腫瘤細(xì)胞中質(zhì)粒DNA含量的檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的傳感芯片。
背景技術(shù)：
C-myc是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)DNA合成、細(xì)胞凋亡、分化及細(xì)胞周期的進(jìn)程中起重要作用。由C-myc基因編碼的C-myc重組蛋白不僅在細(xì)胞生命活動如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期中有極其重要的作用，而且還密切地參與了細(xì)胞腫瘤的轉(zhuǎn)化。C-myc重組蛋白的表達(dá)與很多癌組織和細(xì)胞腫瘤的啟動及癌性程度密切相關(guān)。目前針對質(zhì)粒DNA的檢測方法分別有水平瓊脂糖凝膠電泳法和傳統(tǒng)的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法，并沒有專門針對含致癌基因 C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的檢測裝置。上述方法操作繁瑣、精度低，僅能做到定性或半定量，且抗干擾性、選擇性不足，使其應(yīng)用受到限制。因此需要尋找一種能夠快速定量地檢測含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的裝置。本實(shí)用新型提供了一種基于金納米粒子的局域表面等離子體共振(LSPR)光譜技術(shù)的生物傳感檢測芯片，能簡便、快速、定量地檢測癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的 LSI^R芯片裝置。該裝置是一種基于金納米顆粒局域表面等離子體共振(LSPR)光譜技術(shù)的生物傳感檢測芯片。該芯片能實(shí)現(xiàn)操作簡便、定量快速、靈敏地檢測癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量。為解決上述問題，所述芯片的組裝結(jié)構(gòu)自基質(zhì)(聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃)表面到最外層依次為厚度均勻的金膜、DTT單分子層、金納米粒子層、3-巰基丙酸單分子層、 C-myc單克隆抗體，具體組裝過程如下采用磁控濺射鍍膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面鍍上一層金膜(30 300nm)，通過控制鍍膜真空度彡1. 0 X 10_3Pa，鍍膜速度彡1.0 A，使金膜表面平整光滑，形成金平板電極。然后將Piranha溶液(注Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金平板電極金膜表面浸潤5 30s，取出用二次蒸餾水反復(fù)沖洗3次處理后，將上述電極依次浸泡在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲5 600s。然后將上述電極浸入10 200mmol/L的1，4-二硫蘇糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 M h，可在金膜表面組裝上一層DTT單分子膜層。分別用無水乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，將上述電極浸入納米金溶膠溶液(粒徑大小為5 50nm)中放置1 Mh，這樣金納米粒子可通過Au-S鍵固定在金平板電極金膜表面形成金納米粒子層，用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，并保存于二次蒸餾水中[0007]將上述電極浸入0. 1 lOOmmol/L的3.巰基丙酸中，靜置1 24 h，可在金納米粒子層表面修飾上3-巰基丙酸單分子層；用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，滴加1 200mmol/ L DMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為4- 二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化1 30min，再分別用乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈。經(jīng)過DMAP-EDC活化，在上述電極上滴加0 2. 6 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應(yīng)3 600min后，使3-巰基丙酸與C-myc單克隆抗體鍵合，C-myc單克隆抗體的吸附量范圍為 0. 01 0. 4g-mr1 ·πιπΓ2 ；再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即得C-myc單克隆抗體修飾的Lsra傳感芯片。在測量過程中首先將LSra傳感芯片置于樣品工作臺上，在所述工作臺上有固定反射探針光纖的懸臂支架，所述反射探針光纖包含入射光纖和讀出光纖結(jié)構(gòu)，其中的一分支與碘鎢燈光源相連接，另一分支與光譜儀相連接；所述反射探針光纖可把所述光源產(chǎn)生的光傳輸?shù)絺鞲行酒?，并接收反射回的光信號至所述光譜儀，所述光譜儀再與計(jì)算機(jī)相連接，構(gòu)成一個信號識別系統(tǒng)。其檢測的原理如下所述當(dāng)入射光照射傳感芯片，入射光子頻率與金納米粒子上的自由電子的集體振動發(fā)生共振時(shí)，導(dǎo)致金納米粒子表面的局部電場被增強(qiáng)，反射光能量增強(qiáng)，從而展現(xiàn)出強(qiáng)烈的表面等離子體吸收，其局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之間。當(dāng) C-myc單克隆抗體與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA結(jié)合后，等離子體共振頻率變小，共振吸收峰向長波方向移動，該峰位移與待測含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量在6. 5X 10_3 1.3 μ g/mL范圍內(nèi)成線性響應(yīng)關(guān)系，檢測下限達(dá)到6. 5ng/mL，可實(shí)現(xiàn)在線動態(tài)監(jiān)測、快速定量檢測含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA分子的目的。同時(shí)，所述LSTO傳感芯片對癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量能進(jìn)行準(zhǔn)確測定，其回收率為92. 31 109. 23%。在癌癥疾病預(yù)測和治療等生物醫(yī)學(xué)方面具有非常重要的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本實(shí)用新型的有益效果是，與傳統(tǒng)的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)裝置相比，該LSI3R傳感裝置操作簡便，能實(shí)現(xiàn)快速、定量、靈敏地檢測癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量，在癌癥疾病預(yù)測和治療等生物醫(yī)學(xué)方面具有非常重要的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖1是LSra傳感芯片組裝結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是LSI3R傳感芯片組裝膜層直觀圖。圖3是基于金納米粒子的局域表面等離子體共振光譜檢測圖。圖4是傳感芯片的局域表面等離子共振吸收峰位移與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒 DNA的濃度的關(guān)系曲線圖，其在9.0X 10_3 μ g/mL 1.5 μ g/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4內(nèi)插圖)方程為Δ λ = 0. 00948+1. 38723C其中Δ λ表示為最大吸收峰位移值(nm)，C表示含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的濃度(μ g/mL)。上述關(guān)系曲線是在室溫25°C時(shí)繪制的。圖5是典型質(zhì)粒DNA的pCMV-myc片段堿基序列圖。
4[0019]圖6是標(biāo)尺為200nm的典型金納米粒子的TEM圖。圖7是標(biāo)尺為IOOnm的典型金納米粒子的TEM圖。圖1、2中1.厚度均勻的金膜，2. DTT單分子層，3.金納米粒子層，4. 3_巰基丙酸單分子層，5. C-myc單克隆抗體，6.含Ciyc抗原片段的質(zhì)粒DNA。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型通過固定于LSra傳感芯片上的c-myc單克隆抗體與含C_myC抗原片段的質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起芯片上金納米粒子層表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振光譜吸收峰的位移，與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA含量成線性響應(yīng)關(guān)系，從而達(dá)到含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的檢測目的。實(shí)施例1LSPR傳感芯片的組裝制備1)采用磁控濺射鍍膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面鍍上一層IOOnm 的金膜，通過控制鍍膜真空度為1.0 X 10_4Pa，鍍膜速度為1.0 A/S，使所述金膜表面平整光滑，形成金平板電極；2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金平板電極表面浸潤15s，取出后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗3次；3)將上述電極依次浸泡在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲60s ；4)將上述電極浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT單分子層，用無水乙醇反復(fù)沖洗3次以去除表面游離的DTT，再用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈；5)將上述電極浸入粒徑為10. 5nm的納米金溶膠中，放置Mh，取出后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，這樣金納米粒子通過Au-S鍵固定在金平板電極金膜表面形成金納米粒子層，然后保存于二次蒸餾水中備用；6)將上述電極浸入lOmmol/L的3-巰基丙酸中，靜置他，在金納米粒子上形成
3-巰基丙酸單分子層，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；7)用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，滴加lOOmmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為
4-二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化lOmin， 再分別用乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈；8)在上述電極上滴加2. 4μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應(yīng)60min后，再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即制得用于檢測含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片。實(shí)施例2含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定1)所用試劑(二次蒸餾水、PBS緩沖溶液)經(jīng)滅菌處理后均保存于4°C環(huán)境中備用；2)取1 μ L質(zhì)粒DNA置于1. 5mL小試管中，以PBS為緩沖溶液，分別稀釋1 100000 倍，配制成0 1. 5 μ g/mL的一系列溶液備用；3)采用上述C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片分別測試各濃度的質(zhì)粒DNA 樣品，通過C-myc單克隆抗體與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起芯片上金納米粒子局域表面等離子體共振光譜吸收峰紅移，該峰位移與質(zhì)粒DNA含量成線性響應(yīng)關(guān)系；以質(zhì)粒DNA的濃度C(yg/mL)為橫坐標(biāo)，最大吸收峰位移值Δ λ (nm)為縱坐標(biāo)，繪制測定質(zhì)粒DNA樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4內(nèi)插圖)，通過質(zhì)粒DNA對應(yīng)濃度的LSI3R吸收峰位移信號，即可測定出癌變組織樣品中的含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量；4)測試完后，用0. lmol/L HCl溶液洗脫回復(fù)，再分別用PBS緩沖溶液、二次蒸餾水沖洗干凈，可保存于4°C環(huán)境中備用。實(shí)施例3大腸桿菌中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA濃度的測定本實(shí)施例采用堿裂解法提取大腸桿菌中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA，具體操作方法如下1、取含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于aiil LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。2、加 0. Iml 溶液 1(1%葡萄糖，50mM/L EDTApH8. 0,25mM/L Tris-HCl pH8. 0)充分混合。加入0. 2ml溶液II (0. 2mM/L NaOH, 1 % SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。加入 0. 15ml預(yù)冷溶液III (5mol/L KAc, ρΗ4· 8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。3、以IOOOrpm離心20min，取上清液于另一新Ep管，再加入等體積的異戊醇，混勻后于0°C靜置lOmin，再以IOOOrpm離心20min，棄上清，用70% 7醇0. 5ml洗滌一次，抽干所有液體，待沉淀干燥后，溶于0. 05mlTE緩沖液中。4、將上述處理好的質(zhì)粒DNA待測液滴在傳感芯片表面反應(yīng)Imin后用二次蒸餾水沖洗。再次記錄讀數(shù)。每個吸收峰響應(yīng)值(Δ λ，nm)可由下式得出Δ λ = λ 1-λ2，把 Δ λ代入到圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可算出待測液中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的濃度值，檢測結(jié)果表明該傳感芯片檢測裝置可以用于質(zhì)粒DNA含量快速、準(zhǔn)確的檢測。實(shí)施例4回收率的測定本實(shí)施例測定質(zhì)粒DNA傳感芯片對響應(yīng)不同濃度質(zhì)粒DNA溶液的回收率，并與傳統(tǒng)生物學(xué)上的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)裝置進(jìn)行比較。 在已知濃度溶液中加入已知量的含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA樣品溶液(300ng/mL、500ng/ mL和1800ng/mL)，然后測定各樣品的吸收峰，計(jì)算位移值Δ λ，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線找出濃度，比較測得的加入量和實(shí)際加入量，獲得的回收率分別為93. 33%U06. 00%和101. 67%，平均回收率為100. 33%，而ChIP裝置僅能做出定性檢測，說明本實(shí)用新型優(yōu)于ChIP裝置，且回收率好，在含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA檢測方面具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例5重現(xiàn)性的測定在上述的傳感芯片上，固定C-myc單克隆抗體的傳感膜對響應(yīng)不同濃度的質(zhì)粒 DNA溶液的出峰位置的重現(xiàn)性，本實(shí)施例測定LSra傳感芯片對響應(yīng)不同濃度含c-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA溶液的吸收峰位置的重現(xiàn)性，對0.6 μ g/mL和1.5yg/mL樣品重復(fù)測定12次，通過對數(shù)據(jù)的分析處理，獲得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3. 70%和1.08%，說明該方法有著良好的重現(xiàn)性，確保了所測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求1.一種用于檢測含致癌基因c-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的LSTO傳感芯片，其特征在于所述芯片的組裝結(jié)構(gòu)自聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面到最外層依次為厚度均勻的金膜(1)、DTT單分子層O)、金納米粒子層(3)、3_巰基丙酸單分子層(4)、C-myc單克隆抗體(5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述金膜(1)的厚度為30 300nmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述金納米粒子的粒徑范圍為 5 50nmo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LSra傳感芯片，其特征在于所述C-myc單克隆抗體(5)的吸附量范圍為 0. 01 0. 4g · ml/1 · mm_2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LSra傳感芯片，其特征在于所述金納米粒子層(3)表面所展現(xiàn)的局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之間。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的LSPR傳感芯片，即一種基于金納米顆粒的局域表面等離子體共振(LSPR)光譜技術(shù)的生物傳感檢測芯片，所述芯片的組裝結(jié)構(gòu)自聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面到最外層依次為厚度均勻的金膜(1)、DTT單分子層(2)、金納米粒子層(3)、3-巰基丙酸單分子層(4)、C-myc單克隆抗體(5)，通過已固定于LSPR傳感芯片上的C-myc單克隆抗體(5)與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的免疫結(jié)合反應(yīng)達(dá)到檢測的目的。該芯片能實(shí)現(xiàn)操作簡便、定量快速、靈敏地檢測癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的含量，優(yōu)于傳統(tǒng)的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)裝置，在癌癥疾病預(yù)測和治療等生物醫(yī)學(xué)方面具有非常重要的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號G01N33/577GK202033369SQ20112000010
公開日2011年11月9日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者何婧琳, 孫立賢, 張玲, 戴云林, 曹忠, 曾巨瀾, 王明星, 黃茜茜 申請人:長沙理工大學(xué)